CC BY
122
и качественных признаков с помощью математико-статистических методов. - М. : ВНИИТЭИСХ, 1973. - С. 40 - 44.
8. Сурин, Н. А. Использование критериев адаптивности при оценке новых сортов зерновых культур в системе государственного сортоиспытания / Н. А. Сурин, О. Г. Михарева / Проблемы опустынивания и защита биологического разнообразия природно-хозяйственных комплексов аридных регионов России: сб. междунар. науч.-практ. конф. - М. : Совр. тетради, 2003. - С. 127 - 132.
9. Методика государственного сортоиспытания сельскохозяйственный культур. Вып. 1 Общая часть; под ред. М.А. Фе-дина. - М.: Агропромиздат, 1985. - 269 с.
10. Коптик, И. К. Сортовой состав озимой пшеницы в Республике Беларусь / И. К. Коптик, Е. В. Вьюнкова, Т. Д. Карпович / Земляробства i ахова раслш. - 2004. - № 4. - С. 10 - 12.
11. Кочурко, В. И. Приемы формирования высоких урожаев озимого тритикале и пшеницы в условиях северовосточной части Белоруссии / В. И. Кочурко / Проблемы производства продукции растениеводства и пути их решения: материалы научн.-практ. конф., посвящ. 160-летию БГСХА, Горки, 7-9 июня 2000 г. - Горки : БГСХА, 1990. - Ч. 1. - С. 50 - 53.
12. Технология производства и качество продовольственного зерна / Э. М. Мухаметов [и др.]. - Минск, 1996. - 256 с.
УДК 633.3:658.562
И. В. КУЗНЕЦОВА
СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ЛИСТЬЯХ СТЕВИИ (STEVIA REBA UDIANA BERTONI) СУШЕНОЙ И УСТАНОВЛЕНИЕ ИХ РОЛИ
(Поступила в редакцию 23.01.2014)
Представлен анализ роли свободных аминокислот в We have presented the analysis of the role of free amino ac-
развитии растения, а также их значение в нормальном ids in the development of a plant, as well as its importance
функционировании человеческого организма. Установлено for normal functioning of human organism. We have deter-
содержание свободных аминокислот в листьях стевии, mined the content of free amino acids in the leaves of stevia,
показана перспективность, согласно установленным shown their prospects according to norm values established
ФАО/ВООЗ нормированным значениям, и степень их из- by FAO/WHO and the degree of their extraction in the pro-
влечения в производстве одного из основных продуктов duction of one of the main products of leaves processing - the
переработки - концентрата. concentrate.
Введение
Исследования состояния рынка натуральных заменителей сахара в мире показывают перспективность стевии как богатого источника сладких веществ. По данным Nielsen (США), реализация натуральных заменителей сахара, полученных из листьев стевии, в 2010 г. составляла 809 млн. дол. США, что на 357 млн. дол. США больше, чем в 2009 г. Однако рассматриваются и другие возможности листьев стевии при производстве пищевых продуктов. Только в США с использованием концентрата, полученного из листьев стевии, было произведено более 38 наименований пищевых продуктов. Наибольший спрос имели концентраты, полученные из листьев стевии, в 35 странах мира в 2010 г. (3,5 тыс. тонн или 875 тыс. тонн wse), общая сумма реализации составляла 285 млн. доларов США. Согласно прогнозам мировых аналитиков, в 2014 г. потребность в продуктах переработки листьев стевии будет составлять на уровне 11 тыс. тонн (2,75 млн. тонн wse), что увеличит их производство в 3 раза в сравнении с полученным урожаем в 2010 г. [9].
В Украине направление производства стевии только развивается. Имея хорошие агроклиматические условия, в нашей стране можно собирать 2, а иногда и 3 урожая в год. Несмотря на необходимость в низкокалорийных веществах для людей больных разными формами сахарного диабета, листья стевии, как и продукты ее переработки, не нашли еще должного использования. Раскрытие новых возможностей листьев стевии позволит значительно расширить ассортимент пищевых продуктов и повысить на нее спрос. Одним из перспективных направлений является использование свободных аминокислот листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) сушенной. Содержание свободных аминокислот в растениях непостоянно и зависит от условий выращивания. Установлено, что при недостаточном содержания азота и молибдена в грунте количество свободных аминокислот в наземной части значительно снижается [13].
