Снижение чувствительности миокарда к стимуляции мускариновых рецепторов третьего типа в постнатальном онтогенезе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.178.1

Снижение чувствительности миокарда к стимуляции мускариновых рецепторов третьего типа в постнатальном онтогенезе

С. В. Тапилина1,2, Д. В. Абрамочкин1,2*

'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра физиологии человека и животных, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12

2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

МЗ РФ, кафедра физиологии, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

*E-mail: abram340@mail.ru

Поступила в редакцию 10.11.2015

Принята к печати 05.02.2016

РЕФЕРАТ Мускариновые рецепторы третьего подтипа (МЗ-рецепторы) наряду с М2-рецепторами опосредуют холинергические эффекты в миокарде млекопитающих. При этом у взрослых животных электрофизиологические эффекты, наблюдаемые при избирательной стимуляции МЗ-рецепторов в миокарде, крайне малы по сравнению с эффектами стимуляции М2-рецепторов. Нами изучено действие избирательной стимуляции МЗ-рецепторов путем аппликации агониста мускариновых рецепторов пилокарпина (10 мкМ) на фоне блокирования М2-рецепторов селективным антагонистом метоктрамином (100 нМ) на конфигурацию потенциалов действия (ПД) в препаратах предсердного и желудочкового миокарда новорожденных и трехнедельных крысят в сравнении с эффектами в миокарде взрослых крыс. В предсердном миокарде стимуляция МЗ-рецепторов вызывала уменьшение длительности ПД приблизительно одинаково выраженное у новорожденных и взрослых крыс, в то время как у трехнедельных крысят отсутствовал статистически значимый эффект. Эффект, развивающийся в желудочковом миокарде новорожденных крысят, более чем в 3 раза превосходил эффект у взрослых животных, у трехнедельных животных эффект отсутствовал. В препаратах всех типов действие стимуляции МЗ-рецепторов на электрическую активность полностью снималось их селективным антагонистом 4-DAMP (10 нМ). Согласно данным РВ-ПЦР, количество мРНК гена МЗ-рецепторов как в предсердном, так и в желудочковом миокарде снижается по мере взросления животного. Можно заключить, что вклад МЗ-рецепторов в реализацию холинергических воздействий на миокард снижается в постнатальном онтогенезе, что связано с уменьшением экспрессии гена МЗ-рецепторов по сравнению с геном М2-рецепторов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ацетилхолин, мускариновые рецепторы, онтогенез, потенциал действия, сердце. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АХ - ацетилхолин; М2-рецепторы — мускариновые рецепторы второго типа; МЗ-рецепторы - мускариновые рецепторы третьего типа; НК - новорожденные крысята; ТНК - крысята трехнедельного возраста; ВК - взрослые крысы; РВ-ПЦР - метод ПЦР в реальном времени; ПД - потенциал действия; ДПД50 - длительность ПД на уровне 50% реполяризации; ДПД90 - длительность ПД на уровне 90% реполяризации.

ВВЕДЕНИЕ

Парасимпатическая регуляция сердца чрезвычайно важна для его нормальной работы. Нейромедиатор ацетилхолин (АХ), выделяющийся из окончаний интрамуральных постганглионарных парасимпатических нейронов, является основным эффектором парасимпатической нервной системы. АХ действует на пейсмекерные и рабочие кардиомиоциты посредством мускариновых рецепторов второго подтипа (М2-рецепторов), вызывая соответственно

отрицательный хронотропный и инотропный эффект [1]. Однако в последнее время появилось множество свидетельств существования в миокарде млекопитающих функционально активных холинорецепторов третьего типа (МЗ-рецепторов) [2-4].

