CC BY
244
Биомедицина • № 2, 2014, C. 37—42
8 РЕЛЕВАНТНОЕ И АЛЬТЕРНАТИВНОЕ БИОМОДЕЛИРОВАНИЕ
Содержание АТФ и 2,3-ДФГ в эритроцитах при консервации и воздействии озона
В.Н. Крылов, А.В. Дерюгина, И.С. Симутис*, Г.А. Бояринов*, А.И. Сенюрина
ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород
* - ФПКВ ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород
Контактная информация: Сенюрина Антонина Игоревна, toncen@mail.ru
Исследовано действие озона в интервале доз 0,5-11 мг/л в экспериментах in vitro на эритроцитар-ную массу разных сроков хранения. Установлено, что малые концентрации озона (1-3 мг/л) увеличивали содержание АТФ и 2,3-ДФГ в эритроцитах при сроках их хранения 7-21 сутки. Повышение концентрации (5-11 мг/л) озона было менее эффективным. При сроках хранения эритроцитарной массы 30 суток озон не вызывал увеличения концентрации АТФ и 2,3-ДФГ.
Ключевые слова: озон, эритроциты разных сроков хранения, АТФ, 2,3-ДФГ.
На сегодняшний день купирование анемий тяжелой степени у больных в критических состояниях, в основном, производится путем трансфузии эритроцитарной массы [2, 8]. Вместе с тем, согласно ряду исследований [14, 15], риск осложнений у критических больных возрастает с увеличением срока хранения трансфузируе-мых эритроцитов. Установлено, что при хранении эритроцитарной массы содержание функционально и морфологически полноценных эритроцитов снижается [4, 9]. Длительное хранение эритроцитов приводит к уменьшению деформируемости и фильтрабельно-сти эритроцитов, уменьшению в них уровня аденозинтрифосфата (АТФ) и
2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) [18, 12]. Укажем, что 2,3-ДФГ служит важным аллостерическим регулятором связывания кислорода с гемоглобином [13], и увеличение продукции 2,3-ДФГ в эритроцитах облегчает высвобождение кислорода в тканях, что способствует поддержанию рО2 в крови и тканях на достаточном уровне. Кроме того, необходимо учитывать, что изменение содержания органических фосфатов в клетке вызывает целый ряд структурных перестроек эритроци-тарных мембран. Так, АТФ служит донором фосфата для протеинкиназных реакций, осуществляющих фосфори-лирование мембранных белков. Повышение содержания АТФ в эритроците
ведет к фосфорилированию спектри-на, анкирина и белка полосы 4.1, ослабляя белок-белковые взаимодействия [16]. Активация протеинкиназ и фос-форилирование белков цитоскелета увеличивает деформабильность мембран [19]. Показано, что при высокой деформируемости происходит максимальный перенос кислорода тканям [7]. Кроме того, рост 2,3-ДФГ сопровождается диссоциацией спектрина, увеличением интегральной подвижности белков мембраны эритроцитов, увеличением площади и уменьшением объема клеток [1]. В свою очередь, увеличение деформации с увеличением площади поверхности и уменьшение их объема также будут способствовать улучшению кислородтранспортной функции клеток, реологии крови и микроциркуляции.
Известно, что озонотерапия приводит к восстановлению кислородного транспорта, нормализует обмен веществ, улучшает микроциркуляцию и текучесть крови. При парентеральном введении озона (аутогемоозонотерапия, внутривенное введение озонированного физиологического раствора) в эритроцитах активируется образование 2,3-ДФГ, который облегчает отдачу кислорода оксигемоглобином и, таким образом, улучшает кислородное обеспечение тканей [17]. Однако работ, посвященных исследованию действия озона на хранящиеся эритроциты, в литературе нами не обнаружено. Между тем, можно ожидать, что озонирование эритроцитарной массы при ее хранении может вызвать улучшение функциональных характеристик эритроцитов, что позволит повысить эффективность ее использования в медицинской практике.
