CC BY
211
БИОЛОГИЧЕСКИЕ
НАУКИ
НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ, №2, 2016
удк 577.16.087 Бондарева Н.И. [Bondareva N.I.], Митина С.С. [Mitina S.S.], Аванесян С.С. [Avanesyan S.S.], Тимченко Л.Д. [Timchenko L.D.]
СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И РУТИНА В ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ЖИДКОСТИ ЧАЙНОГО ГРИБА (MEDUSOMYCES GYSEVII) ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Contents ascorbic acid and rutin in enzymatic culture of kombucha (Medusomyces gysevii) under different conditions of cultivation
В настоящее время остается актуальным поиск природных источников витаминов. В качестве потенциального сырьевого объекта для получения витаминов С и Р, в данной статье рассматривается симбионт микробного происхождения - Medusomyces gysevii (чайный гриб). Учитывая факт наличия высокого адаптационного потенциала симбионта, с целью влияния на способность чайного гриба синтезировать те или иные биологически активные вещества можно варьировать условия его культивирования, путем подбора питательных сред и продолжительности выращивания. Микробный симбионт культивировался до 395 суток на стандартной питательной среде на основе черного чая, а также на средах с его заменой и комбинированием с Мелиссой лекарственной (Melissa officinalis), Дубом череш-чатым (Quercus robur), Черникой обыкновенной (Vaccinium myrtillus), Каллизией душистой (Callisia fragrans). Выявлено наибольшее содержание исследуемых витаминов при культивировании Medusomyces gysevii на питательных средах с Черникой обыкновенной и сахарозой, Каллизией душистой с черным чаем и сахарозой, Дубом черешчатым и сахарозой. Наиболее оптимальным сроком культивирования чайного гриба являются 10 сутки.
Ключевые слова: аскорбиновая кислота, рутин, чайный гриб, микробный симбионт, Medusomyces gysevii, питательные среды. At present it remains relevant to the search for natural sources of vitamins. This article discusses the microbial symbiont origin - Medusomyces gysevii (Kombucha) as a potential resource object to get vitamins С and P. Given the high adaptive potential of the symbiont, for the purpose of influencing the ability of Kombucha to synthesize certain biologically active substances can be varied the conditions of its cultivation, by selection of nutrient medium and duration of cultivation. Microbial symbiont cultivated to 395 days in standard culture medium, on the basis of black tea, as well as on media with his replacement and the combination with Lemon balm (Melissa officinalis), Pedunculate oak (Quercus robur), Common bilberry (Vaccinium myrtillus), Callisia fragrans (Callisia fragrans). The highest content of the studied vitamins at the Medusomyces gysevii cultivation on nutrient media with Common bilberry with sucrose, Callisia fragrans with black tea and sucrose, Pedunculate oak with sucrose. The most optimal time of cultivation of Kombucha are 10 days.
Key words: ascorbic acid, rutin, Kombucha, microbial symbiont, Medusomyces gysevii, culture media.
Введение
Витамины - низкомолекулярные органические соединения, выполняющие множество функций, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность живой системы.
Организм человека не способен самостоятельно синтезировать витамины (кроме витамина D) и запасать их впрок. Некоторые витамины могут синтезироваться бактериальной флорой кишечника, однако эти количества не покрывают потребностей организма в них [2]. Поэтому витамины должны регулярно поступать с пищей, в полном наборе и количествах, соответствующих физиологическим потребностям организма человека [20]. Для каждого витамина установлена своя суточная доза потребления. Однако если количество поступающих с пищей витаминов ниже суточной нормы на протяжении длительного времени, то постепенно развивается состояние, называемое гиповитаминозом [6].
Для профилактики и лечения подобных состояний обычно рекомендуется принимать витаминные препараты, которые на сегодняшний день представлены в широком ассортименте, как в виде moho-, так и поликомпонентных комплексов.
Известно несколько способов получения витаминов [30]:
- выделение витаминов из натуральных продуктов (овощей, фруктов, растений);
- синтез различными микроорганизмами;
- кристаллизация витаминов;
- воссоздание и синтез химической структуры витамина в лабораторных условиях.
