CC BY
52
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СОДЕРЖАНИЕ И ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ... ВБ
УДК 618.19-006.6:577.216.32 Е.С. Герштейн, А М. Щербаков, А .М. Платова, ГЮ. Чемерис, А А. Тулеуова, З.К. Карабекова, И.В. Терешкина, Л.К. Овчинникова, М.В. Грицкевич, В.П. Летягин СОДЕРЖАНИЕ И ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЯДЕРНОГО ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NF-kB В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Контактная информация: Герштейн Елена Сергеевна, лаборатория клинической биохимии адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-11-59; факс +7(495)324-63-52; e-mail: [email protected] Статья поступила: 01.09.2010, принята к печати 16.09.2010. Резюме Количественными иммуноферментными методами определены содержание и ДНК-связывающая активность p65 субъединицы ядерного транскрипционного фактора NF^B в опухолях и гистологически неизмененных тканях 119 больных раком молочной железы. В 97% опухолей выявлено усиление ДНК-связывающей активности NF^Bp65 по сравнению с окружающей тканью, в большинстве случаев сопровождавшееся увеличением количества общего белка. Достоверной взаимосвязи со стадией заболевания, размером и гистологическим строением опухоли, степенью поражения лимфатических узлов не обнаружено, но содержание NF^Bp65 в опухолях III степени злокачественности было достоверно выше, чем в опухолях II степени злокачественности. В HER2+ опухолях отмечено увеличение общей экспрессии белка NF-KBp65, не зависящее от статуса рецепторов стероидных гормонов и не сопровождающееся увеличением ДНК-связывающей активности, которая наиболее высока в опухолях с «тройным отрицательным» (PЭ~PП~HER2~) рецепторным статусом. Ключевые слова: ядерный транскрипционный фактор NF-kappa В, NF^Bp65, рецепторы стероидных гормонов, HER2/neu, рак молочной железы.
E.S. Gershtein, A.M. Scherbakov, A.M. Platova. G.Yu. Tchemeris, A.A. Tuleuova, Z.K. Karabekova, I.V. Tereshkina, L.K. Ovchinnikova, M.V. Gritskevich, V.P. Letyagin CONTENT AND DNA-BINDING ACTIVITY OF NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR NF-kB IN THE TUMORS OF BREAST CANCER PATIENTS Russian N.N. Blokhin Cancer Research Center RAMS, Moscow Abstract Concentration and DNA-binding activity of nuclear transcription factor NF-кБ p65 subunit were measured by quantitative immunoenzymatic methods in the tumors and histologically unchanged mammary gland tissues of 119 breast cancer patients. Enhanced as compared to adjacent tissue NF-^p65 DNA-binding activity was revealed in 97% of the tumors, and in most cases it was associated with an increase of total NF-^p65 content. No significant associations were found between the parameters studied and disease stage, tumor size and histology, lymph node status, but NF-^p65 content was significantly increased in grade III as comparedto grade II tumors. HER2+ tumors were characterized by an increase of total NF-^p65 expression independent on steroid receptor status and not accompanied by enhancement of DNA-binding activity, the latter being the highest in “triple receptor negative” (ER~PR~HER2~) tumors. Key words: nuclear transcription factor NF-kappa B, NF-^p65, steroid hormone receptors, HER2/neu, breast cancer. Введение формой существования этих белков в большинстве типов клеток является гетеродимер p50/RelA(p65). Ядерный транскрипционный фактор NF-кВ ДНК-связывающая активность NF^B стимулируется (NF-кB), первоначально идентифицированный как в ответ на целый ряд экзогенных стимулов, причем белок, связывающийся со специфической декамерной этот процесс не зависит от синтеза белка de novo. последовательностью ДНК (GGG ACT TTC C) в ин- В большинстве нормальных клеток W^B/faB троне гена легких цепей иммуноглобулинов каппа в комплексы находятся в цитоплазме в транскрипцион-зрелых В-лимфоцитах и плазматических клетках, иг- но неактивном состоянии и активируются только при рает важную роль в клеточной пролиферации, апоп- поступлении в клетку соответствующего регулятор-тозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, по- ного стимула. скольку он регулирует экспрессию генов, вовлечен- Регуляция NF^B сигнального пути наруше-ных в эти процессы [6]. NF-^ представляет собой на во многих опухолях человека, в том числе и при гетеродимерный комплекс белков семейства Rel, ко- раке молочной железы (РМЖ), при этом в боль-торые в большинстве покоящихся клеток неактивны и шинстве опухолевых клеток NF^B постоянно ак-находятся в цитоплазме в комплексе со специфиче- тивирован и находится в ядре [1; 4]. Особенно вескими ингибиторами - fcB. Идентифицировано пять лико значение NF^B в опухолях молочной железы, белков семейства NF-^, содержащих общий ДНК- отрицательных по рецепторам эстрогенов (РЭ), но связывающий домен: NF-^1 (p50/p105), NF-^2 имеющих рецепторы эпидермального фактора рос-(p52/p100), RelA (NF-^ p65), RelB, и c-Rel. Основной та или HER2/neu [5].
