CC BY
273
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 131-134.
УДК 54.056
СОДЕРЖАНИЕ АРТЕМИЗИНИНА В ЭКСТРАКТАХ ARTEMISIA ANNUA L., ПОЛУЧЕННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ*
© Т.Э. Соктоева1 , Г.Л. Рыжова2, К.А. Дычко2, В.В. Хасанов2, С.В. Жигжитжапова1’3, Л.Д. Раднаева1’3
1 Бурятский государственный университет, ул. Смолина, 24а, Улан-Удэ,
670000 (Россия), e-mail: [email protected]
2Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия)
3Байкальский институт природопользования Сибирского отделения РАН, ул. Сахьяновой, 8, Улан-Удэ,670047 (Россия)
Рассмотрены вопросы по выделению артемизинина из Artemisia annua L. и его количественному определению с помощью метода ВЭЖХ-МС. Выделение артемизинина проводили различными методами экстракции: мацерация, ультразвуковая и докритическая С02-экстракция. Методом ГХ-МС исследован компонентный состав С02- и гексанового экстрактов.
Ключевые слова: Atemisia annua L., артемизинин, экстракция, малярия.
Работа выполнена при поддержке РФФИгрант № 11-03-90705-моб_ст Введение
Артемизинин (1) - это пероксидный сесквитерпен [1], являющийся вы- ^
сокоэффективным противомалярийным препаратом и предшественником более H 3
сильнодействующих соединений, таких как артеметер, артесунат и некоторых других. Важность артемизинина и его производных основывается на очень быстром действии соединений данного типа против ее основного возбудителя Plazmodium falciparum, вызывающего к тому же заболевание мозга.
Химический и биохимический синтезы артемизинина показали себя весьма дорогостоящими и, следовательно, в настоящее время нежизнеспособными в качестве основного источника получения артемизинина [2].
Малярию вызывает микроорганизм - малярийный плазмодий. Различают 4 вида такого плазмодия, паразитирующего в теле человека: Plazmodium vivax, P. ovale, P. malariae и P. falciparum. В середине XX столетия благодаря широкому применению хинина и его производных удалось существенно снизить число больных малярией. Однако начиная с 60-х гг. прошлого века малярия снова напомнила о себе. Это было вызвано тем, что в Таиланде и Южной Америке появился и распространился по другим регионам малярийный плазмодий (P. falciparum), устойчивый к хинину, хлорокину, мефлокину и другим лекарствам, синтезированным на основе хинолина [3, 4]. Стала актуальной проблема поиска новых эффективных противомалярийных препаратов, среди которых был предложен артемизинин. Это уникальное соединение было открыто в Китае (китайское название qinghaosu). Работы были начаты в 1967 г. и названы «Программа 523» [5]. Его выделяют из полыни однолетней Atemisia annua L., которая распространена на территории бывшего СССР, охватывая районы Алтая, Забайкалья, Приамурья, Казахстана, Киргизии, Узбекистана и Туркменистана. Широко представлена полынь в Китае и других странах [6]. Общая сумма артемизинина, выделенного из разных частей A. annua, составляет около 0,01 и 1,4% от сухой массы листьев [2].
Данная статья имеет электронный дополнительный материал (приложение), который доступен читателям журнала по адресу: http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume15/2011_04/1104-131app.pdf.
Автор, с которым следует вести переписку.
Artemisia annua L. является основным сырьем для получения артемизинина. Всемирная организация здравоохранения в 2001 г. рекомендовала использовать артемизинин в терапии первой линии для борьбы с малярией, что привело к росту посевных площадей полыни однолетней. В основном выращивают полынь однолетнюю в Восточной Азии, главным образом в Китае и Вьетнаме (70% посевных площадей от мирового запаса), недавно ввели в культуру в Восточной и Южной Африке (20% посевных площадей от мирового запаса), что обеспечивает четверть потребности мирового здравоохранения [7].
Помимо артемизинина A. annua ценится за эфирное масло, которое имеет характерный сладкий, травянистый аромат и используется в парфюмерии и косметических изделиях. К тому же масло обладает антибактериальным свойством и может использоваться для лечения кожных заболеваний. Помимо сескви-терпеновых лактонов, которые имеют основное терапевтическое значение, эфирные масла этого растения содержит значительное количество компонентов, имеющих ценность, как например, 1,8-цинеол, артеми-зиевый спирт и кетон, борнеол и другое в последнее время был изучен жирнокислотный состав полыни однолетней, а также проанализировано физиологическое действие липофильных экстрактов на кожу [2].
В связи с богатым и разнообразным составом биологически активных веществ, содержащихся в Artemisia annua, большой интерес представляет поиск новых районов произрастания полыни однолетней. В Республике Бурятии произрастает 46 видов полыней [8], в том числе Artemisia annua L. Содержание артемизинина в полыни однолетней, произрастающей в Бурятии, ранее не было изучено. Поэтому целью данной работы стало количественное определение артемизинина в экстрактах, полученных различными методами экстракции.
Экспериментальная часть
Сырьем для исследования была выбрана надземная часть полыни однолетней Artemisia annua L., собранная в первой декаде августа 2010 г., в фазу цветения.