Существует мнение, что именно способ получения может обусловливать некоторые различия свойств витаминных препаратов. Все большей критике в научных исследованиях на сегодняшний день подвергаются синтетические витамины - под сомнение ставится уже не только способность к их ассимиляции организмом, но и вопрос потенциальной пользы или же, наоборот, возможного риска. В любом случае,
синтетический витамин не может заменить натуральный [19]. Так, при применении препаративных форм витаминов, особенно синтетического происхождения, необходимо учитывать данные о дозозависимой токсичности некоторых из них [21].
Кроме того любой из вышеуказанных способов синтеза витаминных препаратов предполагает получение одного конкретного витамина, при комбинировании которых получают и поливитаминные препараты, представленные в аптечной сети. При этом все больше специалистов высказывают мнение о несовершенстве последних, обусловленном погрешностями при подборе составных компонентов поливитаминного комплекса, зачастую без учета специфики взаимодействия витаминов друг с другом [5].
Поэтому поиск богатых сырьевых источников комплекса натуральных витаминов, имеющихся в аптечной сети, выступающих во взаимодействии при влиянии на живой организм, остается актуальным.
В качестве такого источника потенциально выступает чайный гриб {Мес1тотусен gy.se 1'И) - микробный симбионт, образованный уксуснокислыми бактериями и дрожжами [27, 28, 29]. Доказано, что как дрожжи, так и уксуснокислые бактерии могут участвовать в синтезе витаминов. Одни дрожжи сами синтезируют витамины, а другие нуждаются в них, благодаря чему могут образовывать симбиоз, как между собой, так и с бактериями [17]. Ввиду огромного перечня микроорганизмов, образующих симбионт, для каждого из которых характерен индивидуальный тип метаболизма, образованная ими ферментативная жидкость и зооглея отличаются богатейшим составом биологически активных веществ, где они естественным образом, с учетом их химической природы сбалансированы в оптимальном качественном и количественном соотношении. Из литературных источников известно что в ферментативной жидкости чайного гриба содержится витамин С [16].
Витамин С играет колоссальную роль в организме человека. Он необходим для синтеза дентина зубов, оссеина костей, образования прокол-лагена и перехода его в коллаген, эндотелия сосудов, костной и соедини-
тельной ткани. Аскорбиновая кислота участвует во всасывании железа из кишечника и освобождении железа из связи его с транспортным белком крови - трансферрином, облегчая поступление этого металла в ткани. Так же она может включаться в работу дыхательной цепи митохондрий, являясь донором электронов для цитохрома С, способна непосредственно предотвращать нитрозаминовый канцерогенез, способствует выработке организмом антител и стимулирует фагоцитарную активность лейкоцитов [9, 31]. Соединяясь с витамином С, ядовитые вещества обезвреживаются и выводятся с мочой [32]. Будучи антиоксидантом витамин С оказывает сберегающее действие на другие антиоксиданты (витамин Е, |3-каротин), защищая их от разрушения свободными радикалами и способствует регенерации витамина Е [9].
Многими авторами показана связь в механизме физиологического действия между аскорбиновой кислотой и биофлавоноидами, к числу которых относится рутин. Характер этой связи заключается в способности флавоноидных веществ усиливать биологическое действие аскорбиновой кислоты [5]. Известно, что витамин Р (рутин) защищает витамин С от ионов тяжелых металлов [8]. Рутин способствует снижению уровня холестерина в крови, проявляет высокую антиоксидантную активность и применяется в лечении многих заболеваний, действует как противоязвенное, противовоспалительное, антиаллергическое, противоопухолевое, радиопротекторное, желчегонное средство, а также является ангиопротек-тором [7, 13, 22, 23]. Прием рутина необходим при ревматизме, септическом эндокардите, лучевой болезни, аллергических реакциях, а также при ретинопатии, у лиц, страдающих гипертонией, атеросклерозом, сахарным диабетом [8]. Однако на сегодняшний день нет достоверных данных о количественном содержании в культуральной жидкости чайного гриба витамина Р. Кроме того, до сих пор нет четких рекомендаций по условиям и срокам культивирования, составу питательных сред, обеспечивающих получение максимально возможного количества витамина С.
