CC BY
33
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
ПЕРВИЧНЫЕ ИММУНОДЕФИЦИТЫ
Первичные иммунодефициты Primary immunodeficiencies
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛ ДНК ТREC И KREC В ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА
Дробышевская В.Г.1, 2, Любимова Н.Е.1, Семенов А.В.1, 2, Тотолян Арег А. 1 2
1 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия
2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Первичные иммунодефициты — это большая группа заболеваний, связанных с разнообразными врожденными генетическими нарушениями механизмов иммунной защиты организма, что приводит к развитию тяжелых хронических инфекций и часто к смерти или инвалидизации в раннем возрасте за счет формирования необратимых изменений в органах и тканях. По статистике, на первом месте среди первичных иммуно-дефицитов находятся гуморальные дефекты (61%), на втором месте — комбинированные иммунодефицитные состояния (18%). (Ярцев М.Н., и соавт., 2006). Данные группы иммунодефицитов характеризуются полным или частичным отсутствием T- и/или B-клеток, или ослаблением функций этих клеток. В связи с чем особый научный интерес представляет исследование содержания у людей Т-рецепторных эксцизионных колец — TREC (T-cell receptor excision circles) и B-клеточных эксцизионных колец — KREC (kappa-deleting recombination excision circles). TREC формируются в процессе V(D) J-реарранжировки, когда часть генетического материала вырезается и замыкается в кольцо. TREC служат маркерами созревания Т-клеток, недавно эмигрировавших из тимуса и слабо вовлекавшихся в процесс пролиферации или не делившихся совсем. В ходе пролиферации клеток иммунной системы эксцизионные кольца остаются в одной из дочерних клеток, что позволяет использовать их определение как показатель пролиферации лимфоцитов и суррогатный маркер нормального развития иммунной системы. Аналогично образуются KREC (kappa-deleting recombination excision circles) — B-клеточные эксцизион-ные кольца. Содержание KREC в периферической крови является также суррогатным маркером эффективности развития B-клеточного звена иммунной системы в процессе эмбриогенеза. Определение TREC и KREC можно применять для ранней диагностики иммунодефицитных состояний (van Zelm et al., 2011).
Цели и задачи. 1. Отработка наиболее удобной для практического применения в скрининговом режиме методики выделения ДНК из образцов доноров.
2. Валидация методики количественного определения молекул ДНК TREC и KR.EC с помощью ПЦР в режиме реального времени.
3. Популяционный анализ концентрации TREC и KREC в крови условно здоровых новорожденных С.Петербурга.
Материалы и методы. В настоящем исследовании использовалась пуповинная кровь новорождённых. Образцы крови до обследования были заморожены и хранились при -80 °С. Выделение ДНК из клеток крови осуществляли ручным методом на наборе для выделения ДНК/РНК «Рибо-Преп» (ИнтерЛабСервис, РФ) согласно инструкции фирмы-производителя и с небольшими модификациями. Для определения количества TREC и KREC использовали российскую тест-систему, предоставленную Институтом химической биологии и фундаментальной медицины подробно описанной в (Медицинская иммунология, 2015. Т. 17, № 5. С. 467-478). Интерпретацию полученных результатов проводили, согласно рекомендациям разработчика. Статистический анализ осуществляли с использованием программы GraphPad Prizm 5.0
Результаты и обсуждение. В нашем случае проанализированы образцы пуповинной крови 157 новорождённых — 79 девочек и 78 мальчиков. Концентрация TREC составила от 10762 до 121068 копий/105 лимфоцитов. Среднее значение TREC 29945±1412 копий/105 лимфоцитов. Концентрация KR.EC составила от 10550 до 89533 копий/105 лимфоцитов, среднее 36199±1347 копий/105 лимфоцитов. Достоверных межполовых различий концентрации TREC и KREC выявлено не было, что совпадает с литературными данными (Хие-Цод Ои е! а1., 2012; До-нецкова А.Д. и др., 2014; Гордукова и др., 2015).
Заключение. Определение количества TREC успешно используется в разных скрининговых программах новорождённых на выявление иммунодефицитов (СЫапш е! а1., 2013; Клап е! а1., 2014). Возможность определения количества KREC для диагностики гуморальных дефектов иммунной системы так же показано в ряде зарубежных и отечественных исследований. Для установления более точного диапазона референтных величин и формулировки возможных рекомендаций использования тест-системы в широкой практике национальной программы скрининга новорожденных требуются дальнейшие эксперименты.
СОДЕРЖАНИЕ TNFa, ^N7, ^-4 И ^-10 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ТРАНЗИТОРНОЙ ГИПОГАММАГЛОБУЛИНЕМИЕЙ
Климов А.В., Климов В.В., Деев И.А.
Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
Транзиторная гипогаммаглобулинемия детского возраста (ТГД), относительно доброкачественная форма первичного иммунодефицита, характеризуется задержкой становления синтеза IgG, а иногда и снижением ^М
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
и IgA у детей в возрасте старше 6 месяцев до 2-6 лет. Молекулярные аномалии в основе ТГД до настоящего времени не выявлены. Возможно, что в связи со снижением экспрессии части корецепторного комплекса В-клеток (CD19) при сохранении другой части (CD21 и CD81) после распознавания антигенов через BCR первоначально нарушается активация В-клеток, а в последующем — переключение синтеза IgM на продукцию IgG (Artac et al., 2013). Однако этот процесс при ТГД является преходящим и нивелируется с возрастом. В настоящее время описаны немногочисленные данные по функционированию клеток, вовлечённых в иммунорегуляцию, а также цито-кинов и хемокинов при ТГД.
