Научная статья на тему 'Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири'

Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

CC BY
125
37
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству, автор научной работы — Третьякова И.Н., Барсукова А.В., Савельев С.С., Сиренко А.С.

В результате опытов по гибридизации кедра сибирского на клоновой прививочной плантации были получены шишки первого поколения с высокой семенной продуктивностью. Выявлены комплементарные признаки между родительскими генотипами, приводящие к гетерозису. Введением изолированных зародышей кедра сибирского и лиственницы сибирской в культуру in vitro путем подбора состава питательных сред была получена эмбриональносуспензорная масса, соматические зародыши и регенеранты. Наиболее активным ростом обладала эмбриогенная масса гибридных семян, полученная от гетерозисных деревьев опылителей с однолетним циклом развития женских шишек. Определены генотипы донорных растений лиственницы сибирской и кедра сибирского, способные давать чистые эмбриогенные линии, соматические зародыши и регенеранты.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству , автор научной работы — Третьякова И.Н., Барсукова А.В., Савельев С.С., Сиренко А.С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Combination of classical breeding and application of modern methods of biotechnology for gene preservation of Siberian conifer species

As a result of hybridization experiments with Pinus sibirica on clonally grafting plantation, cones of first generation with high seed productivity have been obtained. It is shown complimentary characteristics between parental genotypes which leads to heterosis. Embryonal suspensor masses, somatic embryo and plant regeneration from zygotic embryos of Siberian pine and Siberian larch in culture in vitro have been obtained by selection of culture medium composition. Embrional masses of hybrid seeds from heterosis trees with annual cycle development of female cone have active growth. Genotypes of donor plants of Siberian larch and Siberian pine which produced pure embryonal line, somatic embryo and plant have been determined.

Текст научной работы на тему «Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири»

СОЧЕТАНИЕ КЛАССИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ И ПРИМЕНЕНИЯ

СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА ХВОЙНЫХ ВИДОВ СИБИРИ

И.Н. ТРЕТЬЯКОВА, доктор биологических наук; А.В. БАРСУКОВА; С.С. САВЕЛЬЕВ; АС. СИРЕНКО Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, Россия

Введение

Проблема сохранения генофонда основных лесообразующих видов России может быть решена при помощи сочетания классических методов селекции и современных методов биотехнологии, таких как соматический эмбриогенез, широко используемый в плантационном лесовыращивании за рубежом при реализации программы MVF (Multi variety forest). Соматический эмбриогенез имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами клонального размножения. Этот эффективный метод регенерации растений позволяет сохранять генетические ресурсы на протяжении длительного времени благодаря высокой продуктивности пролиферирующей эмбриональной массы (ЭМ) и ее способности подвергаться длительной криоконсервации [7]. С помощью соматического эмбриогенеза можно производить массовое тиражирование высокопродуктивных, устойчивых к патогенам чистых линий растений для создания лесосеменных плантаций [3-5].

Несмотря на быстрое развитие биотехнологии соматического эмбриогенеза хвойных, до сих пор не разработан комплексный селекционно-генетический подход и не полностью решены те аспекты фундаментальной проблемы морфогенеза (тотипотентность, детерминация и компетентность, дифференциация и дедифференциация), которые можно решить на примере именно соматического эмбриогенеза как модельной системы. Отсутствуют работы по сравнению цитогистологического статуса морфогенных (эмбриональной массы) и неморфогенных каллусов различного происхождения во всей динамике их развития. Технология соматического эмбриогенеза до сих пор остается не разработанной для ряда видов хвойных, в том числе и видов, произрастающих на территории России [1, 2]. Кроме того, критическим моментом является процесс вызревания соматических зародышей, поскольку он влияет на жизнеспособность полученных зародышей и их способность прорастать.

Сочетание селекционной стратегии размножения для улучшения хвойных видов -внутривидовой и межвидовой гибридизации - основано на использовании комплементарных признаков между родительскими генотипами, приводящими к гетерозису. При этом использование биотехнологии соматического эмбриогенеза будет способствовать массовому тиражированию гибридных и гомозиготных чистых линий хвойных видов, что внесет неоценимый вклад в генетическое улучшение лесов России.