Учитывая тот факт, что симбионт МеёщхшусЩ ^шШ (чайный гриб) обладает высоким адаптационным потенциалом [24], при подборе
питательных сред для культивирования чайного гриба можно варьировать их компоненты. В результате химический состав питательной среды отражается на способности чайного гриба синтезировать те или иные биологически активные вещества [3]. Это обуславливает возможность биотехнологического подхода для получения и совершенствования сырья, наиболее богатого необходимыми витаминами.
В связи с вышеизложенным, актуальным является подбор питательных сред и сроков культивирования, оптимальных для получения наибольшего, биотехнологически оправданного количества витаминов С и Р, синтезируемых при культивировании чайного гриба (Medusomyces gysevii).
Материалы и методы исследования
Для проведения эксперимента были приготовлены следующие варианты питательных сред с добавлением различных компонентов:
№ 1 черный чай (Camellia synensis) - сахароза;
№ 2 листья Мелиссы лекарственной (Melissa officinalis•) - сахароза;
№ 3 листья Мелиссы лекарственной - черный чай - сахароза;
№ 4 листья Дуба черешчатого {Onerous robur) - сахароза;
№ 5 листья Дуба черешчатого - черный чай - сахароза;
№ 6 плоды Черники обыкновенной (Vaccinium myrtilitis) - сахароза;
№ 7 плоды Черники обыкновенной - черный чай - сахароза;
№ 8 листья Каллизии душистой (Callisia fragrans) - сахароза;
№ 9 листья Каллизии душистой - черный чай - сахароза.
Классическую питательную среду (№ 1) для культивирования Medusomyces gysevii готовили по традиционному рецепту [3, 14, 15]. Среды с альтернативами черного чая готовились по аналогичному рецепту, с заменой черного чая и его комбинированием с Мелиссой лекарственной (Melissa officinalis) (№ 2, 3), Дубом черешчатым (Quercus robur) (№ 4, 5), Черникой обыкновенной (Vaccinium myrtillus) (№ 6, 7), Каллизией душистой (Callisia fragrans) (№ 8, 9).
Обновление питательных сред на протяжении эксперимента не производилось.
Определение наличия витаминов С и Р в культуральной жидкости (.\Ieiinsomyces ^ухеуП) чайного гриба проводилось путем качественных реакций [11], начиная с 7 суток культивирования, вплоть до момента отсутствия изменений динамики содержания данных витаминов.
Количественное содержание витамина С (таб. 1) определяли по методу Тильманса [1]. Принцип метода основан на редуцирующей способности витамина. При его определении используют окислительно-восстановительную реакцию между аскорбиновой кислотой и 2,6-дихлорфено-линдофенолом в кислой среде.
Количественное определение витамина Р (таб. 2) проводили методом, предложенным И.К. Мурри, основанном на цветной реакции рутина с солями алюминия в присутствии избытка уксуснокислого калия [11].
Статистическая обработка полученных результатов проводилась в программе ВюэШ, версии 4.03 по критерию Стьюдента.
Результаты исследования
Предварительный анализ результатов качественных реакций (до 395 суток) по выявлению витаминов С и Р в культуральной жидкости (Мес1тотусен чайного гриба позволил установить сутки (10, 30, 90), на которые были зафиксированы наиболее значимые изменения исследуемых витаминов Не смотря на полученные весомые показатели количества витамина С на 395 сутки [16], проведение количественных реакций после 90 суток нецелесообразно из-за очень вялотекущей динамики прироста данного витамина. Такая же динамика была характерна и для рутина, при его качественном определении.
В результате количественного анализа установлено, что на 10 сутки культивирования по сравнению с контролем содержание витамина С было больше в ферментативной жидкости, полученной на основе питательных сред № 4 - на 50,7% (р<0,01), № 6 - на 93,2% (р<0,05), № 9 - на 49,3% (р<0,05) (табл. 1).