Цель. Определение содержания TNFa, IFNy, IL-4 и IL-10 в сыворотке крови у детей с транзиторной гипо-гаммаглобулинемией.
Проведено клиническое наблюдение и обследовано 14 детей в возрасте от 6 месяцев до 4 лет, страдающих рецидивирующими пиогенными инфекциями, у которых были снижены сывороточные иммуноглобулины ниже диагностических критериев: IgG < 5 г/л, IgM < 0,4 г/л, IgA < 0,2 г/л. У данных детей были исключены другие, тяжелые формы первичных иммунодефицитов. Группу сравнения составили 24 ребенка того же возраста, страдающих повторными респираторными инфекциями, без доказанного первичного иммунодефицитного состояния. Все исследования проводились в периоде ремиссии инфекций. В контрольную группу вошли 16 здоровых детей того же возраста.
В результате исследований отмечено достоверное повышение при ТГД по сравнению с группой сравнения и здоровыми детьми содержания TNFa и IL-10. Концентрации всех остальных цитокинов не менялись, включая группу сравнения по отношению к контрольной группе.
На первый взгляд полученные данные являются парадоксальными, т.к. у детей с ТГД найдено повышение одного из потенциальных провоспалительных цитокинов с системным действием (TNFa) и одновременно одного из основных иммуносупрессивных цитокинов (IL-10).
В одной из ранних работ Kowalczyk и соавт. (1997) продемонстрировали повышение TNFa, TNFß и IL-10 в крови детей с ТГД in vivo, а также снижение продукции IgG и IgA В-клетками в условиях стимуляции митоге-ном лаконоса при добавлении TNFa и TNFß in vitro. Это не исключает ингибирующего действия TNFa и TNFß на антителопродукцию при ТГД. IL-10 является одним из цитокинов nTreg, и его повышение может косвенно свидетельствовать об увеличенной активности этих клеток при ТГД. Такая интерпретация нашла подтверждение в исследованиях Rutkowska и соавт. (2013), которые определили существенное увеличение количества nTreg (CD4+CD25hiPoxP3+) в крови детей с ТГД.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОГО АНГИОНЕВРОТИЧЕСКОГО ОТЕКА
Махарова М.А.1, 2, Останкова Ю.В.1, Чурина М.А.1, Кузнецова Р.Н.1, 3, Семенов А.В.1, 3
1ФБУН«Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург, Россия
2 ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», Санкт-Петербург, Россия
3 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Наследственный ангионевротический отёк (НАО) — заболевание, относящееся к группе первичных
иммунодефицитов, связанное с генетически детерминированным дефектом гена, кодирующего С1-ингибитор системы комплемента (C1-INH). Несмотря на низкую частоту, это заболевание представляет серьезную проблему в практической медицине. Этиопатогенетическая структура отечного синдрома чрезвычайно вариабельна и имеет полиморфный генез. Это приводит к постановке неправильного диагноза и назначение неадекватной для данного заболевания терапии, что и является причиной высокой смертности пациентов с НАО. Ген SERPING1 Локализован в 11 хромосоме (11q11-q13.1), имеет протяженность 17 тысяч п.о. и содержит 8 экзонов, где на данный момент (согласно базе данных ClinVar) описаны около 50 мутаций, ассоциированных с НАО. Заболевание не только приводит к существенному снижению качества жизни пациентов, но и является жизнеугрожающим. Только установленный вовремя диагноз и соответствующая терапия позволяют говорить об относительно благоприятном прогнозе. Очевидна значимость своевременного определения НАО у пациентов.
Цель и задачи. Апробация молекулярно-генетическо-го метода диагностики НАО 1 и 2 типов.
Материалы и методы. Материалом служила цельная кровь здоровых людей, а также образец крови пациента Т. предположительно больного НАО. Предварительный диагноз был поставлен на основании ряда симптомов и показаниям лабораторных исследований (концентрация С1-ингибитора в пределах нормы, активность < 60% от нормы). Геномную ДНК выделяли с помощью тест-системы «Ампли-Прайм Рибо-преп» (ФБУН ЦНИИЭ). Нуклеотидные последовательности 8-ми экзонно-про-моторных областей гена SERPING1 длиной 140-600 нт определяли с помощью прямого секвенирования фрагментов. При этом после проведения ПЦР с экзон-спец-ифичными праймерами производилось очищение продуктов реакции и определение концентрации спектрофо-тометрическим методом на Quantus fluorometer (Promega, США). Очищенные фрагменты использовали для постановки секвенирующих реакций с прямого и обратного праймеров. Для анализа продукта секвенирующей реакции очищенный осадок растворяли в формамиде и помещали в генетический анализатор ABIPRISM 3500 (AppliedBiosystems, США). Обработка и анализ последовательностей проводились в программе Contig Express пакета VectorNTI 10 Advance (Invitrogen, США).
Результаты. Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности в 2 случаях (здоровые люди) не имели особенностей, а в 1 случае была выявлена гетерозиготная точечная миссенс-мутация G- > A 57.614.516 (rs4926), приводящая к замене аминокислоты Val480Met. В базе данных ClinVar данная мутация имеет статус не патологичной, что сопровождается 3мя клиническими подтверждениями. Полученные нами результаты не противоречат этим данным, так как пациента Т. беспокоили рецидивирующие отеки конечностей и лица, однако тяжелых патологических состояний не наблюдалось. Не стоит исключать, что такая полиморфная форма белка в сочетании с другими нарушениями элементов системы комплемента может являться причиной описанных клинических проявлений и снижения активности С1-ингибитора. Этот случай только доказывает важность генетического анализа как гена С1-ингибитора, так и других ключевых белков системы комплемента при постановке диагноза.