№ 4/том 9/2010 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Установлено, что гиперактивация NF-kB является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам, химиопрепаратам и лучевой терапии [2-3; 8; 10; 13]. По некоторым данным, оценка степени активации NF-kB в РЭ-положительном РМЖ позволяет выделить подгруппу гормонорезистентных больных [14-15]. Другим клинически значимым эффектом NF-kB может оказаться его способность стимулировать образование остеолитиче-ских метастазов РМЖ в костях [9].
Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-kB сигнальный путь, позволит повысить чувствительность клеток к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение, в том числе и для предотвращения метастазирования РМЖ в кости [4; 12].
Однако большинство доказательств определяющего значения NF-kB сигнального каскада при РМЖ получено в экспериментальных системах, а данные об экспрессии и активности этого фактора в опухолях человека немногочисленны, получены различными методами и требуют дальнейшего подтверждения и развития [1; 7; 11; 15].
Цель данного исследования - сравнительная оценка уровня экспрессии (общего содержания) и ДНК-связывающей активности одного из ключевых белков семейства NF-kB - p65 - в опухолях и окружающих гистологически неизмененных тканях больных РМЖ, а также анализ взаимосвязи этих показателей с рецепторным статусом опухоли и основными клинико-морфологическими особенностями заболевания.
Методика исследования
В исследование вошли 119 больных раком молочной железы в возрасте от 23 до 84 лет (медиана - 54 года). Репродуктивная функция была сохранена у 37 больных, 18 находились в состоянии пре-менопаузы, и у 64 была менопауза различной длительности. Больные распределялись по стадиям заболевания следующим образом: IIA - 37, IIB - 28, по 20 больных I и IIIA стадии, и у 14 больных был распространенный процесс IIIB - IIIC стадии.
По гистологическому строению 95 опухолей представляли собой протоковый инфильтративный рак, 14 - дольковый инфильтративный, другие типы РМЖ представлены единичными наблюдениями. Большинство опухолей (84) имели II, 28 - III, и 7 - I степень злокачественности. Во всех опухолях иммуногистохимическими методами определен статус рецепторов эстрогенов (РЭ), рецепторов прогестерона (РП) и HER2/neu.
Образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани молочной железы (200-500 мг) для исследования NF-KBp65 брали во время операции и хранили при -70°С. Затем измельчали их в порошок в жидком азоте и лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГ-ТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ Р-глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Лизаты центрифугировали при 20000 об/мин, 30 мин, 4°С (центрифуга Optima M TLX, Beckman, США).
Суммарное содержание NF-KBp65 в полученных ядерно-цитоплазматических экстрактах тканей определяли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа «№-кВр65 (Total)» (Invitrogen, США) в соответствии с инструк-
циями производителя после предварительного разведения в 150 раз. Содержание №-КВр65 выражали в нанограммах на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури.
ДНК-связывающую активность NF-KBp65 измеряли, используя наборы «TransAM NFkB р65» (Active Motif, США). Принцип метода заключается в следующем: активированный NF-KBp65 специфически связывается с иммобилизованным на 96-луночной планшете олигонуклеотидом, содержащим консесус-ную последовательность 5'-GGGACTTTCC-3', после чего проводится стандартное прямое иммунофер-ментное определение количества связавшегося белка NF-KBp65 с колориметрической детекцией при 450 нм. Для построения калибровочной использовали ядерный экстракт активированных (TPA + Cl) клеток Jurkat, ДНК-связывающую активность которого принимали за 100 единиц (Ед). ДНК-связывающую активность NF-KBp65 в исследуемых образцах выражали в Ед/мг общего белка.
Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 (Bio-Tek Instruments Inc., США).
Данные обрабатывали с помощью программы «Statistica 7.0». При сравнении показателей и анализе их взаимосвязей использовали непараметрические методы: критерии Манна-Уитни и Kruskel-Wallis, тест корреляции рангов Спирмена (R). Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования
Измеримые количества общего белка NF-KBp65 (0,66 - 67,2; медиана - 11,1 нг/мг белка) обнаружены в 118 образцах рака (99%) и в 96 образцах (81%) гистологически неизмененной ткани молочной железы (0,05
- 42,5; медиана - 2,9 нг/мг белка).
Содержание NF-KBp65 в опухоли было достоверно выше, чем в окружающей ткани у 86% больных РМЖ (p<0,0001). У 99% больных выявлена измеримая ДНК-связывающая активность NF-KBp65 в опухоли (1,0 - 711; медиана - 193 Ед/мг белка) и у 81%
- в окружающей ткани (0,14 - 143; медиана - 28,7 Ед/мг белка), причем этот показатель был достоверно повышен в опухоли по сравнению с окружающей тканью в 97% случаев (p<0,0001).
Содержание и ДНК-связывающая активность NF-KBp65 в опухоли не коррелировали с соответствующими показателями неизмененной молочной железы. В то же время, как в опухоли, так и в нормальной ткани отмечена слабая, но достоверная положительная корреляционная взаимосвязь между общим уровнем белка NF-KBp65 и его ДНК-связывающей активностью (R=0,31, p<0,01 и R=0,26, p<0,05 соответственно).
Таким образом, практически во всех РМЖ наблюдается усиление ДНК-связывающей активности NF-KBp65, в большинстве случаев сопровождающееся также увеличением количества общего белка этого транскрипционного фактора.
Однако увеличение активности NF-KBp65 носит более выраженный характер, чем увеличение количества общего белка: ДНК-связывающая активность превышает верхнюю 95% границу нормальных значений (118 Ед/мг белка) в 81% случаев, а содержание общего белка - только в 18% (95% граница нормы - 26,7 нг/мг белка).
Это наблюдение соответствует представлению об относительной независимости активации транскрипционного фактора NF-kB в опухолях от синтеза этого белка de novo.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СОДЕРЖАНИЕ И ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ.
87
Для оценки взаимосвязи уровня экспрессии и ДНК-связывающей активности ЫР-кБр65 с клиникоморфологическими особенностями РМЖ исследовали, помимо основных, еще 3 расчетных показателя: увеличение содержания белка р65 и увеличение его активности в опухоли по сравнению с окружающей тканью (ТЫ), а также соотношение активности и общего содержания (удельную активность) ЫР-кБр65 в опухолевой ткани. Достоверной взаимосвязи с такими клиникоморфологическими факторами как стадия заболевания, размер (индекс Т) и гистологическое строение опухоли, степень поражения лимфатических узлов (индекс Ы) ни для одного из показателей не обнаружено.
Содержание общего белка ЫР-кБр65 в низкодифференцированных опухолях III степени злокачественности (1,7 - 67,2; медиана 17,7 нг/мг белка) было достоверно выше, чем в умеренно дифференцированных опухолях II степени злокачественности (0 - 58,3; медиана - 9,5 нг/мг белка; р<0,05). Другие исследованные показатели не зависели от степени злокачественности РМЖ. Учитывая роль активации ЫР-кБ-сигнального пути в регуляции гормональной и лекарственной чувствительности РМЖ, особый интерес представляла оценка взаимосвязи экспрессии и ДНК-связывающей активности одной из его субъединиц с рецепторным статусом опухоли. В таблице суммированы данные по наиболее клинически значимым группам опухолей с различным рецепторным статусом. Достоверных различий в зависимости от статуса рецепторов стероидных гормонов ни для одного из показателей не обнаружено, хотя можно отметить тенденцию к увеличению содержания и ДНК-связывающей активности ЫР-кБр65 в РЭ-отрицательных опухолях по сравнению с РЭ-поло-жительными.
