CC BY
81
Медицинская иммунология 2010, Т. 12, № 1-2, стр. 129-132 © 2010, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
СОДЕРЖАНИЕ РЕЦЕПТОРА ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА CD95 (FAS/APO-1) НА НЕЙТРОФИЛАХ
цервикального и вагинального секретов у женщин
_ _ wr ■ _ _ __
с хламидийной инфекцией
Гизингер О.А., Долгушин И.И.
НИИ иммунологии Челябинской государственной медицинской академии, г. Челябинск
Резюме. Проведены исследования на наличие экспрессии антигена CD95 (Fas/APO-1) на поверхности нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета. У 65 обследованных женщин с хламидийной инфекцией отмечено усиление экспрессии CD95+ после проведенной базисной терапии. Отмечена нормализация содержания рецепторов CD95+ на нейтрофилах с хламидийной инфекцией после терапии с применением комплексного магнитолазерного воздействия.
Ключевые слова: апоптоз, местный иммунитет, репродуктивный тракт, хламидийная инфекция, магнитолазерное излучение. Giesinger O.A., Dolgushin I.I.
STUDIES IN DYNAMICS OF APOPTOSIS-RELATED SURFACE ANTIGEN (CD95)
expression on neutrophils from cervical and vaginal secretions in women with chlamidia infection
Abstract. CD95 (Fas/APO-1) antigen expression was studied on the surface of neutrophil granulocytes from cervical secretions. Sixty-five female patients with established Chlamydia infection were found to have an increased CD95+ antigen expression following basic therapy. CD95+ receptors on neutrophils in the patients with Chlamydia infection have been shown to return to normal levels following a combined magnetic laser treatment. (Med. Immunol., vol. 12, N1-2, pp 129-132)
Keywords: apoptosis, local immunity, reproductive tra^, chlamidial infection, magnet laser irradiation.
Введение
Подержание гомеостаза, в том числе и клеточного, является одним из основных свойств живых организмов. Оно осуществляется при уравновешивании процессов клеточной пролиферации и клеточной гибели. Последнее десятилетие отмечено постоянным нарастанием интереса широких кругов исследователей к открытому около сорока лет явлению, названному «программированная клеточная смерть», или апоптоз [1, 3, 7, 8]. Так как апоптоз вовлечен в большинство основных механизмов регулирования иммунной системы, то клеточная смерть является важным компонентом в биологическом процессе [1, 4, 8].
Адрес для переписки:
Гизингер Оксана Анатольевна
454016, г. Челябинск, ул. Чайковского, 54, кв. 9.
Тел.: (3512) 797-09-09.
Е-mail: [email protected]
Около 10 лет назад на цитоплазматической мембране нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов открыт первый специализированный рецептор для индукции апоптоза — CD95(Fas/APO-1) [5]. Связывание с рецептором моноклональных антител специфического лиганда CD95L/FasL индуцирует в чувствительных клетках апоптоз. CD95" рецептор принадлежит к суперсемейству фактора некроза опухолей. Накоплено достаточно информации об экспрессии CD95+ лимфоцитами, моноцитами, эозинофилами периферической крови, но нередко эти данные противоречивы. Одни исследователи не обнаруживают антиген на покоящихся лимфоцитах, другие его выявляют. Так, H. Lecher и соавторы (1998) сообщили о том, что покоящиеся Т-клетки не экспрессируют CD95(Fas/APO-1) антиген. Однако большинство исследователей выявляют антиген на покоящихся Т-клетках, моноцитах, лимфоцитах, нейтрофилах периферической крови [5, 6]. По данным М. Mas-saia, L.A. Hussain, C.G. Kelly, A. Rodin, у здоровых
129
Гизингер О.А., Долгушин И.И.
Медицинская Иммунология
взрослых людей Fas антиген экспрессирован на лимфоцитах в 23,8 % [9].
На настоящий момент огромный интерес представляет экспрессия CD95+ антигена нейтрофилами, поскольку, по данным литературных источников, именно нейтрофилы чувствительны к Fas опосредованному апоптозу. Кроме того, повышенное содержание нейтрофилов в биологических секретах репродуктивного тракта является важным индикатором локального воспалительного процесса урогенитального тракта [2, 8]. Кроме того, ряд исследователей связывает изменение рецепторного пейзажа на нейтрофилах как одного из возможных механизмов прогрессирования и, возможно, усложнения клинической ситуации [2, 6, 8]. Благодаря исследованиям последних лет становится очевидным, что контроль клеточной гибели хламидиями является одним из ведущих механизмов ухода от защитных факторов макроорганизма. Известно, что при инфекционной патологии апоптоз — это протективная реакция организма, направленная на предотвращение развития инфекции. Подавление апоптоза приводит к дессиминации возбудителя в различные ткани и органы, распространению инфекционного процесса, выживанию патогена и его персистенции.
