CC BY
40нлйлктулльшшЕ
УДК 633.15:631.527.8
Т. М. Сатарова, доктор б'юлог1чних наук Б. В. Дзюбецький, доктор сльськогосподарських наук В. Ю. Черчель, кандидат с'шьськогосподарських наук В. В. Борисова
ДУ 1нститут стьського господарства степовоТ зони НААН
М. М. Таганцова
УкраТнський iнститут експертизи сортiв рослин [email protected]. иа
SNP-аналiз у паспортизацп та iдентифiкацil лiнiй кукурудзи
Розглянуто методичн'1 аспекти використання анал'ву однонуклеотидного пол'шорф'вму ДНК (БМР-анал1зу) для паспортизаци та 1дентифкаци лшш кукурудзи. Показано, що БМР-генотипування е методом з високим дискримнацшним потенц1алом, здатним вир1зняти м'ж собою лши кукурудзи, який рекомендовано застосовувати для паспортизаци лшш, анал'ву аньо'[однор1дност1, стабльност1 та в1дм1нност1.
Ключов1 слова:
БЫР-маркер, SNP-аналiз, ДНК-паспортиза^я, щентифка^я.
Вступ. У процес селекцп кукурудзи на сучас-ному eTani широко впроваджують нов^ш ме-тоди оцiнки та добору вих^ного сeлeкцiйного мaтeрiaлу, як фунтуються на aнaлiзi молекуляр-но-генетичного полiморфiзму. Такий пiдхiд дае можливкть проводити монiторинг генетичноТ структури селекцйних зрaзкiв незалежно вiд впливу умов вирощування. У рамках нового нап-ряму сeлeкцiТ - мaркeр-aсоцiйовaноТ селекцп (MAS) - використання молекулярних мaркeрiв, тобто посшдовностей ДНК з в^омою локaлiзa-цкю, е перспективним для встановлення спо-рiднeностi сeлeкцiйних зразкв, прогнозуван-ня ступеня гетерозису, маркування господар-сько-цiнних ознак.
Молекулярно-генетичний метод aнaлiзу генетичноТ вaрiaбeльностi селекцйного мaтeрia-лу, який отримав назву SNP (single nucleotide polymorphism), спрямований на виявлення однонуклеотидного полiморфiзму, тобто точкових замш одного нуклеотиду на шший у ланцюгу ДНК (пари нуклeотидiв у дволaнцюговiй моле-кулi ДНК) [1, 2]. Замша нуклеотиду - це генна мутаця типу транзицп або трансверсп, яка не змшюе довжину ДНК. Однонуклеотидн зами ни вiдбувaються у будь-яких дшянках геному. В кодуючих посшдовностях вони призводять до змiни в структурi кодованих бiлкiв: залежно вщ мiсeнс i нонсенс зaмiн змшюють aмiнокислотну послiдовнiсть протешу або спричинюють пе-
редчасну зупинку трансляцп. Для регуляцп ген-ноТ експресп ктотними е випадки однонуклео-тидних замш у регуляторних посл^овностях ДНК. Водночас установлено, що бiльшiсть одно-нуклеотидних замiн локалiзуються в негенних та некодуючих дiлянках геному або в положен-нях кодонiв, якi не ведуть до замш у вщповщних амшокислотних послiдовностях i через це не вi дображаються у фенотип. Саме такi однонуклео-тиднi замши найчастше використовують як SNP-маркери для аналiзу загального полiмор-фiзму. Вважають дуже продуктивним визначати колекцп SNPs, якi вкривають цiлий геном через певн iнтервали, щоб знайти дшянки геному, де характер та частота SNP-алелiв вiдрiзняються у рiзних особин. Для маркування ознак цшыши-ми е SNP-маркери, розташованi безпосередньо в генах або ткно з ними зчеплен [1-4].
SNP-аналiз у свтовм селекцiТ кукурудзи почали застосовувати близько 5-7 рокв тому. Ни-нi дослiдження однонуклеотидного полiморфiз-му ДНК кукурудзи сконцентрован в клькох нап-рямах: методичнi розробки з виявлення нових SNP-маркерiв та пдвищення iнформативностi SNP-аналiзу; порiвняльний аналiз генетичного полiморфiзму селекцiйного матерiалу, визна-чення спор^неност, кластеризацiя, прогнозу-вання гетерозису; пошук SNP-маркерiв, якi мар-кують господарсько-цiннi ознаки та iн. [3, 4]. Однак в УкраТн SNP-аналiз ранiше не застосо-
вували, можливостi його використання в селек-цiйнiй практик для кукурудзи не дослiджено.