В то же время достоверное увеличение содержания общего белка ЫР-кБр65 (р<0,01) и его изменения по отношению к норме (р<0,01), а также снижение удельной активности ЫР-кБр65 (р<0,05) наблюдается в НЕК2-положительных опухолях по сравнению с НЕК2-отрицательными. При анализе сочетаний из трех видов рецепторов выявлены следующие закономерности: 1) значительное снижение удельной активности ЫР-кБр65 в РЭРПНЕК2+ опухолях, высоко достоверное по сравнению с РЭРПНЕЫ2- (р<0,01); 2) наибольшее увеличение ДНК-связывающей активности ЫР-кБр65 по сравнению с окружающей тканью в опухолях, отрицательных по трем видам рецепторов (р<0,05 по отношению к РЭ+Рп+НЕЫ2- опухолям); 3) наконец, при сравнении опухолей с двумя классическими сочетаниями рецепторов - РЭРПНЕЫ2+ и РЭ+РП+НЕЫ2- - обнаружено достоверное увеличение суммарного содержания и прироста общего белка ЫР-кБр65 в первой подгруппе по сравнению со второй (р<0,05). Таким образом, по нашим данным, в НЕЫ2+ опухолях молочной железы происходит увеличение общей экспрессии белка ЫР-кБр65, не зависящее от статуса рецепторов стероидных гормонов и не сопровождающееся увеличением ДНК-связывающей активности. В то же время, общая и удельная ДНК-связывающая активность ЫР-кБр65 наиболее высока в опухолях с так называемым «тройным отрицательным» рецепторным статусом, не поддающихся ни эндокринной, ни молекулярно-направленной терапии, поэтому возможно, что именно эта подгруппа больных РМЖ получит преимущество от использования селективных ингибиторов ЫР-кБ.
Исследование поддержано РФФИ, грант 09-03-00042.
Таблица
Содержание и ДНК-связывающая активность ЫР-кБр65 в ядерно-цитоплазматических экстрактах рака молоч-
Рецепторный статус Число образцов ЫР-кБ Общий 65 нг/мг белка ДНК-связывающая активность ЫР-кБр65 Ед/ мг белка Удельная ДНК- связывающая активность Ед/нг ЫР-кБр65
Содержание в опухоли Изменение по сравнению с неизмененной тканью (Т-Ы) Активность в опухоли Изменение по сравнению с неизмененной тканью (Т-Ы)
РЭ+ 81 8,95 0 - 67,2 6,83 -28,1 - 67,1 187 0 - 640 158 -28,7 - 557 15,7 0 - 182
РЭ- 34 13,7 2,1 - 46,5 9,49 -18,7 - 46,5 223 63,5 - 497 196 63,5 - 447 15,8 3,42 - 77,8
РЭ+РП+ 65 9,47 0 - 58,3 7,17 -20,4 - 55,8 193 0,98 - 640 162 -28,7 - 557 19,3 0,34 - 182
РЭРП- 31 13 3 2,08-, 46,5 9,12 -18,7 - 46,5 212 63,5 - 497 193 63,5 - 447 16,0 3,42 - 77,8
НЕЫ2+ 18 18,4 4,25 - 67,2 15,4 2,21 - 67,2 166 63,5 - 497 160 63,5 - 402 9,29 3,42 - 45,3
НЕЫ2- 97 9,731 0 - 58,3 6,961 -28,1 - 55,8 191 0 - 640 171 -28,7 - 557 16,72 0 - 182
РЭ+РП+НЕЫ2- 62 9,38 0 - 58,3 7,0 -20,4 - 55,8 193 0,98 - 640 162 -28,7 - 557 19,3 0,34 - 182
РЭ+РП+НЕЫ2+ 3 21,8 7,41 - 33,7 20,2 5,08 - 33,7 202 131 - 272 185 101 - 268 20,3 3,90 - 36,7
РЭРПНЕЫ2+ 13 18,34 4,25 - 46,5 14,84 2,21 - 46,5 158 63,5 - 497 149 63,5 - 358 ,2 7, 3 1 ,4 3,
РЭРПНЕЫ2- 18 10,2 2,08 - 34,4 7,12 -18,7 - 34,4 282 123 - 450 2314 118 - 447 27,5 8,35 - 77,8
'Представлены медианы и диапазоны значений. 1 р<0,01 по сравнению с НЕЫ2+ опухолями 2 р<0,05 по сравнению с НЕЫ2+ опухолями 3 р<0,01 по сравнению с РЭ+РП-НЕК2- опухолями 4 р<0,05 по сравнению с РЭ+РП+НЕЫ2- опухолями
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СОДЕРЖАНИЕ И ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ...