Целью работы ставилось исследование действия различных концентраций растворенного в физиологическом растворе озона на содержание АТФ и 2,3-ДФГ в эритроцитах разных сроков хранения.
Материалы и методы
Объектом исследования служила стабилизированная гемоконсерван-том ЦФДА (Натрия цитрат + Лимонная кислота + Натрия дигидрофосфат + Декстроза + Аденин) в соотношении 1:4 эритроцитарная масса крови человека. Донорскую кровь получали на станции переливания крови. Заготовку крови и получение из нее компонентов производили в соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию крови», утвержденной МЗ РФ 29.05.1999 г. Эритроцитарная масса хранилась при T=4 °С в течение 7, 14, 21 и 30 суток.
Эритроцитарную массу (2 мл) смешивали с озонированным раствором натрия хлорида 0,9% в эквивалентном объеме, содержащем различные концентрации озона (0,5-11 мг/л). Озонирование физиологического раствора производили на установке озонатор-ной терапевтической автоматической УОТА-60-01-«Медозон» (Россия). Установка изготовлена в соответствии с ТУ 9444-001-11441871-97 и может быть использована в медицинских учреждениях. Озонирование физиологического раствора производили непосредственно перед смешиванием его с эритроцитарной массой и через 60 мин в полученной эритроцитар-ной взвеси определяли концентрации АТФ и 2,3-ДФГ. При исследовании действия каждой концентрации озона
было проведено 12 проб. Содержание 2,3-ДФГ и АТФ в суспензии отмытых эритроцитов исследовали неэнзима-тическим методом, определяя неорганический фосфор в гидролизатах эритроцитов [3]. Определение неорганического фосфора проводили фо-тоэлектрокалориметрически [10].
Полученные данные были обработаны с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel с использование методов одномерной статистики. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.
Результаты и их обсуждение
В ходе проведенного исследования было установлено, что озонирование эритроцитарной массы разных сроков
хранения вызывало изменение концентрации АТФ и 2,3-ДФГ как в зависимости от действующей концентрации озона, так и от сроков хранения эритроцитов (табл. 1, табл. 2).
Как следует из табл. 1, увеличение концентрации АТФ в эритроцитах было наиболее выраженным при действии концентрации озона 1-3 мг/л в сроки 7-21 сутки хранения эритроцитарной массы. Дальнейшее увеличение концентрации озона, также как и хранение эритроцитов 30 суток, было менее эффективным.
Аналогичные изменения были зарегистрированы при анализе содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах (табл. 2). Дозы озона в диапазоне концентраций 1-5 мг/л приводили к увеличению концентрации 2,3-ДФГ в эритроцитах при сроках хранения эритроцитарной массы 7-21 суток.
Таблица 1
Изменение концентрации АТФ в эритроцитарной массе разных сроков хранения при
ее озонировании
Концентрация озона (мг/л) Содержание АТФ (мкмоль/мл) в зависимости от сроков хранения эритроцитарной массы
7 суток 14 суток 21 сутки 30 суток
0 0,86±0,08 0,75±0,10 0,54±0,10 0,46±0,15
0,5 1109±0,10* 0,60±0,14 0,52±0,12 0,33±0,14
1 1,12±0,09* 1,09±0,13* 1,05+0,10* 0,49±0,11
3 1,02±0,10* 1,13±0,12* 1,06±0,14* 0,21±0,16
5 0,99±0,08 1,08±0,11* 0,72±0,16 0,25±0,08
7 0,97±0,12 0,92±0,16* 0,89±0,13* 0,24±0,08
9 0,88±0,15 0,80±0,13 0,65±0,15 0,24±0,09
11 0,74±0,16 0,60±0,17 0,73±0,17 0,20±0,11
Примечание: 0,9-1,2 мкмоль/мл - норма содержания АТФ [6].
* - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем (концентрация озона в смеси 0 мг/л).
Примечание: 3,6-5,0 мкмоль/мл - норма содержания 2,3ДФГ [6].
* - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем (концентрация озона в смеси 0 мг/л).
Таблица 2
Изменение концентрации 2,3ДФГ в эритроцитарной массе разных сроков хранения
при ее озонировании
Концентрация озона (мг/л) Содержание 2,3ДФГ (мкмоль/мл) в зависимости от сроков хранения эритроцитарной массы
7 суток 14 суток 21 сутки 30 суток
0 2,07±0,16 2,17±0,14 1,73±0,15 1,69±0,18
0,5 3,41±0,17* 2,85±0,15* 1,87±0,12 1,83±0,16
1 3,54±0,11* 2,97±0,13* 2,06±0,16* 1,90±0,20
3 3,73±0,15* 2,86±0,12* 1,99±0,13* 1,53±0,22
5 3,40±0,14* 2,88±0,13* 1,89±0,16* 1,58±0,17
7 2,39±0,17 2,59±0,15* 1,83±0,16 1,65±0,16
9 2,16±0,16 2,18±0,16 1,51±0,26 1,70±0,19
11 1,72±0,18 2,32±0,12 1,71±0,14 1,63±0,19
При низких концентрациях озона (в пределах содержания озона в физиологическом растворе 1-5 мг/л) регистрировался максимальный уровень 2,3-ДФГ в эритроцитарной массе 7-, 14- и 21-суточного срока хранения, тогда как высокие концентрации озона в смеси не вызывали статистически значимых изменений данного показателя по сравнению с исходными значениями. При увеличении срока хранения эритроцитарной массы (30 суток) озон не вызывал увеличения содержания в ней 2,3-ДФГ при всех режимах озонирования.
Из полученных результатов следует заключить, что применение озонирования хранящейся массы эритроцитов увеличивает срок их хранения, приводя к восстановлению уровня АТФ и 2,3-ДФГ при действии в определенных дозах и сроках хранения. Наблюдаемые эффекты действия озона на содержание в эритроцитах АТФ и 2,3-ДФГ, вероятно, можно объяснить модифицирующим
действием озона на метаболизм эритроцитов. При этом можно предположить, что дополнительно активируются ферменты гликолиза. Показано, что при озонотерапии происходит усиление гликолиза, снижается ацидоз клеток [11]. В свою очередь, реализация такой активизации может быть обусловлена снижением уровня молекулярных продуктов ПОЛ и усилением антиоксидантной системы защиты, установленных при действии озона на кровь in vitro [5].
Выводы
Полученные результаты свидетельствуют, что при действии озона в малых концентрациях улучшается кислород-транспортная функция эритроцитов, как за счет увеличения концентрации 2,3-ДФГ, так и за счет роста содержания АТФ. Наиболее оптимальной концентрацией, на наш взгляд, является доза озона 1-3 мг/л, при которой регистрируется рост обеих форм органического фосфата.
Список литературы
1. Брызгалов Н.Ю. и др. Роль цито-плазматических структур эритроцитов в изменение сродства гемоглобина к кислороду / Браже Н.А., Юсипович А.И., Максимов Г.В., Рубин А.Б. // Биофизика. 2009. Т. 54. №
3. С. 442-447.
2. Буланов А.Ю., Городецкий В.М. Протокол терапии острой кровопотери: основные положения // Вестник интенсивной терапии. 2004. № 5. 193 с.
3. Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю., Дервиз Г.В. Метод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах // Лаб. дело. 1980. № 7. С. 424-426.
4. Гаврилин С.В., Герасимов Г.Л., Бо-яринцев В.В. Некоторые спорные вопросы трансфузионной терапии у раненых и пострадавших // Анестезиология и реаниматология. 2005. №
4. С. 40-42.