ДНК-паспортизащя - це процес складання ДНК-паспор^в (ДНК-профiлiв), тобто збиран-ня нформацп про специфiчнiсть послiдовностi нуклеотидiв ДНК, яка властива лише певному генотипу. Така нформащя може бути отримана за допомогою молекулярно-генетичних методiв аналiзу ДНК, найефективнiше - з використанням молекулярно-генетичних маркерiв, та зафксо-вана у виглядi певноТ формули - послщовнос-тi лiтер i цифр [5]. Для паспортизацп генотипiв рослин прийнято використовувати системи мо-лекулярних маркерiв з високим дискримша-цмним потенцiалом, якi дають можливiсть не тшьки з'ясувати ступiнь однорiдностi зразка та диференщювати зразки мiж собою, а й встанов-лювати стутнь вiдмiнностi одного селекцмно-го зразка вщ iншого та iдентифiкувати генотипи [6]. Вс напрацювання в цьому напрямi й самi ДНК-паспорти можуть бути використан для iдентифiкацiï, реестрацп лiнiй i гiбридiв кукурудзи та охорони авторських прав. Нин пошире-ною е система паспортизацп генотитв кукурудзи на основi SSR-маркерiв, за допомогою яких вщсшдковують стан полiморфних дiлянок ДНК, що виник за рахунок мутацiй хромосомного типу - делецм, дуплiкацiй, нсерцм, транслока-цiй. Можливiсть проводити ДНК-паспортиза^ю лiнiй кукурудзи iншим, бiльш точним методом - шляхом аналiзу однонуклеотидного полiмор-фiзму з використанням SNP-маркерiв - не досли джено.
Мета дослщжень. Оцiнка можливостей використання SNP-аналiзу для паспортизацп' та iдентифiкацiï лнм кукурудзи.
Об'ект дослiджень. Однонуклеотидний по-лiморфiзм ДНК у 270 лнм кукурудзи вiтчизняноï селекцп' для використання в практик паспортизацп' та щентифкаци лнм це сльськогосподар-ськоТ культури.
Матерiали та методика дослщжень. SNP-генотипування лiнiй кукурудзи проводили з використанням GoldenGate тесту, системи зчиту-вання результатiв Illumina VeraCode та матрицi Sentrix array matrice (SAM) [7]. Молекулярно-ге-нетичну частину роботи здмснювали на базi фiрми BioDiagnostics, Inc. (США), яка на основi Illumina VeraCode Bead Plate розробила панель BDI-III з 384 SNP-маркерiв, найбшьш придатних для виявлення полiморфiзму сучасного селек-цмного генофонду кукурудзи. ДНК видiляли з пагонв 7-добових проросткiв [8]. 1дентифкацю
лiнiй кукурудзи здiйснювали за методом мор-фологiчного опису, який застосовують пiд час проведення квалiфiкацiйноT експертизи на вщ-мiннiсть, однорiднiсть i стабшьнкть, польового iнспектування та здмснення дiлянкового та лабораторного сортового контролю [9-12].
Результати дослщжень. Теоретично панель з 384 бiалельних SNP-маркерiв здатна за-безпечити можливкть розрiзняти Mix собою 2384=3,9402E+115 генотитв. Сигнал детекцп пiд час проведення наших дослщжень виявили 367 маркерiв, 358 з них вiдносять до класу нформа-тивних. Використання маркерiв панелi BDI-III з достатнiм сигналом детекцп дае можливiсть, таким чином, щентифкувати 2367=3,0061E+110, у разi залучення лише iнформативних маркерiв -2358= 5,8714E+107 генотипiв. Рiвень цих значень е достатнм для розрiзнення та створення ун-кальних паспортв як усiх лiнiй украТнськоТ, так i використаних для порiвняння лнм свiтовоT се-лекцiT' кукурудзи.
Ми сформували електронну базу даних паспортв 210 лшш кукурудзи украТнськоТ селекцп, проаналiзованих за SNP-маркерами [11]. Ця база мктить також загальнодоступну шфор-мацiю про SNP-паспорти 491 поширеноТ свто-воТ лнп кукурудзи i може бути використана в практичнй селекцп для оцiнки ступеня новиз-ни створених лiнiй, захисту авторських прав на сорти рослин, а також для розроблення методо-лопчних принципiв реестрацп' лiнiй та гiбридiв кукурудзи за алельним станом маркерiв однонуклеотидного полiморфiзму. Зразок паспорта за SNP-маркерами лнп кукурудзи ДК744СВ на-ведно в таблиц 1. У паспортах також позначено таю SNP-характеристики лiнiй, як стутнь гомо-зиготностi та показник генного рiзноманiття.