Литература
1. Герштейн Е.С., Овчинникова Л.К., Кушлинский Н.Е. Роль ядерного транскрипционного фактора NF-kappa B в этиологии, патогенезе и клиническом течении рака молочной железы // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-2009.-Vol. (5).-P. 10-13.
2. Лобанова Ю.С., Щербаков А.М., Шатская В.А., Красильников М.А. Эстроген-зависимый апоптоз в клетках рака молочной железы: роль сигнального пути, регулируемого NF-kB. // Биохимия.-2007.-Vol. 72 (3).-P. 392-401.
3. Ahmed K.M., Cao N, Li J.J. HER-2 and NF-kappaB as the targets for therapy-resistant breast cancer // Anticancer Res.-2006.-Vol. 26 (6B).-P. 4235-4243.
4. Baldwin A.S. Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by the transcription factor NF-kappaB // J Clin Invest.-2001.-Vol. 107 (3).-P. 241-246.
5. Biswas D.K., Iglehart J.D. Linkage between EGFR family receptors and nuclear factor kappaB (NF-kappaB) signaling in breast cancer // J Cell Physiol.-2006.-Vol. 209 (3).-P. 645-652.
6. Biswas D.K., Shi Q, Baily S. et al. NF-kappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell
proliferation and apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A.-2004.-Vol. 101 (27).-P. 10137-10142.
7. Cogswell P.C., Guttridge D.C., Funkhouser W.K., Baldwin A.S., Jr. Selective activation of NF-kappa B subunits in human breast cancer: potential roles for NF-kappa B2/p52 and for Bcl-3 // 0ncogene.-2000.-Vol. 19 (9).-P. 1123-1131.
8. Hernandez-Vargas H, Rodriguez-Pinilla S.M., Julian-Tendero M. et al. Gene expression profiling of breast cancer cells in response to gemcitabine: NF-kappaB pathway activation as a potential mechanism of resistance // Breast Cancer Res Treat.-2007.-Vol. 102 (2).-P. 157-172.
9. Park B.K., Zhang H, Zeng Q. et al. NF-kappaB in breast cancer cells promotes osteolytic bone metastasis by inducing osteoclastogenesis via GM-CSF // Nat Med.-2007.-Vol. 13 (1).-P. 62-69.
10. Russo S.M., Tepper J.E., Baldwin A.S, Jr. et al. Enhancement of radiosensitivity by proteasome inhibition:
implications for a role of NF-kappaB // Int J Radiat Oncol Biol Phys.-2001.-Vol. 50 (1).-P. 183-193.
11. Van Laere S.J., Van der Auwera I, Van den Eynden G.G. et al. NF-kappaB activation in inflammatory breast cancer is associated with oestrogen receptor downregulation, secondary to EGFR and/or ErbB2 overexpression and MAPK hyperactivation // Br J Cancer.-2007.-Vol. 97 (5).-P. 659-669.
12. Wu J.T., Kral J.G. The NF-kappaB/IkappaB signaling system: a molecular target in breast cancer therapy // J Surg Res.-2005.-Vol. 123 (1).-P. 158-169.
13. Zhou Y, Eppenberger-Castori S., Eppenberger U., Benz C.C. The NFkappaB pathway and endocrine-resistant breast cancer // Endocr Relat Cancer.-2005.-Vol. 12 Suppl 1.-P. S37-46.
14. Zhou Y, Eppenberger-Castori S., Marx C. et al. Activation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB) identifies a high-risk subset of hormone-dependent breast cancers // Int J Biochem Cell Biol.-2005.-Vol. 37 (5).-P. 11301144.
15. Zhou Y, Yau C, Gray J.W. et al. Enhanced NF kappa B and AP-1 transcriptional activity associated with antiestrogen resistant breast cancer // BMC Cancer.-2007.-Vol. 7.-P. 59.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