5. Гречканев Г.О., Конторщикова К.Н., Качалина Т.С. Экспериментальное обоснование озонотерапии акушерских осложнений // Ниж. мед. ж. 2002. № 1. С. 68-71.
6. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства. - М.: Наука. 1975. 240 с.
7. Катюхин Л.Н. Реологические свойства эритроцитов. Современные методы исследования // Росс. физиол. ж. им. И.М.Сеченова. 1995. Т. 81. № 6. С.122-129.
8. Кожура В.Л., Новодержкина И.С., Кирсанова А.К. Острая массивная кровопотеря: механизмы компенсации и повреждения // Анестезиология и реанимация. 2002. № 6. С. 9-12.
9. Колосков А.В. Современные представление о показаниях для транс-
фузии эритроцитарных компонентов крови // Гематология и трансфузио-логия. 2004. № 6. С. 38-42.
10. Кондрашова М.Н., Лесогорова М.Н., Шноль С.Э. Метод определения неорганического фосфата по спектрам поглощения молибдато-вых комплексов в ультрафиолете // Биохимия. 1965. № 3. С.567-572.
11. Фисталь Э.Я., Носенко В.М. Патогенетическое обоснование парентерального применения озона при неотложных состояниях в комбусти-ологии // Медицинские неотложные состояния. 2007. № 3. С. 86-89.
12. D'Almeida M.S., et al. A comparison of biochemical and functional alterations of rat and human erythrocytes stored in CPDA-1 for 29 days: implications for animal models of transfusion / Jagger J., Duggan M., White M., Ellis C., Chin-Yee I.H. // Transfus Med. 2000. № 10. Р. 291-303.
13. Jensen F.B. Red blood cell pH, the Bohr effect and other oxygenation-linked phenomena in blood O2 and CO2 transport // Acta Physiol. Scand.
2004. V. 182. Р. 215-223.
14. Koch C.G.,LiL.,Duncan A.I. Morbidity and mortality risk associated with red blood cell and blood-component transfusion in isolated coronary artery bypass grafting // Crit Care Med. 2006. № 34. Р. 1608-1616.
15. Kuduvalli M., Oo A.Y., Newall N. Effect of peri-operative red blood cell transfusion on 30-day and 1-year mortality following coronary artery bypass surgery // Eur. J. Cardiothorac Surg.
2005. № 27. Р. 592-598.
16. Mattecci E., et al. Erythrocyte ATPase enzymes family in normal people / Cocci F., Pellegrini L., Gre-
gori G., Navalesi R., Giampietro O. // Eur. J. Clin. Jnvest. 1992. V.22. № 4. P. 11-18.
17. Rokitanscy O. Clinical considerations and biochemistry of ozone therapy // Hospitalis. 1982. № 52. P. 643-647.
18. Tinmouth A., et al. Clinical consequences of red cell storage in the critically il l/ Fergusson D., Yee I.C., He-
bert P.C. // Transfusion. 2006. № 46. P. 2014-2027.
19. Wojcicki W.E., Beth A.H. Structural and binding properties of the stilbene-disulfonate sites on erythrocyte bands 3: an electron paramagnetic resonance study using spin-labeled stilbenedisul-fonates // Biochem. 1993. V.32. № 36. P. 9454-9464.
Contents of ATP and 2,3-DPG in erythrocytes for preservation and ozone exposure
V.N. Krylov, A.V. Deryugina, I.S. Simutis, G.A. Boyarinov, А.I. Senyurina
The effect of ozone at a dosage range of 0.5-11 mg/l in experiments in vitro on different erythrocyte mass storage periods. Found that low concentrations of ozone (1-3 mg/l) increased the content of ATP and 2,3-DPG in red blood cells in terms of their storage 7-21 day. Increasing the concentration of ozone was less effective. When red cell storage time to 30 days did not cause any increase in ozone concentration of ATP and 2,3-DPG.
Key words: ozone, the red blood cells of different storage periods, ATP, 2,3-DPG.