Табл. 1. СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ (мг/%)
В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ СИМБИОНТА НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ДОБАВЛЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ НА РАЗНЫХ СРОКАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (М±т)
№ варианта питательной Компоненты питательной среды Продолжительность культивирования
среды 10 сутки 30 сутки 90 сутки
1 НО) - черный чай - сахароза 0,73+0,13 0,77+0,14 0,86+0,12
2 (гИО) - листья Мелиссы лекарственной - сахароза 0,85+0,15 0,79+0,11 0,73+0,17
3 (п=10) - листья Мелиссы лекарственной - черный чай - сахароза 0,67+0,12 0,63+0,14 0,59+0,16
4 (п=10) - листья Дуба черешчатого - сахароза 1,10+0,11" 1,15+0,17 1,19+0,13
5 (п=10) - листья Дуба черешчатого - черный чай - сахароза 0,75+0,15 0,79+0,11 0,83+0,17
6 Но) - плоды Черники обыкновенной - сахароза 1,41+0,21* 1,39+0,15** 0,92+0,17
7 (п=10) - плоды Черники обыкновенной - черный чай - сахароза 0,96+0,13 0,91 ±0,10 0,89+0,15
8 (п=10) - листья Каллизии душистой -сахароза 0,72+0,15 0,95+0,14 0,65+0,13
9 (п=10) - листья Каллизии душистой - черный чай - сахароза 1,09+0,09* 1,08+0,04* 0,91 ±0,14
Статистически значимые различия (критерий Стьюдента) '* -достоверность по отношению к контролю (р<0,01) * - достоверность по отношению к контролю (р<0,05)
Табл. 2. СОДЕРЖАНИЕ РУТИНА (мг/%) В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ
ЖИДКОСТИ СИМБИОНТА НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ДОБАВЛЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ НА РАЗНЫХ СРОКАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
№ варианта питательной Компоненты питательной среды Продолжительность культивирования
среды 10 сутки 30 сутки 90 сутки
1 (п=10) - черный чай - сахароза 0,24±0,07 0,24±0,08 0,25+0,07
2 (п=10) ■ листья Мелиссы лекарственной - сахароза 0,31±0,11 0,28+0,10 0,24+0,11
3 Сп=1 о) - листья Мелиссы лекарственной - черный чай - сахароза 0,35+0,09 0,30±0,12 0,26+0,08
4 (п=10) ■ листья Дуба черешчатого - сахароза 0,18+0,09 0,15+0,05 0,10+0,03
5 (п=10) - листья Дуба черешчатого - черный чай - сахароза 0,19+0,07 0,17+0,06 0,13+0,04
6 (п=10) - плоды Черники обыкновенной - сахароза 0,46+0,07* 0,44±0,05* 0,43+0,11
7 (п=10) ■ плоды Черники обыкновенной - черный чай - сахароза 0,33+0,12 0,31 ±0,09 0,25+0,09
.28 (п=10) - листья Каллизии душистой -сахароза 0,29+0,11 0,27+0,12 0,22+0,10
9 (п=10) - листья Каллизии душистой - черный чай - сахароза 0,41 ±0,04* 0,38+0,04 0,33+0,08
Статистически значимые различия (критерий Стьюдента) -достоверность по отношению к контролю (р<0,05)
На 30 сутки наибольшее содержание витамина С по сравнению с контролем установлено при культивировании симбионта на средах № 6 -на 80,5% (р < 0,01), № 9 - на 40,3% (р < 0,05) (табл. 1).
На 90 сутки культивирования достоверных отличий количественного содержания витамина С по сравнению с контролем не было обнаружено ни в одной из всех ферментативных жидкостей, полученных с использованием различных вариантов питательных сред.
При индивидуальном рассмотрении динамики прироста аскорбиновой кислоты в процессе культивирования на каждом отдельном варианте питательной среды (10, 30, 90 сутки) достоверных отличий также не установлено.
Установлено, что содержание рутина на 10 сутки культивирования по сравнению с контролем было достоверно больше в ферментативной жидкости, полученной при использовании питательных сред № 6 - на 91,7% (р < 0,05) и № 9 - на 70,8% (р < 0,05) (табл. 2).