Цель исследования - проведение работ по гибридизации основных лесообразующих видов Сибири с выявлением у них эффекта гетерозиса, а также разработка биотехнологии получения соматических зародышей и регенерантов у гибридных семян хвойных пород.

Объекты и методы исследования

Объектом исследований служили деревья сосны сибирской (кедр сибирский, Pinus sibirica Du Tour), произрастающие в естественном древостое Западного Саяна и на клоновых прививочных плантациях Западно-Саянского Опытного лесного хозяйства, а также лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), произрастающей в естественных и искусственных насаждениях, а также клоновых плантациях (Красноярский край). На клонах кедра сибирского и лиственницы сибирской проводили опыты по контролируемому опылению с использованием в качестве опылителей плюсовых деревьев (№ 107, 108, 277,

357, 492) и уникальных гетерозисных форм с однолетним развитием женской шишки (106), а также деревьев лиственницы сибирской, устойчивых к лиственничной почковой галлице.

При проведении опытов по гибридизации (2005-2008 гг.) производилось опыление 612 клонов (каждый клон включал 12-15 деревьев) пыльцой деревьев-опылителей. С опыленных клонов производился сбор шишек потомства первого поколения, половина которых шла на определение семенной продуктивности и качества семян. Зародыши семян другой половины шишек вводили в культуру in vitro. В опытах по гибридизации проводили тестирование пыльцы на жизнеспособность.

При проведении работ по индукции соматического эмбриогенеза семена стерилизовали и из них извлекали зародыши, которые вводили в культуру in vitro. Для инициации образования эмбриогенного каллуса (ЭК) из зиготических зародышей использовали базовые среды ^MS, MS [6], !ALV, LV, MSG [8] и МА (неопубликованные данные) с добавлением мезоинозита, L-глютамина, регуляторов роста (2,4-Д и 6-БАП), сахарозы, а также агара или Gelrite. Для пролиферации ЭМ концентрация 6-БАП и сахарозы снижалась в 2-4 раза (у каждого вида по-разному). Эксперименты по индукции образования и пролиферации ЭК проводили в темноте при температуре 24±1оС. Для созревания соматических зародышей в среды добавляли АБК, ИМК, сахароза, а также Gelr^. Культивирование эксплантов проводили при 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1оС.

Для цитологического анализа использовали давленые препараты. Окраску эксплантов проводили сафранином с добавлением капли метиленового синего. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам при помощи Microsoft Excel. Морфологические изменения фиксировали цифровой фотокамерой Fudjifilm FinePix S7000.

Результаты и обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что женские шишки появились на клонах кедра сибирского уже в 10-летнем возрасте (2001 г.), мужские шишки в 13-летнем возрасте (2006 г.). В этот период клоны достигали высоты 1,5-1,6 м, D13 (диаметр на высоте 1,3 м) составил 15-17 см. Прорастание in vitro пыльцы у плюсовых и гетерозисных деревьев, используемых в качестве опылителей, было достаточно высоким. У разных деревьев жизнеспособность пыльцы колебалось от 75,4 до 96,8%, средняя длина пыльцевых трубок - от 105 до 164,9 мкм, что свидетельствует о высоком качестве пыльцы.

Семенная продуктивность гибридных шишек клоновых деревьев сосны сибирской в разных вариантах контролируемого опыления колебалась от 47 до 98,7%. Полнозернистость семян составила 90-93%. Зародыши достигали длины 1/4-1/2 длины зародышевого канала. У клонов, обработанных пыльцой гетерозисного дерева с однолетним развитием женских шишек, 30% гибридных шишек развивались по однолетнему циклу. Однако размеры таких шишек оказались мельче (длина шишек составила 46 против 76 мм, ширина - 36 против 66 мм). Семенная продуктивность составила 57%. У однолетних шишек данного клона в семяпочках формировались архегонии.

