CC BY
62
УДК 574.24
А.В. Фетисова
аспирант, кафедра аналитической химии химического факультета, ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
С.А. Иларионов
д-р биол. наук, профессор, кафедра аналитической химии
химического факультета, ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE, РАСТУЩИХ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ МЕДИ
Аннотация. Аминокислоты играют важную роль в различных физиологических процессах, в том числе -в адаптации организмов к действию соединений тяжелых металлов. Проведено исследование влияния различных концентраций меди на рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Определено содержание свободных аминокислот в культуральной среде микроорганизмов, растущих при различных количествах металла в ней.
Ключевые слова: аминокислоты, медь, Saccharomyces cerevisiae.
A. V. Fetisova, Perm Stat National Research University
S. A. Ilarionov, Perm Stat National Research University
FREE AMINO ACIDS IN THE CULTURE MEDIUM YEAST Saccharomyces cerevisiae, GROWING AT
DIFFERENT CONCENTRATIONS OF COPPER
Abstract. Amino acids play an important role in various physiological processes, including - organisms to adapt the action of heavy metals. A study of the effect of different concentrations of copper on the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The content of free amino acids in the culture medium of yeast growing in different amounts of metal therein.
Keywords: amino acids, copper, Saccharomyces cerevisiae.
Адаптация к негативным факторам окружающей среды является неотъемлемой частью в жизнедеятельности организмов. Важную роль в этом играют низкомолекулярные соединения, в том числе - аминокислоты. Аминокислоты принимают участие в физиологическом ответе растений и микроорганизмов на водный дефицит, засоление, воздействие высоких и низких температур, дефицит элементов питания, избыточный или недостаточный уровень УФ-излучения, различные виды инфекций, радиационное воздействие, а также на избыточное поступление соединений тяжелых металлов. Наиболее изучены в этом отношении пролин и аспарагин [1-3]. Растения-гипераккумуляторы тяжелых металлов накапливают большое количество гистидина в корнях, что способствует переносу металлов в надземные органы растений [4]. Аминокислоты способны уменьшать токсический эффект тяжелых металлов и изменять скорость их поступления в клетки [5].
Дрожжи S. cerevisia выращивали на глюкозо-аммонийной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; (NH4hSO4 - 5,0; KH2PO4 - 0,85; K2HPO4 - 0,15; MgSO4 * 7 H2O - 0,5; NaCl -0,1; CaCl2 * 4 H2O - 0,1; дрожжевой экстракт - 2; вода дистиллированная - 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати в течени 30 мин. [6]. Культивирование проводили в конических колбах на 250 мл с объемом среды в каждой колбе - по 100 мл, при температуре 300 С и скорости перемешивания 150 об./мин.
Сульфат меди вводили в питательную среду перед инокуляцией. Раствор с концентрацией 5 * 10 моль/ л готовили растворением навески соли в дистиллированной воде. Концентрацию раствора проверяли методом комплексонометрического титрования с ЭДТА [7]. Растворы стерилизовали фильтрованием через целлюлозно-ацетатную мембрану «Владипор» типа
МФАС - Б (Россия) с размером пор 0,2 мкм. Полученный раствор вносили колбу для культивирования со 100 мл питательной среды до получения концентраций 5 * 10-4, 5 * 10-5 и 5 * 10-6 моль/ л.
Для выяснения влияния выбранных концентраций меди были построены кривые роста дрожжей (рис. 1). Оптическую плотность клеточной суспензии измеряли на спектрофотометре «ЮНИКО-1201» (Россия) в стеклянных кюветах толщиной 1 см при длине волны 600 нм.
Время в часах
Рисунок 1 - Кривые роста дрожжей при различных концентрациях меди в среде 1 - 5*10-5моль/ л; 2 - 5*10-4 моль/ л; 3 - 5*10-6 моль/ л; 4 - без внесения меди в среду
Концентрация меди 5 * 10-6 моль/ л оказывала наименьшее токсическое влияние на исследованные микроорганизмы; при этом наблюдалось небольшое отставание в переходе культуры в стационарную фазу роста. Характер кривых, полученных при концентрациях 5 *
4 5
10 и 5 * 10 моль/ л, заметно отличаются от кривой роста, полученной в контрольном эксперименте.
Значения рН через 48 часов после инокуляции в разных сериях эксперимента приведены в таблице 1. Величина рН стерильной среды, в которую не вводили раствор сульфата меди, составляла 4,58. Во всех сериях эксперимента в результате жизнедеятельности микроорганизмов происходило закисление среды. Минимальная величина рН была зарегистрирована в контрольном эксперименте, максимальная - при концентрации меди 5 * 10-4 моль/ л, что, вероятно, объясняется снижением общей физиологической активности культуры дрожжей при высоких концентрациях токсичного иона.