Державну реестрацiю лiнiй кукурудзи здмс-нюють згiдно з Методикою проведення експертизи сортв кукурудзи звичайноТ (Zea mays L.) на вщмнысть, однорiднiсть i стабiльнiсть [9, 12]. За цим документом однорщнкть визначають як здатнiсть рослин сорту з урахуванням особли-востей розмноження збер^ати подiбнiсть за оз-наками, зазначеними в Опиа сорту. Стабшьнкть - це здатнiсть сорту залишатися незмiнним за ознаками, наведеними в Опиа сорту, тсля неодноразового розмноження. З генетичного по-гляду однорщысть та стабiльнiсть лiнiй кукурудзи визначаються ступенем Т'хньоТ гомозиготно-стi. Тому для набору з 270 лнм кукурудзи украТнськоТ селекцп ми встановлювали ступiнь гомозиготной (гетерозиготностi) за SNP-маркерами.
Таблиця 1
SNP-паспорт лшн кукурузди ДК744СВ
Гомозиготнiсть 100%, показник генного pi3HOMaHi™ 0,1782
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
BDI-I11-1 A/A BDI-I11-15 G/G BDI-I11-198 A/A BDI-I11-247 G/G BDI-I11-297 G/G BDI-I11-345 G/G BDI-I11-53 G/G
BDI-I11-100 G/G BDI-I11-150 G/G BDI-I11-199 A/A BDI-I11-248 A/A BDI-I11-298 G/G BDI-I11-346 A/A BDI-I11-54 C/C
BDI-I11-101 A/A BDI-I11-151 G/G BDI-I11-2 A/A BDI-I11-249 G/G BDI-I11-299 A/A BDI-I11-347 G/G BDI-I11-55 C/C
BDI-I11-102 G/G BDI-I11-152 G/G BDI-I11-20 A/A BDI-I11-25 G/G BDI-I11-3 A/A BDI-I11-348 G/G BDI-I11-56 A/A
BDI-I11-103 A/A BDI-I11-153 ?/? BDI-I11-200 A/A BDI-I11-250 G/G BDI-I11-30 G/G BDI-I11-349 A/A BDI-I11-57 C/C
BDI-I11-104 C/C BDI-I11-154 A/A BDI-I11-201 A/A BDI-I11-251 A/A BDI-I11-300 G/G BDI-I11-35 G/G BDI-I11-58 C/C
BDI-I11-105 A/A BDI-I11-155 G/G BDI-I11-202 C/C BDI-I11-253 A/A BDI-I11-301 G/G BDI-I11-350 G/G BDI-I11-59 A/A
BDI-I11-106 A/A BDI-I11-156 G/G BDI-I11-203 C/C BDI-I11-254 A/A BDI-I11-302 A/A BDI-I11-351 G/G BDI-I11-6 A/A
BDI-I11-107 G/G BDI-I11-157 A/A BDI-I11-204 C/C BDI-I11-255 A/A BDI-I11-303 A/A BDI-I11-352 A/A BDI-I11-60 A/A
BDI-I11-108 G/G BDI-I11-158 Т/Т BDI-I11-205 A/A BDI-I11-256 G/G BDI-I11-304 G/G BDI-I11-353 G/G BDI-I11-61 A/A
BDI-I11-109 A/A BDI-I11-159 A/A BDI-I11-206 A/A BDI-I11-257 G/G BDI-I11-305 A/A BDI-I11-354 G/G BDI-I11-62 A/A
BDI-I11-11 G/G BDI-I11-16 G/G BDI-I11-207 A/A BDI-I11-258 A/A BDI-I11-306 A/A BDI-I11-355 A/A BDI-I11-63 G/G
BDI-I11-110 A/A BDI-I11-160 G/G BDI-I11-208 A/A BDI-I11-259 G/G BDI-I11-307 A/A BDI-I11-356 A/A BDI-I11-64 A/A