На 30 сутки достоверно большее содержание рутина по сравнению с контролем наблюдалось при культивировании МесЫхотуссх ^щеШ только на питательной среде № 6 - на 83,3% (р < 0,05) (табл. 2).
На 90 сутки, по сравнению с контролем, не обнаружено достоверных отличий количества витамина Р ни в одной из всех ферментативных жидкостей, полученных на основе различных вариантов питательных сред.
Анализ динамики прироста количества рутина при культивировании МеАшШусея ■ЩушШ на каждом из вариантов питательных сред на 10, 30, 90 сутки культивирования также не показал достоверных отличий.
Обсуждение результатов
Полученные результаты свидетельствуют о том, что на 10 сутки культивирования наибольшее содержание аскорбиновой кислоты наблюдалось на питательных средах на основе Дуба черешчатого и сахарозы, Черники обыкновенной и сахарозы, Каллизии душистой с черным чаем и сахарозы. В то же время большее, по сравнению с контролем коли-
чество рутина наблюдалось только на средах на основе Черники обыкновенной и сахарозы, Каллизии душистой с черным чаем и сахарозы.
Однако при сравнении с контролем количественного содержания этих витаминов на 30 сутки культивирования, достоверное их увеличение наблюдалось на средах с Черникой обыкновенной и сахарозой, Каллизией душистой с черным чаем и сахарозой.
Незначительные изменения динамики (10-90 сутки) количества данных витаминов при культивировании на вышеуказанных средах, указывают на то, что именно 10 сутки являются экономически оправданными для одновременного получения обоих витаминов в достаточном количестве.
Выводы
С учетом одновременного наличия аскорбиновой кислоты и рутина в достаточном количественном соотношении при культивировании на питательных средах на основе Черники обыкновенной и сахарозы, Каллизии душистой с черным чаем и сахарозы наиболее оптимальным сроком культивирования стали 10 сутки. Культивирование Mednsomyces gysevii на всех остальных вариантах питательных сред для получения данных витаминов существенных результатов не показало.
Исследование проведено при финансового поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базового части государственного задания (2014/216).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Афиногенова С.Г. Витамины. Учебно-методическое пособие для студентов биолого-химического факультета / С.Г Афиногенова, Э.А. Сидорская. Арзамас: АГПИ им. А.П. Гайдара. 1990. 65 с.
2. Борисова Е.О. Назначение витаминов во время беременности// Лечебное дело. Клиническая фармакология. №3. 2010. С. 20-29.
3. Веревкина, М.Н. Стимуляторы в макромире и микромире: методическое пособие / М.Н. Веревкина, А.Ф. Дмитриев // Ставрополь: Изд-во СтГАУ «АГРУС», 2004. 48 с.
4. Витаминные ресурсы и их использование // Спб.; М., 1955.
5. Витамины / Под редакцией М.И. Смирнова // Медицина. 1974.
6. Витамины и здоровье / Под редакцией проф., доктора мед. наук А.К. Батурина / Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации. 2009.
7. Георгиевский В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комисаренко, С.Е. Дмитрук. Новосибирск: Изд-во «Наука», 1990. 144 с.
8. Гнеушева И.А. Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи и получение ценных продуктов / И.А. Гнеушева: дис. ... на соиск. уч. степ. канд. технич. наук. Воронеж.
2014. 143 с
9. Горбачев В,В. Витамины, микро- и макроэлементы. Справочник/ В.В. Горбачев, В.Н. Горбачева. Минск: Книжный дом; Ин-терпрессервис. 2002. 544 с.
10. Девис М. Витамин С: химия и биохимия / М. Девис, Дж. Остин, Д. Патридж//'Пер. с англ. Медицина. М., 1999.
11. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков, В.В. Арасимович, М.И. Смирнова-Иконникова, Н.П.Ярош, ГА. Луковникова//Изд. 2-е. Ленинград: Колос, 1972. 456 с.
12. Ишунина Т.А. Влияние аскорбиновой кислоты на морфологические показатели печени морских свинок в норме и при заживлении раны в области брюшной стенки // Фундаментальные и прикладные исследования: проблемы и результаты. 11. 2014. С. 38-43.