Подавление апоптоза показано для целого ряда бактерий, но в большей степени эта активность связана с внутриклеточным типом паразитирования. Такое взаимодействие реализуется в результате действия отдельных структурных компонентов бактериальной клетки либо секретируемых молекул с конкретными звеньями сигнального пути, ведущего к апоптозу. Факторы, активирующие апоптоз, могут служить привлекательными мишенями для физико-химических воздействий. Такого типа воздействия, активирующие апоптоз на фоне инфекции, обусловленной внутриклеточными паразитами, — единственный на данный момент подход для элиминации персистирующих форм возбудителя и борьбы с хроническими инфекционными заболеваниями урогенитального тракта [5, 6, 7].
Хламидии, возможно, являются теми патогенами, для которых достаточно четко показано участие в контроле апоптоза клеток хозяина, для них характерна как про-, так и антиапоптоз-ная активность. Вероятно, что индукция или подавление апоптоза на уровне макроорганизма определяет характер развития инфекции: продуктивная инфекция или персистентная. Такое комплексное влияние объясняется несколькими обстоятельствами.
Во-первых, хламидии могут колонизировать многие клетки и ткани, а механизм ответа на интернализацию патогена специфичен для разных клеток. Во-вторых, для разных штаммов хламидий показано преобладание той или иной активности. В-третьих, на разных этапах жизненного цикла хламидий целесообразна та или иная тактика, подавление на первых этапах внутри-
клеточного размножения и активация апоптоза на этапе выхода инфекционных элементарных частиц и образование внутриклеточно выживающих персистирующих форм, также сопряженное с поддержанием жизни клетки [6, 8].
С исследованием CD95(Fas/APO-1)-рецеп-тора связано большое число работ [4, 7, 9], однако в доступной литературе нам не встретились работы по исследованию CD95+ на нейтрофилах цервикального женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта до и после комплексного лечения с локальным использованием магнитолазеротерапии.
Это определило цель работы: изучить содержание CD95+ на нейтрофилах цервикального секрета здоровых женщин и женщин с хлами-дийной инфекцией до и после терапии с применением магнитолазерного воздействия
Материалы и методы
Под наблюдением находились 65 женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта. Набор в группы производился из числа женщин, обратившихся за медицинской помощью в Областной кожно-венерологический диспансер г. Челябинска в 2008-2009 гг. Группу сравнения составили 45 женщин без хламидий-ной инфекции и гинекологической патологии. Критерии включения: наличие хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта женщин, выявленного методом ПЦР, возраст 17-35 лет, согласие пациенток на участие в исследовании. Критерии исключения: наличие тяжелой соматической патологии (ИБС, стенокардии, гипертонической болезни, острых и обострении хронических заболеваний, онкозаболеваний, аутоиммунной патологии, гормональных нарушений, беременности, лактации, наличии сопутствующих венерических заболеваний, ВИЧ-инфекции, других инфекций, передающихся половым путем, включая паппиломави-русную, герпетическую и цитомегаловирусную инфекции), несогласие пациенток на участие в исследовании.
Диагноз генитального хламидиоза ставился на основании выявления возбудителя в цервикальном канале методами прямой иммунофлюоресценции («НПФ Лабдиагностика», Москва) и полимеразой цепной реакции («Литех», Москва).
Возраст обследованных колебался от 25 до 33 лет, средний возраст инфицированных женщин составил 28,5±0,5 года и существенно не отличался от среднего возраста здоровых женщин из группы сравнения. Так, большинство наших пациенток были молодого репродуктивного возраста. Курс лечения хламидиоза включал: азитромицин 1 г 1 раз в сутки на 1, 7, 14 день лечения перрорально, циклоферон 2 мл № 10 внутримышечно. На протяжении всего курса
130
2010, Т. 12, № 1-2
Магнитолазерное воздействие на экспрессию CD95+ нейтрофилами
применения антибиотиков больные обеих групп получали антимикотики, ферменты, витамины, бифидумбактерин по 5 доз 3 раза в сутки в течение 20 дней.