В то время как М2-рецепторы сопряжены с G.-белками, а основные эффекты их стимуляции связаны со снижением внутриклеточного уровня сАМР, МЗ-рецепторы сопряжены с Gq-белками, что обуславливает активацию фосфоинозитидного каскада

ТОМ 8 № 2 (29) 2016 | ACTA NATURAE | 141

внутриклеточном сигнализации при их стимуляции [1, 2]. При этом а-субъединица Gq-белка активирует фосфолипазу С, что в итоге приводит к повышению внутриклеточного уровня Са2+ и активации протеин-киназы С, способной посредством фосфорилирования влиять на работу различных ионных каналов. С другой стороны, каналы, переносящие калиевый ток (IKM3), активируются, по всей видимости, в результате прямого взаимодействия с субъединицами Gq-белка [3, 5]. В результате стимуляция МЗ-рецепторов приводит к уменьшению длительности ПД, выраженному у взрослых крыс [6], мышей [4] и морских свинок [7] главным образом в предсердном миокарде. Помимо этого, М3-рецепторы опосредуют ряд эффектов АХ, не связанных с электрической активностью, в частности его антиапоптотическое действие на кардиомиоциты [8, 9].

Большинство работ, связанных с МЗ-рецепторами миокарда, ограничивалось лишь изучением их функций у взрослых животных, несмотря на то, что на ранних стадиях постнатального онтогенеза роль парасимпатической регуляции сердца в целом выше, чем у взрослых, в связи с недоразвитием или полным отсутствием симпатической иннервации миокарда [10] При этом результаты экспериментов на крысятах in vivo [11], а также предварительные данные нашей группы [12], полученные на миокарде новорожденных крысят, позволяют предполагать более высокую чувствительность миокарда к стимуляции М3-рецепторов на ранних стадиях онтогенеза.

В связи с этим в настоящей работы проведено сравнительное изучение электрофизиологических эффектов избирательной стимуляции М3-рецепторов в предсердном и желудочковом миокарде новорожденных крысят (НК) первого дня жизни, крысят трехнедельного возраста (ТНК) и взрослых крыс возрастом 4 месяца (ВК). Электрофизиологические данные сопоставляли с результатами измерения экспрессии генов МЗ- и М2-рецепторов методом ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали четырехмесячных самцов белых беспородных крыс (n = 26) массой 300-350 г, ТНК массой 24-28 г (n =24, из пяти различных пометов) и НК массой 4.5-6 г (n = 25). Животных дека-питировали, после чего быстро вскрывали грудную клетку, выделяли сердце и промывали раствором Тироде (состав в ммоль/л: NaCl 133.47; KCl 4.69; NaH2PO4-2H2O 1.35; NaHCO3 16.31; MgSO4-7H2O 1.18; CaCl2-2H2O 2.5; глюкоза 7.77), насыщенным карбо-геном (газовая смесь 95% О2, 5% СО2). После этого из каждого сердца выделяли препарат ушка правого предсердия и препарат стенки правого желудочка.

Каждый препарат закрепляли в экспериментальной камере объемом 3 мл (температура 38°С, скорость протока раствора 10 мл/мин) эндокардиальной стороной вверх и стимулировали с помощью серебряных электродов с частотой 6 Гц (ВК и ТНК) или 4 Гц (НК).

ПД регистрировали стандартным методом внутриклеточного отведения биоэлектрической активности с помощью стеклянных микроэлектродов сопротивлением 25-50 МОм, подключенных к усилителю Neuroprobe-1600 (AM-Systems, США). Сигнал оцифровывался на аналогово-цифровом преобразователе Е14-140 (L-Card, Россия) и записывался на компьютере с помощью программы Powergraph v. 3.3 (DiSoft, Россия). Обработку данных проводили в программе MiniAnalysis v. 3.0.1 (Synaptosoft, США). При анализе записей определяли длительность ПД на уровне 50 и 90% реполяризации (ДПД50 и ДПД90 соответственно), а также амплитуду ПД и величину потенциала покоя.