BDI-I11-111 A/A BDI-I11-161 A/A BDI-I11-209 A/A BDI-I11-26 A/A BDI-I11-308 G/G BDI-I11-357 G/G BDI-I11-65 A/A
BDI-I11-112 G/G BDI-I11-162 A/A BDI-I11-21 G/G BDI-I11-260 C/C BDI-I11-309 G/G BDI-I11-358 A/A BDI-I11-66 G/G
BDI-I11-113 G/G BDI-I11-163 A/A BDI-I11-210 G/G BDI-I11-261 A/A BDI-I11-31 A/A BDI-I11-359 A/A BDI-I11-67 A/A
BDI-I11-114 C/C BDI-I11-164 C/C BDI-I11-211 Т/Т BDI-I11-262 ?/? BDI-I11-310 A/A BDI-I11-36 A/A BDI-I11-68 Т/Т
BDI-I11-115 A/A BDI-I11-165 G/G BDI-I11-212 Т/Т BDI-I11-263 G/G BDI-I11-311 A/A BDI-I11-360 A/A BDI-I11-69 A/A
BDI-I11-116 A/A BDI-I11-166 G/G BDI-I11-213 G/G BDI-I11-264 A/A BDI-I11-312 G/G BDI-I11-361 C/C BDI-I11-7 A/A
BDI-I11-117 A/A BDI-I11-167 G/G BDI-I11-214 G/G BDI-I11-265 G/G BDI-I11-313 G/G BDI-I11-362 A/A BDI-I11-70 G/G
BDI-I11-118 C/C BDI-I11-168 G/G BDI-I11-215 C/C BDI-I11-266 G/G BDI-I11-314 A/A BDI-I11-364 C/C BDI-I11-73 C/C
BDI-I11-119 G/G BDI-I11-169 A/A BDI-I11-216 C/C BDI-I11-267 A/A BDI-I11-315 G/G BDI-I11-365 G/G BDI-I11-74 C/C
BDI-I11-12 G/G BDI-I11-17 A/A BDI-I11-217 A/A BDI-I11-268 A/A BDI-I11-316 C/C BDI-I11-366 G/G BDI-I11-75 A/A
BDI-I11-120 A/A BDI-I11-170 A/A BDI-I11-218 G/G BDI-I11-269 A/A BDI-I11-317 C/C BDI-I11-367 G/G BDI-I11-76 G/G
BDI-I11-121 C/C BDI-I11-171 C/C BDI-I11-219 A/A BDI-I11-27 A/A BDI-I11-318 G/G BDI-I11-37 G/G BDI-I11-77 G/G
BDI-I11-122 A/A BDI-I11-172 A/A BDI-I11-22 C/C BDI-I11-270 C/C BDI-I11-319 A/A BDI-I11-370 C/C BDI-I11-78 G/G
BDI-I11-123 G/G BDI-I11-173 G/G BDI-I11-220 A/A BDI-I11-271 C/C BDI-I11-32 G/G BDI-I11-371 A/A BDI-I11-79 G/G
BDI-I11-124 C/C BDI-I11-174 A/A BDI-I11-221 G/G BDI-I11-272 A/A BDI-I11-320 G/G BDI-I11-372 C/C BDI-I11-8 A/A
BDI-I11-125 A/A BDI-I11-175 A/A BDI-I11-222 C/C BDI-I11-273 C/C BDI-I11-321 G/G BDI-I11-373 A/A BDI-I11-80 C/C
BDI-I11-126 A/A BDI-I11-176 A/A BDI-I11-223 A/A BDI-I11-274 A/A BDI-I11-323 G/G BDI-I11-374 A/A BDI-I11-81 A/A
BDI-I11-127 G/G BDI-I11-177 G/G BDI-I11-224 G/G BDI-I11-275 G/G BDI-I11-324 G/G BDI-I11-375 G/G BDI-I11-82 A/A
BDI-I11-128 G/G BDI-I11-178 G/G BDI-I11-225 A/A BDI-I11-276 G/G BDI-I11-325 A/A BDI-I11-376 C/C BDI-I11-83 C/C
BDI-I11-129 G/G BDI-I11-179 C/C BDI-I11-226 G/G BDI-I11-277 G/G BDI-I11-326 ?/? BDI-I11-377 C/C BDI-I11-84 A/A
BDI-I11-13 G/G BDI-I11-18 A/A BDI-I11-227 A/A BDI-I11-278 A/A BDI-I11-327 C/C BDI-I11-378 A/A BDI-I11-85 ?/?