Выделение артемизинина и других биологически активных веществ (эфирное масло) проводили с применением различных методов экстракции: мацерация, ультразвуковая экстракция и докритическая С02-эктракция. Экстракция проводилась на лабораторных установках. В качестве экстрагентов использовали гексан, этилацетат, этанол и CO2. Данные и параметры экстракции приведены в таблице 1. Экстракты от осадка отделяли центрифугированием на центрифуге ОП-8УХЛ4.2 при 5000 об./мин, а затем фильтровали через систему фильтрации образцов.
Количественное содержание артемизинина определяли методом ВЭЖХ-МС с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа марки «Finnigan Surveyor», оснащенного автосамплером «autosampler Plus» и насосом «LC Pump Plus», с масс-селективным детектором «LCQ Advantage МАХ» (ионная ловушка) марки «Finnigan», способ ионизации - электроспрей. Колонка «Hypersyl Gold» 150*4 мм, заполненная сорбентом на основе силикагеля с привитыми фазами С18 (размер частиц 5 мкм), (производство Thermo electronic corporation, США). Элюирование проводили в изократическом режиме (50%(А) : 50%(Б)), состав стартового буфера (А) - водный раствор муравьиной кислотой, (рН=3) + 2 мл насыщенного раствора ацетата аммония, элюирующего буфера (Б) - 100% ацетонитрил. Объемная скорость потока элюента - 0,5 мл/мин, объем вводимой пробы (автосамплером) 25 мкл. Регистрация ионов проводилась в режиме мониторинга положительно заряженных ионов (Selected Ion Monitoring, SIM), с молекулярной массой 300 (за счет присоединения к молекуле артемизинина иона аммония NH4+) с шириной окна (299-301) m/z. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с использованием государственного стандартного образца фирмы Sigma.
Таблица 1. Методы и параметры экстракции
№ п/п Метод экстракции Экстрагент Время экстракциии / параметры экстракции Содержание артемизинина в %, в пересчете на а.с.с.
1 Мацерация этанол 24 ч / соотношение сырье : растворитель (1 : 5) 0,040±0,002
2 Мацерация этанол 48 ч / соотношение сырье : растворитель (1 : 5) 0,038±0,002
3 Мацерация гексан 24 ч / соотношение образец : растворитель (1 : 5) 0,039±0,002
4 УЗ-экстракция этанол 15 мин / соотношение сырье : растворитель (1 : 5), частота озвучивания 50 Гц, Т=25 °С 0,039±0,002
5 УЗ-экстракция этилацетат 15 мин / соотношение сырье : растворитель (1 : 5), частота озвучивания 50 Гц, Т=25 °С 0,022±0,001
6 С02-экстракция со2 24 ч / скорость потока 30 л/ч, Т=20-22 °С, Р=6,0-6,2 МПа 0,054±0,003
В электронном приложении к статье приведены хроматограммы артемизинина, по полному ионному току в режиме SIM.
Дополнительно были исследованы легколетучие компоненты С02- и гексанового экстрактов методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 с квадрупольным детектором MSD 5973N. В работе использовали 30-метровая кварцевая колонка TR-5 ms с внутренним диаметром d = 0,25 мм, толщина пленки 0,25 цм. Хроматографическое разделение проводили так, как описано в [9]. Качественно компоненты экстрактов определяли, сравнивая полные масс-спектры с данными библиотеки хромато-масс-спектрометрических данных летучих веществ растительного происхождения A.B. Ткачева, библиотек NIST 08 и Wiley 275. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2. Основные компоненты С02- и гексанового экстрактов
Соединения Площадь пика относительная Соединения Площадь пика относительная
Сй2-экстракт гексановый экстракт С02-экстракт Гексановый экстракт
Монотерпеноиды Длинноцепочечные углеводороды
Трицикл ен 140181 - Трикозан 103969 52288
а-пинен 1155320 - Трикозен-1 1956324 -
Камфен 2021028 - н-пентакозан 534763 110485
ß-пинен 371548 - н-гептакозан 279800 132358
3-карен 1683858 - Циклические углеводороды
Лимонен 645634 - Пентацикло 576196 -
ß-фелландрен 587143 - [7.5.0.0(2,8).0(5,14)0.