Анализ источников
Аминокислоты - основной материал для синтеза белков, ферментов, нуклеиновых кислот, пептидных гормонов, органических кислот, витаминов и других физиологически активных соединений. Участие углерода в обмене азотосодержащих веществ генетически предопределено, что обусловливает количественный состав свободных аминокислот растений [5; 13]. В настоящее время из растительных источников выделено более 300 свободных аминокислот и продуктов их метаболизма. Осо-
бое значение имеют свободные аминокислоты в биосинтезе веществ дитерпеновых веществ, в результате образования мевалоновай кислоты при распаде лейцина [10]. Согласно данным [4], в биосинтезе веществ дитерпеновых гликозидов принимают также участие ароматические (фенилаланин, тирозин) и с разветвленной углеводной цепью (валин, изолейцин, лейцин) аминокислоты.
Обладая широким диапазоном фармакологического действия, аминокислоты могут также придавать микроэлементам и другим веществам фармакологически безвредную и легко усвояемую форму, одновременно увеличивая их эффект. Многие аминокислоты обладают положительным фармакологическим действием и применяются в качестве лекарственных средств: участвуют в процессах нервной регуляции различных функций организма и влияют на сосудистый тонус. Изучению свойств и влиянию на организм человека свободных аминокислот посвящены работы В. Л. Кретовича, А. Я. Бунина, Ю. Ф. Майчука; С. Коппи, М. Д. Машковского, Л. В. Метлицкого и других.
Часть аминокислот синтезируются в организме человека (а-аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, глютамин, глютаминовая кислота, пролин, серин, тирозин, аргинин, гистидин, цисте-ин), а остальные (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин) не синтезируются, поступают с пищей и относятся к незаменимым аминокислотам [13]. Каждая аминокислота имеет свое значение для человеческого организма, например [12]: глютаминовая кислота -участвует в белковом и углеводном обмене ацетилхолина, аденазинтрифосфата и переносе иона калия; аспарагиновая кислота улучшает коллатеральное сердечное кровообращение, сердечнососудистый тонус, а также потенцирует действие микроэлементов ^е, Си, 2п и др.); метионин участвует в синтезе адреналина, креатина и других биологически важных соединений, активирует действие витаминов (аскорбиновой, фолиевой кислоты и др.), гормонов, ферментов; глицин улучшает метаболические процессы в ткани мозга при гипоксиях и аритмиях, при железодефицитных анемиях, атеросклерозах; гистидин применяется при гепатитах, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки; цистеин применяется при глазных болезнях, катаракте, просветлении хрусталика.
Методы исследования
В исследованиях использовали стевию (Stevia rebaudiana ВеНот), выращенную на опытном участке Агрофирмы «Весилиновка» (Киевская область, Украина). Выращивание стевии проводили с 2012 по 2013 гг. За основу взята Методика сортоиспытания сельскохозяйственных культур под ред. акад. ВАСХНИЛ Д. Д. Брежнева и др. В 2012 г. выращенную из семян 2-месячную рассаду высаживали в I декаде июня на трех опытных участках по схеме посадки 70^18 (80 тыс. шт./га), 70^16 (100 тыс. шт./га), 70x12 (120 тыс. шт./га). После сбора урожая в октябре 2012 г. корни выкапывали на зиму и сохраняли в подвале до весны. Лучшую корневую систему имели корни стевии, выращенные при схеме посадки 70x18 и 70x16. В апреле 2013 г. высаживали корни стевии в грунт и поливали, разделив опытный участок на две части по схеме высадки 70x18 и 70х 16. В первой декаде июля сте-вия на двух опытных участках имела высоту растения 50-55 см с начальной фазой бутонизации. Провели сбор наземной части, промыли проточной водой и высушили при температуре 28-32°С на протяжении 7 дней до достижения граничного содержания массовой части влаги в листьях стевии 7,1%. Высушивание стевии проводили в теплице на перфорированных полках с постоянным проветриванием. Разделяли сухие листья стевии от стебля. Листья фасовали в картонные гофрированные ящики для хранения. Отбор пробы для анализа на содержание свободных аминокислот в сухом листке стевии проводили согласно Общей фармакопейной статье ГФ XI [1].