Магнитолазеротерапию проводили аппаратом «Мустанг 2000» путем изменения режимов генерации излучения после анализа данных лабораторных исследований, купирования явлений интоксикации и исключения процессов в придатках матки, требующих оперативных вмешательств. Аппарат «Мустанг 2000» предназначен для воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением или комплексным магнитолазерным излучением на биологические объекты в клинической медицине. Воздействия, генерируемые при помощи аппарата «Мустанг 2000», обеспечивают импульсный или непрерывный режим лазерного или магнитолазерного излучения головок [7, 12, 14].
Аппарат имеет Сертификат соответствия Госстандарта России, выданной Органом по сертификации ИМН ВНИИИМТ, и соответствует ГОСТ Р50723-2005. Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2008/02872 от 24.06.2008.
Технические характеристики аппарата «Мустанг 2000»: интенсивность магнитного поля — 1,25 Тс; частота серий импульсов в минуту — 30; интервал между импульсами — 100 мсек; терапию проводили ежедневно, общий курс лечения — 10 процедур. Сеансы комплексного магнитолазерного излучения излучения проводились в амбулаторных условиях, в специально оборудованном кабинете согласно «Санитарным нормам и правилам устройства и эксплуатации лазеров», Приказ МЗ РФ № 5804-91.
Лечение с применением магнитолазерного воздействия осуществлялось согласно методическим рекомендациям УГМАДО г. Челябинска (2000 г.), использование лазеротерапии при лечении хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта рекомендовано МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (2000 г.).
Для исследования выбраны цервикальный секрет, поскольку, по данным большинства исследователей, занимающихся проблемой урогенитального хламидиоза, именно шейка матки является местом наибольшей иммунологической активности репродуктивного тракта и частой локализации хламидий. Забор цервикальной слизи осуществляли с помощью специальной градуированной пипетки. Слизь помещали в 1,0 мл физиологического раствора или среды 199, тщательно суспензировали, количество нейтрофилов подсчитывали в камере Горяева.
Для выявления поверхностного маркера (антигена) CD95 на нейтрофильных гранулоцитах нами были использованы моноклональные антитела, имеющие соответствующую направленность
и специфичность, конъюгирующие с меткой, например с люминесцирующим красителем.
Исследование проводилось по методике им-мунофенотипирования в модификации Сибиряк С.В. и соавторов (1997) с использованием моноклональных антител серии ИКО (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва). Для проведения исследования проводили выделение чистой фракции нейтрофилов из цервикальной слизи.
1. Разводили цервикальную слизь в отношении 1:1 с физиологическим раствором
2. Наслаивали полученную смесь на двойной градиент фиколл-верографин плотности 1,077-1,093.
3. Проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 45 мин.
4. Проводили снятие кольца нейтрофильных гра-нулоцитов в интерфазе градиентов и отмывали нейтрофильную взвесь физиологическим раствором путем центрифугирования 2 раза по 10 мин при 1500 об/мин.
На заключительном этапе выделения нейтрофилов проводили стандартизацию нейтрофиль-ной взвеси до концентрации 5 х 106 кл/мл.
Полученные результаты исследований были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Для каждого показателя проверялась статистическая гипотеза о нормальности распределения данных по критерию с2 и Колмогорова-Смирнова о равенстве дисперсий. В случае нормального распределения о достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента (t). Если условия нормальности распределения не выполнялись, мы применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.
Цифровой материал обрабатывался методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows версия basis.
Результаты и обсуждение
При изучении клеточного состава цервикальной слизи женщин с хламидийной инфекцией было выявлено увеличение количества нейтрофилов до 98% от общего количества клеток, присутствующих в секрете (табл. 1). Данное обстоятельство позволило провести подсчет содержания CD95+ рецепторов на поверхности нейтрофилов. В ходе исследования было выявлено снижение CD95+ рецепторов для апоптоза нейтрофилов цервикального секретов у женщин с хламидиозом по сравнению с группой здоровых. Возможно, сниженный уровень готовности к апоптозу может указывать на снижение активности иммунорегуляторных клеток.
Цифровой материал обрабатывался методом вариационной статистики с помощью пакета
131
Гизингер О.А., Долгушин И.И.
Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 1. ЦИТОГРАММА ЦЕРВИКАЛЬНОГО СЕКРЕТА ЖЕНЩИН С ХЛАМИДИИНОИ ИНФЕКЦИЕЙ
Показатели Здоровые (n = 45) Хламидии (n = 65)
Абс. кол-во нейтрофилов, 109/л (абс.) 4,06±0,68 7,3±0,71*
Нейтрофилы, % 95,72±1,68 98,34±2,25*
Абс. кол-во мононуклеаров, 109/л (абс.) 1,72±0,45 1,03±0,25*
Мононуклеары, % 1,94±1,06 1,52±0,42*
Примечание. В таблице приведены лишь достоверные различия между сравниваемыми группами.* - с учетом поправки Бонферони критический уровень р составил 0,002. U-критерий Манна-Уитни.
таблица 2. содержание CD95+ нейтрофилов цервикального секрета у женщин с хлАмидийной инфекцией до и после магнитолазеротерапии
Показатели Здоровые (n = 25) Базис (n = 35) Базис + магнитолазер (n = 30)
до лечения после лечения до лечения после лечения
CD95+, % 4,00±1,20 6,00±1,50* 8,00±1,20** 5,90±1,10* 3,90±1,20**л
Примечание. В таблице приведены лишь достоверные различия между сравниваемыми группами. С учетом поправки Бонферони критический уровень составил 0,002. Сравнения между группами проведены по критерию Манна-Уитни.
* - достоверность по отношению к группе здоровых, ** - достоверность по отношению к показателям до лечения, л - достоверность по отношению к группе пролеченных без магнитолазеротерапии.
прикладных программ Statistica for Windows версия basis.
Нами исследовано содержание CD95+ после проведения базисной противохламидийной терапии. Проведенные исследования показали увеличение CD95+ на поверхности нейтрофилов с 5±1,5 до 12±1,2%.
Хотя до сих пор полностью не изучен механизм этого явления, возможно, препараты, входящие в курс противохламидийной терапии, инициируют на поверхности клеток экспрессию CD95-лиганда, который затем связывается с CD95+ рецептором, локализованным на поверхности этих клеток, что приводит к передаче сигнала смерти. Кроме того, апоптоз нейтрофилов, по-видимому, приводит к активизации макрофагов, которые связывают тромбоспондин (белок, присутствующий в зонах воспаления), тем самым способствуя прекращению воспалительных явлений [6, 7, 8].
Повышенный уровень готовности клеток к апоптозу может указывать на снижение активности иммунорегуляторных клеток, в частности нейтрофильных гранулоцитов, за счет этого механизма «программируемой клеточной гибели».
Проведенные исследования показали достоверную (р = 0,001, р < 0,002) нормализацию CD95+ на поверхности НГ после магнитолазеротерапии. Возможно, изменение содержания рецепторов СD95+ на поверхности нейтрофила происходит благодаря действию энергетических барьеров реакций за счет комплексного лазерного и магнитного излучений и усилению процессов в активных центрах ферментов ключевых метаболических путей в нейтрофильном грану-лоците под действием данного вида излучения.
Список литературы
1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. — М., 2002. — 291 с.
2. Бурова А.А., Абдуллаева С.А., Торганова Е.Н. Основные свойства возбудителя хламидиоза и его роль в развитии инфекции урогенитального тракта // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 1999. — № 4. — С. 107.
3. Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста // Гематол. и траннсфузиол. — 1997. — Т 42, № 5. - С 4-9.
4. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Успехи современной биологии. — 1999. — Т 119, № 5. — С. 440-450.
5. Новиков В.С. Программированная клеточная гибель. — СПб.: Наука. — 1996. — 276 с.
6. Нестерова И.В. Особенности функционирования противовирусного иммунтета. Цитокины и воспаление. — Т 4, № 3. — С. 89.
7. Сидоренко С.П. Fas/СD95-опосредованный апоптоз в патогенезе лимфоидных новообразований // Эксперим. онкол. — 1990. — Т 20. — С. 15-28.
8. Толыбеков Ф.С. Морфогенез и вопросы патогенеза инфекционных процессов, вызванных хламидиями / Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Л., 1979. — 32 с.
9. Holzman D. Cellar apoptosis: on death and dying // ASM News. — 1994. — Vol. 60, N 12. — Р 634.
10. Hussain L.A. Investigation of the complement reseptor3 (CD 11b/CD 18) in human rectal epithelium// Clin. Exp. Immunol. — 1995. — Vol. 102, N 2. — P. 384-388.
поступила в редакцию 28.02.2008 отправлена на доработку 05.03.2008 принята к печати 15.09.2009
132