13. Ковтун Г.А. Реакционная способность взаимодействия феноль-ных антиоксидантов с пероксильными радикалами // Катализ и нефтехимия. 2000. №4. С. 1-9.
14. Митина С.С. Влияние условий выращивания Medusomuces gysevii на витаминный состав культуральной жидкости / С.С. Митина, И.В. Ржепаковский, Н.И. Бондарева // Биоразнообразие, биоресурсы, биотехнологии и здоровье населения Северо-Кавказского региона: мат-лы II ежегодной научно-практ. конф. «Университетская наука региону» (7-28 апреля 2014г.). Ставрополь, 2014. С. 153-159.
15. Митина С.С. Измерение показателей биологической активности культуральной жидкости чайного гриба (Medusomyces gysevii) в процессе культивирования / С.С. Митина, С.С. Аванесян, Н.И. Бондарева, Л.Д. Тимченко // Биоразнообразие, биоресурсы, биотехнологии и здоровье населения Северо-кавказского региона: мат-лы III ежегодной научно-практ. конф. «Университетская наука региону» (14-30 апреля 2015 г.). Ставрополь,
2015. С. 203-208.
16. Митина С.С. Влияние состава питательной среды на коли-
чество витамина С в культуральной жидкости симбионта (Medusomyces gysevii) / С.С. Митина, Н.И. Бондарева, С.С. Ава-несян, М.Н. Сизоненко // В сборнике: Физико-химическая биология, 2015. С. 113-116.
17. Неумывакин И.П. Чайный гриб - природный целитель. Мифы и реальность // СПб.: Изд-во «ДИЛЯ». 2007. 160 с. ISBN: 978-588503-307-7.
18. Ольгин О. Опыты без взрывов. М.: Химия, 1986. 130 с.
19. Полинг Л. Витамин С и здоровье. М: Изд-во: «Наука». 1975. 80 с.
20. Разумов А.С. Биохимические и клинические аспекты современной витаминологии: уч. пособие и тест-задания для интернов и ординаторов КемГМА. Кемерово, 2013. 220 с.
21. Скарборо Г., Бахарах А. Витамин Р // Сборник Биохимия и физиология витаминов, пер. с англ. М., 195. 2. С. 7.
22. ТурА.Ф. Рахит//Л.: Медицина, 1966. 172 с.
23. Цимбалюта Н.В. Ппешчна оцЫка piBHiB споживання основних груп харчових продукта населениям Украши дм' / Н.В. Цимбалюта // Проблеми харчування. 2008. № 1-2. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.medved.kiev.ua.
24. Юркевич, Д.И. Метод 1Н ЯМР спектроскопии в исследовании экзометаболитов развивающихся микроорганизмов: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.02 / Юркевич Дмитрий Иосифович - Пущине. 2002. 201 с.
25. Яковлева Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия. Спб.: СпецПит. - 2006. - 845 с.
26. Ahmed S. Induction of xylanase and cellulose genes from Trichoderma harzianum with different carbon sources / S. Ahmed, A. Quart, A. Night, N. Saima, R. Spayed, J. Amery // Pak. J. Biol. Sic. 2003. 6. P. 1912-1916.
27. Cathcart R. Unique function of vitamin С // Med Hypothes. Vol. 35. 1991. P. 32-37.
28. Malbasa R. Sucrose and inulinbalance during tea fungus fermentation / R. Malbasa, E. Loncar and Lj. Kolarov // Roum Biotechnol Lett. 7(1). 2002a. P. 573-576.
29. Petrovic S. Nutritive characteristics of tea fungus metabolites / S. Petrovic, E. Loncar, N. Ruzicand Lj. Kolarov/faculty of Technology, Novi Sad, Proceedings. - Vol. 26-27. - 1995-1996. - P. 257-269.
30. http://www.med007.ru/publ/genetika_i_gennaja_inzhenerija/ biotekhnologija_poluchenija_vitaminov/18-1-0-1547 (Дата обращения: 15 января 2016 года).
31. http://biochem.vsmu.edu.ua (Дата обращения: 2 ноября 2015).
32. http://www.scienceforum.ru (Дата обращения: 2 ноября 2015).