Содержание белка определяли согласно ДСТУ 7169:2010 [6]. Свободные аминокислоты определяли по общепринятой методике [11] с некоторыми изменениями [1]: сухие листья стевии измельчили до размера частицы меньше 0,6 мм. Поместили в пробирку 40 г порошка, полученного из сухих листьев стевии, и добавили 4 мл 6 н соляной кислоты (НС1), после чего запаяли пробирку аргоном. Гидролиз порошка провели при температуре 110 °С в термостате на протяжении 24 часов. Полученный гидролизат высушили до получения сухого остатка и развели буферным раствором (рН 2,2). Полученный образец анализировали.
На содержание свободных аминокислот исследовали также водную вытяжку полученную из листьев стевии (экстракт). Экстракцию проводили в соотношении сырье: дистиллированная вода как 1:5 на протяжении 1 часа при температуре 65 °С. Полученный экстракт разводили дистиллированной водой в 2,5 раза. Для удаления растворимого белка к 4 об. частям экстракта добавили 1 об. часть 10 % сульфасалициловой кислотой (СЦК) и выдерживали 30 мин. в холодном месте. Деструктивный белок отделяли центрифугированием и очищенный образец анализировали.
Хроматограммы свободных аминокислот получили с помощью мультиспектра - 4.1, по которому, исходя из площадей пиков, рассчитали содержание свободных аминокислот. Для идентификации
аминокислот использовали стандартные образцы аминокислот: аспарагиновая кислота (асп), глута-миновая кислота (глу), серин (сер), глицин (гли), гистидин (гис), аргинин (арг), треонин (тре), аланин (ала), пролин (про), тирозин (тир), валин (вал), лизин (лиз), изолейцин (иле), лейцин (лей), фенилала-нин (фен), метионин (мет).
Основная часть. Стевия ^вУ1а гвЬа^1апа ВвгЮт) практически не изучена как с агрономической, так и с физиологической и биохимической сторон. Учитывая также, что аминокислоты имеют значение не только в биосинтезе веществ дитерпеновых гликозидов и определенную роль для организма человека, провели исследование по определению аминокислотного состава листьев стевии и оценили ценность листка для человека.
Известно, что аминокислоты имеют значительное влияние на компонентный состав листьев сте-вии. Растения осуществляют первичный синтез белка и служат основным источником белкового питания. Установлено, что листья стевии содержат 8 % белка. Согласно требованиям, установленным в странах Европейского союза, максимальное содержание белка в листьях стевии 16 % [8]. В биосинтезе аминокислот во время выращивания культуры играет роль содержание аммиака, которое изменяется в зависимости от его содержания в грунте, и соответственно, от внесенного удобрения с содержанием азота. Например, в варианте удобрения грунта под плантациями стевии Кб0Рб0Кб0 наблюдалось отсутствие метионина при очень низком содержании его в двух других вариантах - 0,1 % от суммы [2]. Общее содержание аминокислот не изменялось при внесении небольшого количества удобрений и возрастало на 70 % при повышенном содержании калия [2].
Хроматограмма содержания свободных аминокислот в листьях представлена на рис. 1 и показывает присутствие 17 свободных аминокислот в листьях стевии. Согласно полученным данным хрома-тографического анализа, содержание аммиака составляло 0,45 г/100 г СВ, что показывает возможность дальнейшего накопления аминокислот при продолжении вегетативного роста. Однако после срезания наземной части данный процесс остановлен.
Рис. 1. Хроматограмма гидролиза листьев стевии
Больший интерес представляет содержание лейцина, поскольку именно данная аминокислота в основном влияет на накопление в процессе выращивания веществ дитерпеновых гликозидов. Полученные данные в результате анализа листьев стевии доказывают, что лейцина содержится в количестве 1,77 г/100 г СВ или 7,92 % от общей суммы аминокислот. Значение также имеет содержание ас-парагиновой кислоты (2,11 г/100 г СВ), предшественника лизина и донора аминогрупп в биосинтезе заменимых аминокислот.