В электрофизиологических экспериментах использовали четыре соединения: селективные блокаторы М1-, М2- и М3-рецепторов - пирен-зепин, метоктрамин и 4-DAMP соответственно, а также агонист М-рецепторов пилокарпин, обладающий небольшой специфичностью по отношению к М1- и М3-рецепторам по сравнению с М2- и М4-рецепторами. Все вещества заказаны в Sigma (США). Концентрации веществ выбраны на основе данных предыдущих исследований [4, 7]. На каждом препарате не более 2 раз записывали эффект пилокарпина в норме или на фоне того или иного блокатора.

Уровни экспрессии генов сравнивали методом РВ-ПЦР. Для этого использовали препараты ушка правого предсердия и стенки правого желудочка, полученные от НК, ТНК и ВК, способом, описанным выше. Препараты помещали в раствор для стабилизации РНК (IntactRNA, «Евроген», Россия) на 24 ч при 4°C, которые затем хранили при -20°C до момента выделения РНК. РНК экстрагировали гуанидинтиоци-анат-фенол-хлороформным методом (ExtractRNA, «Евроген», Россия). РНК от геномной ДНК очищали при помощи ДНКазы I (2 000 ед.акт./мл, NEB, США) в течение 60 мин при 37°C. Концентрацию РНК измеряли при помощи спектрофотометра (Nanodrop 2000, ThermoScientific, США). Для синтеза кДНК суммарную РНК, очищенную от геномной ДНК, подвергали реакции обратной транскрипции с использованием набора MMLVRTkit («Евроген», Россия). Все манипуляции проводили в соответствии со стандартной методикой по протоколам, рекомендованным производителем. кДНК хранили при температуре -80°C до проведения РВ-ПЦР.

РВ-ПЦР проводили на приборе BioRad с системой детекции CFX96 с использованием набора реактивов

компании «Синтол» (Россия) и красителя EvaGreen (ВЮТГОМ, США). Использовали праймеры, синтезированные в ЗАО «Евроген» (5'—3'): М2-рецептор -TCTACACTGTGATTGGTTACTGGC (прямой), GCTTAACTGGGTAGGTCAGAGGT (обратный); МЗ-рецептор - СAAGTGGTCTTCATTGCCTTCT (прямой), GCCAGGCTTAAGAGGAAGTAGTT (обратный); GAPDH -CAGCGATGCTTTACTTTCTGAA (прямой), GATGGCAACAATGTCCACTTT (обратный).

Программа амплификации состояла из начальной денатурации при 95°С, 5 мин; за которой следовало 50 циклов ПЦР (1 мин при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С), а затем последний шаг - 72°С, 10 мин. Данные анализировали пороговым методом при помощи программного обеспечения, поставляемого вместе с амплификатором. Результаты нормировали по количеству РНК, взятому в реакцию обратной транскрипции.

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica V. 6.0. При оценке статистической значимости различий для связанных выборок использовали критерий Вилкоксона, для несвязанных - критерий Манна-Уитни. Использование непараметрических критериев было обусловлено малыми размерами выборок, не позволяющими гарантировать нормальность распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для избирательной стимуляции М3-рецепторов в электрофизиологических экспериментах использовали агонист мускариновых рецепторов пилокарпин (10 мкМ), который подавали в экспериментальную камеру в присутствии высокоселективного блокатора М2-рецепторов метоктрамина (100 нМ). Чтобы исключить возможный эффект активации М1-рецепторов, в специальных предварительных экспериментах пилокарпин подавали в присутствии их селективного антагониста пирензепина (100 нМ). Поскольку никаких различий между выраженностью эффектов пилокарпина на фоне метоктрами-на и на фоне двух блокаторов обнаружено не было, что согласуется с ранними данными об отсутствии М1-рецепторов в кардиомиоцитах, то в дальнейшем для избирательной стимуляции М3-рецепторов пилокарпин подавали на фоне одного метоктрамина.

Помимо регистрации эффектов стимуляции собственно М3-рецепторов, ставили контрольные эксперименты, в которых пилокарпин апплицировали в отсутствие блокаторов, чтобы выявить суммарный эффект активации М2- и М3-рецепторов в препаратах миокарда.