BDI-I11-130 A/A BDI-I11-180 A/A BDI-I11-228 ?/? BDI-I11-279 G/G BDI-I11-328 Т/Т BDI-I11-379 G/G BDI-I11-86 A/A
BDI-I11-131 C/C BDI-I11-181 A/A BDI-I11-229 A/A BDI-I11-28 A/A BDI-I11-329 A/A BDI-I11-38 G/G BDI-I11-87 A/A
BDI-I11-132 A/A BDI-I11-182 G/G BDI-I11-23 A/A BDI-I11-280 G/G BDI-I11-33 A/A BDI-I11-380 A/A BDI-I11-88 A/A
BDI-I11-133 C/C BDI-I11-183 G/G BDI-I11-230 A/A BDI-I11-281 G/G BDI-I11-330 C/C BDI-I11-381 ?/? BDI-I11-89 A/A
BDI-I11-134 G/G BDI-I11-184 A/A BDI-I11-231 Т/Т BDI-I11-282 G/G BDI-I11-331 A/A BDI-I11-383 ?/? BDI-I11-9 A/A
BDI-I11-135 C/C BDI-I11-185 A/A BDI-I11-232 G/G BDI-I11-283 A/A BDI-I11-332 A/A BDI-I11-384 G/G BDI-I11-90 C/C
BDI-I11-136 C/C BDI-I11-186 A/A BDI-I11-233 A/A BDI-I11-284 C/C BDI-I11-333 A/A BDI-I11-39 G/G BDI-I11-91 G/G
BDI-I11-138 G/G BDI-I11-187 A/A BDI-I11-234 A/A BDI-I11-285 ?/? BDI-I11-334 G/G BDI-I11-4 A/A BDI-I11-92 G/G
BDI-I11-139 G/G BDI-I11-188 G/G BDI-I11-235 C/C BDI-I11-286 ?/? BDI-I11-335 A/A BDI-I11-40 C/C BDI-I11-93 G/G
BDI-I11-14 A/A BDI-I11-189 A/A BDI-I11-236 G/G BDI-I11-287 G/G BDI-I11-336 A/A BDI-I11-41 C/C BDI-I11-94 C/C
BDI-I11-140 G/G BDI-I11-19 A/A BDI-I11-237 G/G BDI-I11-288 C/C BDI-I11-337 A/A BDI-I11-42 C/C BDI-I11-95 C/C
BDI-I11-141 G/G BDI-I11-190 Т/Т BDI-I11-238 A/A BDI-I11-289 G/G BDI-I11-338 ?/? BDI-I11-43 A/A BDI-I11-96 A/A
BDI-I11-142 G/G BDI-I11-191 A/A BDI-I11-239 Т/Т BDI-I11-29 G/G BDI-I11-339 G/G BDI-I11-46 C/C BDI-I11-97 Т/Т
BDI-I11-144 A/A BDI-I11-192 A/A BDI-I11-240 G/G BDI-I11-290 C/C BDI-I11-34 A/A BDI-I11-47 G/G BDI-I11-98 G/G
BDI-I11-145 A/A BDI-I11-193 A/A BDI-I11-241 Т/Т BDI-I11-291 A/A BDI-I11-340 A/A BDI-I11-48 G/G BDI-I11-99 G/G
BDI-I11-146 G/G BDI-I11-194 A/A BDI-I11-242 G/G BDI-I11-292 A/A BDI-I11-341 G/G BDI-I11-49 G/G
BDI-I11-147 A/A BDI-I11-195 G/G BDI-I11-244 Т/Т BDI-I11-293 C/C BDI-I11-342 C/C BDI-I11-5 G/G
BDI-I11-148 A/A BDI-I11-196 G/G BDI-I11-245 A/A BDI-I11-294 G/G BDI-I11-343 ?/? BDI-I11-50 G/G
BDI-I11-149 A/A BDI-I11-197 A/A BDI-I11-246 Т/Т BDI-I11-295 ?/? BDI-I11-344 G/G BDI-I11-51 A/A
Прим1тка. 1 - номер SNP-маркера панел BDI-III; 2 - алельний стан SNP-маркера в гомологчних сайтах гомологчних хромосом; А - аден1н; T - тимш; G - гуанш; C - цитозин; ? - в1дсутнкть сигналу.
НАИАКТУАЛЬШШЕ
За комплексом SNP-маркерiв панелi В01-Ш гетерозиготнiсть окремого селекцмного зразка в дослiдженому наборi лнм вiтчизняноT селекцiT становила в середньому 0,1962% (0,72 гетеро-зиготних локусв з 367 дослiджених маркерних локусв на 1 лiнiю). Для всього комплексу з 367 маркерiв та 270 селекцйних зразкiв гетерози-готшсть становила 0,2043%, що е св^ченням високоТ гомозиготностi (99,7957%) дослiджених селекцйних зразкiв i правомiрностi визначення тх як лiнiй.
Вiдмiннiсть за [9, 12] визначають як умову, за якою сорт за виявленням ознак ч^ко вщ-рiзняеться вiд будь-якого шшого сорту. Якщо сорт-кандидат може бути диференцйований серед загальновщомих сортiв методом порiвнян-ня Тхнх морфологiчних Описiв, його вважають вщмнним. Iдентифiкацiя сортiв рослин, у тому
чист й лiнiй кукурудзи, зпдно з [9, 10] - це дiя, спрямована на встановлення щентифкацмного цифрового коду для пiдтвердження морфоло-гiчних ознак сорту та Тхнього прояву у вiдповiднi фази росту й розвитку рослин. У зв'язку iз тим, що в Опис сорту пiд час реестрацп використо-вують лише морфологiчнi ознаки, становить значний нтерес проведення аналiзу вщмнност на молекулярно-генетичному рiвнi за SNP-мар-керами порiвняно з морфологiчним.