Таблица 1 - Величина рН культуральной среды S. сerevisiae при различных концентрациях меди
Металл, концентрация (в моль/ л) Контроль Си, 5 * 10-6 Си, 5 * 10-5 Си, 5 * 10-4
рН 2,21 2,40 3,05 3,40
Содержание аминокислот в среде определяли следующим образом. Спустя 48 часов с момента инокуляции, клетки отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин. при 4000 об./мин. Культуральную жидкость помещали в виалы с завинчивающейся крышкой и хранили замороженной при - 180 С. Затем определяли концентрацию аргинина, лизина, тирозина,
фенилалалнина, гистидина, лейцина и изолейцина (суммарно), метионина, валина, пролина, треонина, серина, аланина, глицина, аспарагина и аспарагиновой кислоты (суммарно в виде аспарагиновой кислоты), глутамина и глутаминовой кислоты (суммарно в виде глутаминовой кислоты), цистеина в форме цистиновой кислоты и триптофана при помощи системы капиллярного электрофореза [8].
В культуральной жидкости дрожжей, выращенных без добавления в среду тяжелых металлов, только концентрация аминокислоты метионина 9,61±3,26 мг/л (( 6,44 ± 2,18) * 10 " моль/ л ) - предел обнаружения по данной методике. В присутствии меди в концентрациях 5 * 10-5 моль/ л и 5 * 10-4 моль/ л в среде обнаруживается, помимо метионина, треонин и серин
(табл. 2).
Таблица 2 - Содержание аминокислот в культуральной среде дрожжей при различных концентрациях меди*
Ccu 5 * 10-6 5 * 10-5 5 * 10-4
CMet (1,77±0,60) * 10-4 (1,29±0,44) * 10-4 (1,69±0,57) * 10-4
Ceer - (1,29±0,3) * 10-4 (6,48±1,68)* 10-4
Cire (7,75±3,11) * 10-5 (2,21±0,88) * 10-4 (1,56±0,63) * 10-4
* Концентрации приведены в моль/л.
Максимальная концентрация метионина наблюдается при концентрации меди 5 * 10-6
5 4
моль/ л, треонина - при концентрации 5 * 10" моль/ л, серина - при концентрации 5 * 10" моль/ л. Повышение концентрации серина при увеличении содержания меди в питательной среде наиболее выражено.
По полученным данным можно сделать вывод, что адаптация дрожжей Saccharomyces cereviiae к действию меди является сложным многоэтапным процессом, важную роль в котором играют аминокислоты, в частности - метионин, треонин и серин. Выяснение деталей этого процесса требует дальнейшего исследования.
Список литературы:
1. El-Enany A.E., Issa A.A. Proline Alleviated Metals Stress in Scenedesmus armatus // Folia Microbiol. 2001. Vol. 46, № 3. P. 227-230.
2. Szabados L., Savoure A. Proline: a multifunctional amino acids // Trends in Plant Science. 2009. Vol. 15, № 2. P. 89-98.
3. Lea P.J., Sodek L., Parry M.A.J., Shewry P.R., Halford N.G. Asparagine in plants // Ann. Appl. Biol. 2007. № 150. P. 1-26.
4. Серегин И.В. Устойчивость растений к тяжелым металлам // Труды конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии». Ростов-на-Дону, 2006. С. 30-31.
5. Kosakowska A., Falkowski L., Lewandowska J. Effect of Amino Acids on the Toxicity of Heavy Metals // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1988. № 40. Р. 532-538.
6. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений / под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издат. центр «Академия», 2005. 608 с.
7. Шварценбах Г., Флашка Г. Комплексонометрическое титрование. М.: Химия, 1970.
360 с.
8. М 04 - 38 - 2009. Корма, комбикорма и сырье для их производства. Методика для измерения массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ». Санкт-Петербург, 2009. 63 c.
List of references:
1. El-Enany A.E., Issa A.A. Proline Alleviated Metals Stress in Scenedesmus armatus // Folia Microbiol. 2001. Vol. 46, № 3. P. 227-230.
2. Szabados L., Savoure A. Proline: a multifunctional amino acids // Trends in Plant Science. 2009. Vol. 15, № 2. P. 89-98.
3. Lea P.J., Sodek L., Parry M.A.J., Shewry P.R., Halford N.G. Asparagine in plants // Ann. Appl. Biol. 2007. № 150. P. 1-26.
4. Seregin I.V. Resistance of plants to heavy metals // Proceedings of the Conference «Plant Physiology - the fundamental basis of modern phytobiotechnology». Rostov-na-Donu, 2006. P. 30-31.
5. Kosakowska A., Falkowski L., Lewandowska J. Effect of Amino Acids on the Toxicity of Heavy Metals // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1988. № 40. P. 532-538.
6. Workshop on microbiology. Textbook for students of higher educational institutions / ed. A.I. Netrusov. M.: Publish. Center «The Academy», 2005. 608 p.
7. Shvarcenbah G., Flashka G. Complexometric titration. M.: Chemistry, 1970. 360 p.
8. M 04 - 38 - 2009. Feed, fodder and raw materials for their production. Method for measuring the mass fraction of amino acids by capillary electrophoresis using a capillary electrophoresis system «Kapel». Saint Petersburg, 2009. 63 p.