Оказалось, что в отсутствие блокаторов пилокарпин вызывает ярко выраженное уменьшение дли-

тельности ПД как на уровне 50, так и на уровне 90% реполяризации в желудочковом (рис. 1, 2А,Б) и пред-сердном (рис. 2В,Г) миокарде крыс всех трех возрастов. Максимальный эффект пилокарпина развивался в течение 250-300 с от момента начала аппликации вещества, в дальнейшем мы будем обсуждать только максимальные значения эффектов пилокарпина.

Эффект избирательной стимуляции МЗ-рецепто-ров во всех сериях опытов был качественно сходен с действием пилокарпина в отсутствие блокаторов, однако существенно слабее выражен. Тем не менее у НК и ВК наблюдалось статистически значимое уменьшение ДПД50 и ДПД90 как в желудочковом (рис. 1А,В, 2А,Б), так и в предсердном миокарде

А

40

л

а

и 20

^

н

е 0

т

о

п -20

й В

ы н м -40

н

а р -60

б

м -80

е

М ■100

л, 40

а

и ^ 20

н

е т 0

о

п й В -20

ы н м -40

н

а р -60

б

м -80

е

М ■100

40

л,

а и 20

^

н 0

е

т

о п -20

й В

ы м -40

н

н

а -60

р

б м -80

е

М ■100

К

Время, мс

0 \50 100

^ Мет 100 нМ

^^-Мет 100 нМ + пил

1

Время, мс

Мет 100 нМ + пил 10 мкМ

Время, мс

Мет 100 нМ + пил 10 мкМ

Рис. 1. Сопоставление оригинальных записей ПД в препарате изолированной стенки правого желудочка НК (А), ТНК (Б) и ВК (б) в контроле и во время максимального развития эффектов пилокарпина (пил, 10 мкМ) в присутствии селективного блокатора М2-рецепторов метоктрамина (мет, 100 нМ)

Б

б

л

'Л «

I с

ф о

г а

та н

I I

« О

н *

О m

sP m

^ О

ш Q.

, н

н Ф

£ I

■©■ ¡5

25 20 15 10 5 0 -5 -10

■ а 1-1 w ■ ■ Пилокарпин 10 мкМ +

| Пилокарпин 10 мкМ | 1 метоктрамин 100 нМ

Б 25 > s

5 £ 20

Пилокарпин 10 мкМ + метоктрамин 100 нМ + 4-DAMP 10 нМ

Is

*

4 1 1

I?

& n=7

n= 9 n=10 n=8 n= НК 8 IT n= 0 n=12 n=10 ВК

ТН К

5£15

н * 10

О m

sP m с

^О 5 ш Q.

' Ф 0

X

X

ф

т та х м н О

m

н

*

Ф

■ ■

О

Ф Ц

О р

н X

О *

m m

О р

н

Ф

та р

та □

60 50 40 30 20 10 0

НК

I IlI L

n=10 n=10 n=9 n=7 n=10 n=7

ТНК

ВК

x x Ф X

та x

M H

O

L

60

£ 50

о

£40

о

о 30

m

О

20

ф

та 10 р

та

c 0

n=10 n=10 n=9 n=7 n=10 n=7

НК

ТНК

ВК

Рис. 2. Относительное уменьшение длительности ПД в препаратах желудочкового (А, Б) и предсердного (В, Г) миокарда на уровне 50% (А, В) и 90% (Б, Г) реполяризации под действием пилокарпина (10 мкМ) в нормальных условиях, а также в присутствии метоктрамина (100 нМ) и 4^АМР (10 нМ). По оси ординат - максимальная выраженность изменений, вызванных пилокарпином, в % от значений соответствующих величин в контроле. * - статистическая эффекта, критерий Вилкоксона, р < 0.05. & -значимость отличия величин эффекта от соответствующего значения у взрослых крыс, критерий Манна-Уитни, р < 0.05

В

(рис. 2В,Г). Напротив, в группе ТНК значимый эффект избирательной стимуляции МЗ-рецепторов отсутствовал (рис. 1Б, 2). Эффекты избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов практически не проявлялись на фоне селективного блокатора М3-рецепторов 4^АМР (10 нМ), т.е. действительно были опосредованы активацией МЗ-рецепторов (рис. 2).