Введение изолированных зародышей семян кедра сибирского и лиственницы сибирской в культуру in vitro показало, что процесс реализации соматического эмбриогенеза у данных видов состоит из индукции образования ЭК, пролиферации эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ), вызревания соматических зародышей и их прорастания. На индукционной среде под действием гормонов 6-БАП и 2.4-Д соматические клетки зиготических зародышей лиственницы сибирской и кедра сибирского на 5-10 сутки культивирования начинали интенсивно растягиваться в длину и превращаться в эмбриональные трубки размером 200-300 мкм (рис. 1 а). Эмбриональные трубки в результате неравного деления образовывали мелкие

эмбриональные клетки диаметром 39-47 мкм. В течение 1 месяца эмбриональные клетки активно делились и образовывали эмбриональные глобулы, которые окружались эмбриональными трубками (рис. 1 б). При пересадке ЭСМ на пролиферирующие среды с пониженным содержанием цитокининов и сахарозы, вызывающих интенсивную пролиферацию, шел активный кливаж. При субкультивировании ЭСМ на базовых средах, содержащих АБК и ИМК, соматические зародыши приобретали биполярную структуру: на одном из полюсов формировались примордии семядолей, на другом -зародышевый корешок (рис. 1 в, г).

Наблюдения за динамикой роста ЭК показали, что процессы инициации и пролиферации каллуса у разных генотипов идут с неодинаковой скоростью. Из 16 эксплантов плюсовых деревьев кедра сибирского выделился один индивидуум, у которого объем эмбриогенного каллуса в 2-3 раза превышал объем каллусов остальных плюсовых деревьев (рис. 2). Наиболее активное образование ЭК шло у клонов в вариантах опыления пыльцой гетерозисного дерева с однолетним формированием женских шишек (рис. 3). Динамика роста ЭК и образование соматических зародышей у

лиственницы сибирской происходило аналогично кедру сибирскому. массе; г - созревание соматических зародышей

Рис. 1. Соматический эмбриогенез у лиственницы сибирской: а - индукция образования эмбриональной массы; б -пролиферация эмбриональной массы; в -соматические зародыши в эмбриональной

Срок культивирования,сут

—•—428 —•—434

433 -«-435 -«-390 —•—427 —I—429 — 380

---283

427 277/22 704 478 474 -• 357/69 358/70

Рис. 2. Рост эмбриогенного каллуса у плюсовых деревьев кедра сибирского (цифрами

обозначены номера деревьев)

Среди 30 генотипов лиственницы выделились 18% генотипов, у которых шло интенсивное образование эмбриогенного каллуса, у 57% генотипов образование эмбриогенного каллуса шло значительно слабее, а у 13% генотипов формирование эмбриогенного каллуса вообще не наблюдали. Особенно заслуживает внимание генотип донора лиственницы сибирской, который отличался устойчивостью к повреждению лиственничной почковой галлицей, и у которого шло активное формирование

эмбриогенного каллуса. За 50 суток культивирования объем ЭК достигал 18990 мм . На 1 мм ЭСМ насчитывалось в среднем 75±4,6 шт. эмбриональных глобул. У данного генотипа отмечали активное образование соматических зародышей. На среде для созревания насчитывалось до 380 шт. зародышей на 1 г эмбриогенного каллуса. Происходило формирование чистой эмбриогенной линии.

0 10 20 30 40 50 60

Срок культивирования, сут

Рис. 3. Рост эмбриогенного каллуса у гибридных зародышей семян, полученных в результате контролируемого опыления клонов пыльцой плюсовых деревьев (22х492, 22х277, 26х492) и гетерозисного дерева кедра сибирского (22х1А, 25х1А)

Образование ЭК, его пролиферация, формирование и вызревание соматических зародышей у лиственницы сибирской занимало 4-6 месяцев, у кедра сибирского - 7-10 месяцев. Аналогично зиготическим зародышам, морфогенез соматических зародышей включает последовательное прохождение стадий проэмбрио, кливажа, образование глобулярных и торпедообразных зародышей, после которых осуществляются процессы дифференцировки - формируются апексы побега и корня, гипокотиль и семядоли, и, наконец, происходит прорастание соматических зародышей. Реализация соматического процесса требует применения разных химических соединений, в том числе регуляторов роста и различных физических предобработок. Поэтому соматический эмбриогенез у хвойных видов можно использовать как модельную систему в эмбриологических исследованиях. С помощью эмбриогенных культур были получены генетически улучшенные растения, которые будут подвергнуты криоконсервации, что позволит создать банк улучшенных генотипов.