Такий аналiз наборiв лiнiй кукурудзи укра-тнськот селекцп ми провели, порiвнюючи сту-пiнь вiдмiнностi за морфолопчними ознаками, зазначеними в Описах лнм пiд час оцiнки на ВОС. Проводили порiвняння 36 лiнiй кукурудзи з л^ею 274 СВ. Характеристики морфолопчних ознак лнп 274 СВ, а також, як приклад, однеТ з 36 лнм - БВ377 С наведено в таблиц 2.
Таблиця 2
Опис лшш кукурудзи 274 СВ та БВ377 С за морфолопчними ознаками
№ ознаки Назва ознаки Код ступеня прояву
274 СВ БВ377 С
1. Перший листок: антоцанове забарвлення пхви 1 5
2. Перший листок: форма верхiвки 2 1
3. Листок: кут мiж листковою пластинкою i стеблом (листок над верхнм качаном) 5 3
4. Листок: положення листковоТ пластинки (листок над верхнм качаном) 3 3
5. Стебло: зигзагоподiбнiсть 1 1
6. Стебло: антоцанове забарвлення повЬряних коренв 1 5
7. Волоть: час повного цвтння (середня третина головноТ осi, 50% рослин) 3 -
8. Волоть: антоцанове забарвлення основи колосковоТ луски (на середнш третинi головноТ осi) 1 3
9. Волоть: антоцанове забарвлення колоскових лусок за винятком основи (на середнш третин головноТ ос) 1 5
10. Волоть: aнтоцiaнове забарвлення пилякв на середнiй третинi головноТ оа (на щойно утворених пиляках) 1 -
11. Волоть: розмщення колоскiв (на середнш третин головноТ осi) 5 5
12. Волоть: кут мiж головною вiссю та бiчними гiлочкaми (на нижнiй третинi волот) 5 3
13. Волоть: положення бiчних гiлочок на нижнш третинi волотi 3 5
14. Волоть: юльюсть первинних бiчних гiлочок, шт. 3 3
15. Початок: час появи шовку в 50% рослин 3 6
№ ознаки Назва ознаки Код ступеня прояву
274 СВ БВ377С
16. Початок: антоцанове забарвлення шовку 9 9
17. Початок: штенсивысть антоцанового забарвлення шовку 3 5
18. Листок: антоцанове забарвлення пхви (середня частина рослини) 1 5
19. Волоть: головна вкь за довжиною (вщ нижчоТ бiчноT плочки до верхiвки), см 3 5
20. Волоть: довжина верхiвки головноТ оа волот (вщ верхньоТ бiчноT плочки до верхiвки волот), см 3 5
21. Волоть: бiчнi гiлочки за довжиною 3 7
22. Лише для самозапильних лшш. Рослина: за довжиною (враховуючи волоть), см 7 7
23. Рослина: спввщношення висоти прикртлення верхнього качана до висоти рослини 3 3
24. Листок: пластинка листка за шириною (листок верхнього качана, см) 3 5
25. Качан: довжина нжки, см 3 3
26. Качан за довжиною без обгортки, см 3 7
27. Качан: дiaметр (посередине см) 3 5
28. Качан: форма 3 3
29. Качан: юльюсть зернових рядiв, шт. 3 5
30. Качан: тип зернини 3 5
31. Качан: колiр верхiвки зернини 3 3
32. Качан: колiр низу зернини 3 3
33. Качан: антоцанове забарвлення лусок стрижня 9 9
34. Качан: штенсивысть антоцанового забарвлення лусок стрижня 5 5
Пiд час порiвняння двох лiнiй ознаки, за якими лнп не розрiзнялися, позначали як «0 ба-лiв», а кожну з ознак, за якими лнп розрiзня-лися, - як «1 бал». Для кожного попарного по-рiвняння знаходили «дистaнцiю при порiвняннi морфологiчних ознак» як частку проaнaлiзовa-них ознак, якi не збiглися для двох лiнiй та бу-
ли познaченi як «1 бал». Для перевiрки того, нaскiльки лнп, близькi за морфологiчними опи-сами, е близькими за генетичними SNP-дистaн-цями, розраховували коефiцiент кореляцп мiж показником «дистанцп при порiвняннi морфо-логiчних ознак» та вiдповiдними генетичними дистанцями (табл. 3)