1,8-цинеол 133599 - (7,11)]тетрадекан
Артемизиа кетон 1413437 - 1,8-диметилфенантрен 3765681 1080289
Борнеол 170158 - Флюорен 3507465 319501
Борнилацетат 707945 - Дитерпеноиды
Сесквитерпеноиды Метил 3,5- 627581 283913
Кариофиллен 370714 - бис(этиламино)бензоат
Окись кариофиллена 214560 -
Гермакрен Д 214913 -
ß-селинен 3053333 328535
а-кадинол 149485 -
Обсуждениерезулътатов
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, наименьший выход артемизинина составил (0,022%) при ультразвуковой экстракции этилацетатом. Содержание артемизинина в экстрактах, выделенных ультразвуковой экстракцией и мацерацией, с использованием различных растворителей (гексана, этилового спирта) существенно не отличается 0,038-0,040% в пересчете на а.с.с. При настаивании этиловым спиртом полыни однолетней 24 и 48 ч содержание артемизинина в полученных экстрактах примерно одинаково 0,040 и 0,038% соответственно. Наибольший выход артемизинина (0,054%) получен при докрити-ческой С02-экстракции. Для сравнения приведем некоторые данные о содержании артемизинина, в полыни однолетней, произрастающей на различных территориях. В Artemisia annua L., произрастающей в различных районах Китая, содержится от 0,01 до 0,22% артемизинина. В некоторых гибридах полыни однолетней, культивируемых в Китае и во Вьетнаме содержится от 1,0-1,5% артемизинина [10]. Содержание артемизинина в A. annua, произрастающей на территории бывшего СССР, следующее (значения приводятся в пересчете на воздушно-сухое сырье): Грузинская ССР (0,005%), Киргизская ССР (0,025%), Молдовская ССР (0,01-0,02%), Краснодарский край (0,04%), Украинская ССР (0,005-0,05%), Туркменистан (0,05% в пересчете на а.с.с.), Казахстан (0,01-0,05% в пересчете на а.с.с.) [11].
При исследовании состава экстрактов полыни однолетней, полученных С02-экстракцией и мацерацией, когда в качестве экстрагента использовали гексан, методом хромато-масс-спектрометрии обнаруживаются значительные различия в составе этих экстрактов (табл. 2). Методом хромато-масс-спектрометрии обнаруживаются монотерпеноиды, сесквитерпеноиды, длинноцепочечные углеводороды, циклические углеводороды и дитерпеноиды.
Монотерпеноиды обнаружены только в С02-экстракте. Основными компонентами С02-экстракта являются а-пинен, 3-карен, артемизиа кетон, р-селинен, трикозен-1, 1,8-диметилфенантрен и флюорен.
В гексановом экстракте полыни однолетней методом хромато-масс-спектрометрии идентифицированы в основном длинноцепочечные углеводороды и циклические углеводороды, из сесквитерпеноидов был обнаружен р-селинен.
Помимо артемизинина, который представляет основное лекарственное значение, эфирное масло содержит большое количество компонентов, имеющих биологическую ценность, как, например, артемизиа кетон, 1,8-цинеол, борнеол и др. (табл. 2).
Выводы
1. Методом ВЭЖХ-МС определено содержание артемизинина в различных экстрактах A. annua (надземная часть, фаза цветения), произрастающей на территории Республики Бурятии.
2. Максимальное содержание артемизинина обнаружено в С02-экстракте (0,054% в пересчете на а.с.с.),
3. С помощью хромато-масс-спектрометрии изучен состав эфирного масла, выделенного различными методами экстракции.
Электронный дополнительный материал
В качестве приложения к статье в электронном дополнительном материале (http://www.chem.asu.ru/ chemwood/volume15/2011_04/1104-131app.pdf) приведены хроматограммы артемизинина, обсуждаемые в статье.
Список литературы
1. Племенков В.В. Химия изопреноидов. Барнаул, 2007. 321 с.
2. Lapkin A.A., Plucinski P.K., Cutler M. Comparative assessment of technologies for extraction of artemisinin // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. Pp. 1653-1666.
3. Бородулина Б.В. Медицинский энциклопедический словарь. М., 2002. 704 c.
4. Xiao Wang, Xian-en Zhao, Bin Yang, Hongjing Dong, Dahui Liua, Luqi Huanga. A combination of ultrasonic-assisted extraction with RRLC-QQQ method for the determination of artemisinin in the Chinese herb Artemisia annua L. // Phytochem. Anal. 2011. V. 22. Pp. 280-284
5. Денисов E.T., Солодова С.Л., Денисова Т.Г. Радикальная химия артемизинина // Успехи химии. 2010. Т. 79, №11. С. 1065-1088.
6. ТолстиковаТ.Г., ТолстиковА.Г., Толстиков Г.А. Лекарстваизрастительныхвеществ. Новосибирск, 2010. 215 с.
7. Ferreira J.F., Luthria D.L. Drying affects artemisinin, dihydroartemisinic acid, artemisinic acid, and the antioxidant capacity of Artemisia annua L. leaves // J. Agric. Food Chem. 2010. V. 58. Pp. 1691-1698
8. Определитель растений Бурятии / под ред. О.А. Аненхонова. Улан-Удэ, 2001. 533 с.
9. Ткачев А.В., Королюк Е.А., Юсубов М.С., Гурьев А.М. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья // Химия растительного сырья. 2001. №1. С. 19-30.
10. Ferreira J.F.S., Laughlin J.C., Delabays N., Magalha P. M. Cultivation and genetics of Artemisia annua L. for increased production of the antimalarial artemisinin // Plant Genetic Resources. 2005. V. 3, N2. Pp. 206-229
11. Шретер А.И., Рыбалко K.C., Коновалова O.A., Деревинская Т.И., Майсурадзе Н.И., Макарова Н.В. Содержание артемизинина в Artemisia annua L. // Растительные ресурсы. 1989. Вып. 1. С. 66-72.
Поступило в редакцию 24 июня 2011 г.
После переработки 18 сентября 2011 г.