Выводы

1. В результате опытов по гибридизации кедра сибирского на клоновой прививочной плантации были получены шишки первого поколения с высокой семенной продуктивностью.

2. Из введенных изолированных зародышей кедра сибирского и лиственницы сибирской путем подбора состава питательных сред формировались эмбрионально-суспензорная масса, соматические зародыши и регенеранты.

3. Наиболее активным ростом обладали эмбриогенные каллусы кедра сибирского, полученные от гетерозисных деревьев-опылителей с однолетним циклом развития женских шишек и лиственницы сибирской, полученные от дерева, устойчивого к лиственничной почковой галлице. Определены генотипы донорных растений лиственницы сибирской и кедра сибирского, способные давать чистые эмбриогенные линии, соматические зародыши и регенеранты.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 08-04-00107, № 09-04-10023к р-Сибирь-а № 09-04-98000 и № 09-04 98000 интеграционного гранта № 53.

Список литературы

1. Белоруссова А.С., Третьякова И.Н. Особенности формирования соматических зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические аспекты // Онтогенез. - 2008. -Т. 39, № 2. - С. 1-10.

2. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов / Третьякова И.Н., Белоруссова А.С., Носкова Н.Е., Савельев С.С., Лукина А.В., Барсукова А.В., Ижболдина М.В., Череповский Ю.А. // Хвойные бореальной зоны. - 2007. - Т. 24, № 2-3. - С. 309-318.

3. Klimaszewska K., Cyr D. R. Conifer somatic embryogenesis: I. Development // Dendrobiology. - 2002. - V. 48. - Р. 31-39.

4. An improved method for somatic plantlet production in hybrid larch (Larix x leptoeuropaea): Part 2. Control for germination and plantlet development / Lelu M.A., Bastien C., Klimaszewska K., Charest P.J. // Plant Cell Tiss. Organ. Cult. - 1994. - V. 36. - Р. 117127.

5. Lelu-Walter M-A., Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Clonal plant production from self- and cross-pollinated seed families of Pinus sylvestris (L.) through somatic embryogenesis // Plant Cell Tiss. Organ. Cult. - 2008. - V. 92. - Р. 31-45.

6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, N 4. - Р. 473-497.

7. Park Y-S. Implementation in conifers somatic embryogenesis in clonal forestry: technical requirement and development considerations // Ann. For. Sci. - 2002. - V. 59. - P. 651-656.

8. Plant cell, tissue and organ culture: fundamental methods / Eds. O.L. Gamborg, G.C. Phillips. - Berlin: Springer-Velag, 1995. - 358 p.

СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ И ОРГАНОГЕНЕЗ КАК ОСНОВА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ПОЛУЧЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ДЕКОРАТИВНЫХ И ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР

И В. МИТРОФАНОВА, доктор биологических наук Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Биотехнологические подходы, основанные на культивировании органов и тканей многолетних садовых растений вне организма, на искусственных питательных средах в регулируемых асептических условиях, открывают принципиально новые возможности для фундаментальных и прикладных исследований. Растительные системы in vitro являются удобными моделями для исследования сложных механизмов, лежащих в основе пролиферации, клеточной дифференцировки, гистогенеза, органогенеза, соматического эмбриогенеза и регенерации целого организма из культивируемых клеток, обладающих тотипотентностью [1-3, 6, 7, 15, 16, 18, 22, 32]. В прикладном аспекте на основе знаний о биологии клетки in vitro разрабатываются меристемные технологии, эмбриокультура, гаплоидные технологии, клеточная селекция, генная и клеточная инженерия [4, 5, 8, 10, 20].

Экспериментально созданные системы in vitro весьма многообразны. Используя системы in vitro, реализацию тотипотентности клетки высшего растения можно направить как по пути соматического эмбриогенеза, так и органогенеза. Количество компетентных клеток зависит от вида, подвида, сорта и типа исходного экспланта. Сохранение проэмбриогенных клеток при субкультивировании находится также в зависимости от трофических и гормональных факторов среды [1, 3, 4, 7, 9, 20, 24].

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.