Порiвняння лшш кукурудзи з л^ею 274 СВ за морфолопчними ознаками та генетичними дистанщями
Таблиця 3
Л^я Дистанця при порiвняннi морфологчних ознак з л^ею 274 СВ Генетична SNP-дистaнцiя з л^ею 274 СВ
ДК273 МВ 0,7576 0,3966
ДК742 М стерильна 0,6563 0,4684
ДК236 СВ 0,6471 0,3686
ЛВК1 МВ 0,6471 0,4435
ДК129 СВ 0,6471 0,4615
МС481 0,6286 0,3546
ДК633/325 МВ 0,6176 0,3892
К15 0,6176 0,5028
ВК377 ВС 0,6176 0,2051
ДК257 М 0,6176 0,2493
МС252 СВ 0,5938 0,2977
БВ377С 0,5938 0,4928
МС361 зМСВ 0,5882 0,3046
ВК377 М 0,5625 0,2068
МС23/135 МВ 0,5588 0,4099
ДН10 МВ 0,5588 0,4337
ДК232 МВ 0,5588 0,4500
ДК714/195 МВ 0,5588 0,3456
ВК138 МВ 0,5588 0,4086
Л^я Дистанця при порiвняннi морфологчних ознак з л^ею 274 СВ Генетична SNP-дистaнцiя з л^ею 274 СВ
ВК387 МВ 0,5294 0,4040
МС74со зМ 0,5294 0,4310
К4 С 0,5000 0,5424
Р2-8 МВ 0,5000 0,4329
МС296 зС 0,5000 0,3842
АЦ 151 0,5000 0,4266
ДК744 СВ 0,5000 0,1719
МС296 зС 0,5000 0,3842
ДК276 МВ 0,5000 0,3859
ДК744 М 0,4848 0,1719
ДК307 МВ 0,4706 0,3702
С85 СО МВ 0,4412 0,4295
МС236 зС 0,4412 0,4169
МС236 С 0,4063 0,4176
ДК633/266 МВ 0,3824 0,3528
БВ247 СВ 0,3824 0,4046
АЦ10 МВ 0,3235 0,4192
Мт-тах 0,3235-0,7576 0,2051-0,5424
*г = -0 01- г =0 35 23 ' ' 0,05
* Коеф1ц1ент кореляцп м1ж «дистанц1ями при пор1внянн1 морфологчних ознак» та генетичними SNP-дистaнцiями.
Як випливае з тaблицi 3, не встановлено ко-реляцiйну залежнсть мiж дистaнцiями за порiв-нянням морфологчних ознак i попарними генетичними SNP-дистaнцiями. Так, для лшп ДК273 МВ, яка за балами ВОС-анкети значно (на 75,76%), вiдрiзняеться вщ 274 СВ, генетична дис-тaнцiя становить 0,3966. Проте л^я АЦ10 МВ, яка найменше (на 32,35%) вiдрiзняеться вiд 274 СВ морфологчно, мае нaвiть бiльшу генетичну SNP-дистaнцiю з нею - 0,4192. Водночас, най-менша генетична дистанця (0,2051) спостер^ала-ся мiж л^ями 274 СВ та ВК377 ВС, як за порiв-нянням морфологчних покaзникiв розрiзнялися на досить велику вщстань - 0,6176. Все це свщ-чить про перспективнiсть для застосування в ана-лiзi на вщмЫысть не лише морфологiчних ознак, а й i молекулярно-генетичних характеристик, зо-крема алельного стану комплексу SNP-мaркерiв.
Висновки. SNP-генотипувaння е методом з високим дискримнацйним потенцiaлом, здат-ним вирiзняти мiж собою лнп кукурудзи, який рекомендуеться застосовувати для паспортиза-цп лiнiй кукурудзи, aнaлiзу ТхньоТ однорiдностi, стaбiльностi та вщмнност генотипiв. Рiзницi мiж л^ями за SNP-мaркерaми дають можливiсть диференцювати генотипи зi значно бiльшою щентифкацмною здaтнiстю, нiж морфологiчнi ознаки, як застосовують для ВОС-тесту. Проведено генотипування й створено комп'ютерну базу SNP-пaспортiв 270 лнм кукурудзи украТн-ськоТ селекцп. Для комплексу з 270 селекцмних зрaзкiв украТнськоТ селекцп, дослiджених за 367 SNP-мaркерaми, гетерозиготшсть становила 0,2043%, що е свщченням високоТ гомозиготно-стi (99,7957%) та прaвомiрностi визначення до-слiджених зразкв як лiнiй.
ВИКОРИСТАНА Л1ТЕРАТУРА
1. Syvanen A.-Ch. Assessing genetic variation: geno-typing single nucleotide polymorphisms / A.-Ch. Syva nen // Nature reviews / Genetics. — 2001. — Vol. 2. - P. 930-942.