Фенилаланин и тирозин являются исходным соединением в растениях для биосинтеза веществ флавоноидного комплекса [7]. Содержание в листьях стевии фенилаланин составляет 1,37 г/100 г СВ и тирозина - 0,66 г/100 г СВ. Значительное содержание данных аминокислот показывает, что стевия имеет все необходимые условии для биосинтеза веществ флаваноидного комплекса.
Наибольший интерес для организма человека представляют незаменимые аминокислоты. В ходе эволюции человек утратил способность синтезировать углеродные цепи некоторых кетокислот, соответствующих незаменимым аминокислотам [с. 18, 13]. Тирозин образуется непосредственно из фени-лаланина и цистеина, в синтезе которого участвует сера метионина. Продовольственной и сельскохо-
зяйственной организацией (ФАО) и Всемирной организацией здравоохранения (ВООЗ) установлены нормированные значения незаменимых аминокислот, необходимых в дневном рационе человека [3], согласно которым общая сумма незаменимых аминокислот составляет 3,62 г/100 г СВ. Листья стевии сушеные содержат в нашем случае 10 г/100 г СВ (табл. 1).
Таблица 1. Содержание незаменимых аминокислот, г/100 г СВ
Аминокислота Нормированное значение (ФАО/ВООЗ) Листья стевии Разница (+/-)
Валин 0,35 1,15 0,80
Метионин 0,25 1,08 0,83
Изолейцин 0,28 1,14 0,86
Лейцин 0,66 1,77 1,11
Треонин 0,34 1,07 0,73
Фенилаланин 0,63 1,37 0,74
Гистидин 0,18 0,13 -0,05
Лизин 0,58 1,08 0,50
Аргинин 0,35 1,23 0,88
Всего 3,62 10,0 6,38
Полученные данные (табл. 1) показывают превышение нормированного значения необходимого для повседневного употребления человеком незаменимых аминокислот. Из 9 незаменимых аминокислот наблюдается превышение содержания по 8: треонин - 3,14 раза, валин - 3,3 раза, метионин - 4,32 раза, изолейцин - 2,7 раза, фенилаланин - 2,14 раза, лизин - 1,9 раза и аргинин - 3,5 раза. Это показывает прежде всего богатый потенциал листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) сушеной на свободные аминокислоты. Лизин - аминокислота, которая ограничивает питательную ценность многих растительных белков и, согласно полученным результатам, его содержание превышает в 2 раза установленное нормированное значение.
Наиболее востребованным становится концентрат, полученный из листьев стевии. Прежде всего это удобная форма биологически ценных веществ для использования в пищевой промышленности. Остается неизученным вопрос о степени извлечения аминокислот из листьев стевии. Результаты анализа экстракта, полученного из листьев стевии на содержание свободных аминокислот, представлены на рис. 2.
Сигнал, мВ
80 -70 J 60 -50 -40 -30 -20 -10 -
0 --10 J
Рис. 2. Хроматограмма экстракта, полученного из листьев стевии
Полученные результаты сравнили с ранее определенным содержанием аминокислот в листьях стевии (табл. 2) и установили, что в процессе экстракции извлекается только 17,34 % от общего содержания аминокислот. Наиболее полно (59-91,5 %) извлекается из листьев серин.
Время, мин.
Аминокислота Листья стевии Экстракт Разница (+/-)
Аспарагиновая кислота 2,11 0,12 1,99
Тирозин 0,66 0,04 0,62
Серин 1,18 1,08 0,10
Глутаминовая кислота 3,61 0,16 3,45
Пролин 2,39 1,41 0,98
Глицин 1,14 0,03 1,11
Алании 1,23 0,06 1,17
Валин 1,15 0,20 0,95
Метионин 1,08 - 1,08
Изолейцин 1,14 0,16 0,98
Лейцин 1,77 0,13 1,64
Треонин 1,07 0,10 0,97
Фенилаланин 1,37 0,14 1,23
Гистидин 0,13 0,11 0,02
Лизин 1,08 0,04 1,04
Аргинин 1,23 0,11 1,12
Всего 22,34 3,89 18,45
Необходимо отметить, что при водной экстракции листьев стевии не обеспечивается в полной мере извлечение аминокислот. Большая часть необходимых для организма человека аминокислот остается в листьях. Такой результат может говорить о необходимости углубленной переработки листьев стевии, одним из вариантов которой может служить внедрение технологий извлечения аминокислот из листьев стевии после экстракции.