2. Vignal A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics / A. Vignal, D. Milan, M. Sancristobal, A. Eggen // Genetics, selection, evolution. - 2002. - Vol. 34, № 3.
- P. 275-305.
3. Ganal M. W. A large maize (Zea mays L.) SNP genotyping array: development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome [Електронний ресурс] / M. W. Ganal, G. Durstewitz, A. Polley et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6 (12). - Режим доступу : DOI: 10.1371/journal.pone.0028334.
4. Lu Y. Molecular characterization of global maize breeding germplasm based on genome-wide single nucleotide polymorphisms / Y. Lu, J. Yan, C. T. Gui-maraes et al. // Theor. Appl. Genet. - 2009. - Vol. 120.
- P. 93-115.
5. Сиволап Ю. М. Вариабельность и специфичность геномов сельскохозяйственных растений / Ю. М. Сиволап, Н. Э. Кожухова, Р. Н. Календарь. - Одеса : Астропринт, 2011. - 336 с.
6. Кожухова Н. Е. Геном кукурудзи та його полi пшен-ня / Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап, Б. Ф. Вареник
УДК 633.15:631.527.8
Т. Н. Сатарова, Б. В. Дзюбецкий, В. Ю. Чер-чель, В. В. Борисова, М. Н. Таганцова. SNP-ана-лиз в паспортизации и идентификации линий кукурузы // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин : наук.-практ. журн. - 2014. -№ 3 (24). - С. 4-9.
Рассмотрены методические аспекты использования анализа однонуклеотидного полиморфизма ДНК (SNP-анализа) для паспортизации и идентификации линий кукурузы. Показано, что SNP-генотипирование является методом с высоким дискриминационным потенциалом, способным выделять между собой линии кукурузы, который рекомендуется применять для паспортизации линий кукурузы, анализа их однородности, стабильности и различия генотипов.
Ключевые слова: SNP-маркер, SNP-анализ, ДНК-паспортизация, идентификация.
// Bi сник аграрноТ науки. - 2011. - № 2. - С. 26-29.
7. Fan J. B. Illumina universal bead arrays / J. B. Fan, K. L. Gundersson, M. Bibikova et al. // Methods Enzymol. - 2006. - Vol. 410. - P. 57-73.
8. Murray M. G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M. G. Murray, W. F. Thompson // Nucleic Acids Res. - 1980. - Vol. 8, № 19. - P. 4321-4326.
9. Методика проведення експертизи сорт в кукурудзи звичайноТ (Zea mays L.) на вiдмi нн сть, одно-рi дш сть i стабi льш сть [Електронш й ресурс] / УкраТнський i нститут експертизи сорт в рослин / Державна система охорони прав на сорти рослин. - Режим доступу : http://sops.gov.ua/uploads/files/ documents/Metodiki/909.pdf. - 38 c.
10. Лещук Н. Грунтовий та лабораторний сортовий контроль: роль i значення в сортс^ й сертифi кац i'T [Електронний ресурс] / Н. Лещук. - К., 2009. - Режим доступу : ldni.sumy.ua/POSTcjntrol.pps.
11. Сатарова Т. М. Паспорти л н й кукурудзи за молекулярной олоп чними показниками (SNP-паспор-ти) // Електронна база даних / Т. М. Сатарова, В. В. Борисова. - Дн пропетровськ : ДУ 1СГСЗ, 2013.
12. Методика проведення експертизи на вiдмi нн сть, однорщж сть та стабтьы сть (ВОС-тест) кукурудзи // Охорона прав на сорти рослин : оф i ц. бюле-тень. - 2003. - № 2, Ч. 3. - С. 49-57.
UDC 633.15:631.527.8
T. M. Satarova, B. V. Dziubetskyi, V. Yu. Cherchel, V. V. Borysova, M. M. Tagantsova. SNP-analysis in certification and identification of maize lines // Sortovyvchennya ta okhorona prav na sorty roslyn : naukovo-praktychnyi zhurnal (Plant Varieties Studying and Protection : journal of applied research). - 2014. -№ 3 (24). - P. 4-9.
Methodical aspects of using the analysis of DNA single-nucleotide polymorphism (SNP-analysis) for certification and identification of maize lines are considered. It is shown that SNP-genotyping is a method with high discriminatory potential that can differentiate maize lines among themselves and is recommended to use for certification of maize lines and analysis of their homogeneity, stability and genotype differences.
Keywords: SNP-marker, SNP-analysis, DNA certification, identification.
Hagmw^a 08.04.2014 p.