Заключение
Листья стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) сушенной обладают богатым аминокислотным потенциалом, что имеет положительное значение как в биосинтезе, так и для нормального функционировании человеческого организма. В результате хроматографического анализа идентифицировано 17 аминокислот, из них 9 незаменимых и 8 заменимых. Общее количество аминокислот в листьях составляет 22,34 г/100 г СВ. Листья стевии содержат 8 незаменимых аминокислот в большем количестве, чем установлено нормами ФАО/ВООЗ по содержанию аминокислот для организма человека: треонин -3,14 раза, валин - 3,3 раза, метионин - 4,32 раза, изолейцин - 2,7 раза, фенилаланин - 2,14 раза, лизин
- 1,9 раза и аргинин - 3,5 раза. В процессе экстракции извлекается только 17,34 % от общего содержания аминокислот, из которых наиболее полно извлекаются из листьев: серин (91,5 %), пролин (59%) и гистидин (84,6%). Метионин при экстракции листьев практически не извлекается.
ЛИТЕРАТУРА
I. Abou-Arab A.E., Abou-Arab A.A., Abou-Salem M.F. Physic-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana bertroni plant. A.J. of Food Science 4(5), 2010, p. 269-281.
2. Аминокислотный состав листьев стевии. - [Электронный ресурс]. -Режим доступа: WWW.STEVIA.NET.UA/2007/11/15AMINIKISLOTNYJ-SOSTAV-LISTEV-STEVII/ - Дата доступа: 15.01.2014.
3. AO, WHO (1985) Food and Agriculture Organization of The United Nations L. World Health Organization Energy and Protein Requirements. Reports a Joint FAO/WHO Export Consolation. Technical Report Series No.724.
4. Гудаин, Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудаин, Э. Марсер. - М.: Мир, 1986. - Т.2. - 312 с.
5. Измайлов, С. Ф. Азотный обмен в растениях / С. Ф. Измайлов. - М.: из-во «Наука», 1986. - 370 с.
6. «Корми, комбжорми, комбжормова сировина. Методи визначення вмюту азоту i сирого протешу»: ДСТУ 7169:2010.
- [Чинний вщ 01.07.2011 р.]. - К.: Держспоживстандарт Украши, 2010. - 14 с.
7. Кретович, В. Л. Биохимия растений / В. Л. Кретович. - М.: Высш. шк. 1986. - 503 с.
8. Кузнецова, I. В. Бюлопчна цгншсть стеви як сировини для виробництва концентра™ / I. В. Кузнецова // Новггш технологи вирощування сшьськогосподарських культур: Зб. наук. пр. / за ред. акад. НААН Рожа М.В. -К., 2012. Вип. 14 -С. 465-468.
9. Market Evaluation Consumption and Alternative Sweeteners Statistics Committee in a Higher Sugar Price Environment International Sugar Organization 42 MECAS(12)04.
10. Либберт, Э. Физиология растений / Э. Либберт. - М.: Мир, 1976. -314 с.
II. Плешков, Б. П. Практикум по биохимии растений / Б. П. Плешков. - М.: из-во «Колос». 1976. - 255 с.
12. Шамсизаде, Л. А. Состав и содержание свободных аминокислот в плодах некоторых лекарственных плодово-ягодных растений / Л. А. Шамсизаде, Э. Н. Новрузов, АМЕА-нын Хябярляри. - М., 2011. - Т.66. - С. 112-119.
13. Якубке, Х. - Д. Аминокислоты, Пептиды. Белки / Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт. - М.: из-во «Мир». 1985. - 82 с.