Важно отметить, что в желудочковом миокарде НК эффект стимуляции МЗ-рецепторов более чем в З раза превосходил эффект у ВК (рис. 2А,Б), в то время как в предсердном миокарде существенных различий в выраженности эффекта не наблюдалось. Таким образом, в желудочковом миокарде эффект МЗ-стимуляции был наиболее выражен у НК, а наименее - у ТНК. В предсердном миокарде основное различие между тремя возрастными группами наблюдалось по реакции на пилокарпин, подаваемый без блокаторов, - выраженность эффекта растет по мере увеличения возраста животного и у ВК более чем в 2 раза превосходит эффект у НК.

Согласно данным РВ-ПЦР, в миокарде животных всех возрастов синтезируется мРНК как М2-, так и МЗ-рецепторов, однако ген последних экспрес-сируется гораздо слабее (рис. 3). При этом уровень экспрессии гена МЗ-рецептора снижается по мере взросления животного как в предсердном, так и в желудочковом миокарде (рис. 3Б), т.е. в миокарде ТНК он выше, чем у ВК. Однако уровень экспрессии гена М2-рецептора был максимальным именно в группе ТНК. Поэтому отношение экспрессии МЗ к М2 в желудочковом миокарде у ВК выше, чем у ТНК - 0.59 против 0.19%. В предсердном миокарде отношение приблизительно одинаковое - 0.16 и 0.18% соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Итак, нами впервые получены сведения об изменении относительного вклада МЗ-рецепторов в регуляцию электрической активности желудочкового и пред-сердного миокарда крыс в постнатальном онтогенезе.

В электрофизиологических экспериментах избирательную стимуляцию М3-рецепторов вызывали ранее неоднократно применявшимся способом [4, 7], а именно, аппликацией 10 мкМ пилокарпина на фоне полной блокады М2-рецепторов 100 нМ метоктра-мина. Отметим, что в нашей ранней работе повышение концентрации метоктрамина не приводило к изменению эффектов пилокарпина, а, следовательно, наблюдаемый в присутствии 100 нМ пилокарпина эффект не связан с активацией остаточных М2-рецепторов. Это подтверждается также практически полным исчезновением эффекта пилокарпина на фоне блокаторов М-рецепторов обоих типов, ме-токтрамина и 4^АМР.

Электрофизиологические данные показывают, что степень воздействия стимуляции М3-рецепторов на электрическую активность желудочкового миокарда максимальна у НК. В предсердном миокарде чувствительность к пилокарпину в отсутствие блокаторов М-рецепторов увеличивается с возрастом, в то время как чувствительность к пилокарпину на фоне блокады М2-рецепторов одинакова у НК и ВК. Можно предположить, что как в пред-сердном, так и в желудочковом миокарде вклад М2-рецепторов в регуляцию электрической активности увеличивается с возрастом, при этом в желудочковом миокарде у НК М3-рецепторы занимают главенствующее положение.

Данные РВ-ПЦР в целом подтверждают эти предположения, поскольку показывают, что экспрессия гена М3-рецептора снижается с возрастом. Остается неясным, почему эффект стимуляции М3-рецепторов не наблюдается у ТНК. С одной стороны, это можно объяснить наименьшим отношением количества мРНК М3- к мРНК М2-рецепторов в этой возрастной группе. С другой стороны, относительный уровень трансляции белков М2- и М3-рецепторов может отличаться от уровня экспрессии мРНК соответствующих генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, результаты нашей работы позволяют предположить важную функциональную роль М3-рецепторов в желудочках новорожденных крысят, которая нивелируется у ВК. При этом функции М3-рецепторов не ограничиваются изученным нами воздействием на электрическую активность. Например, возможно участие М3-рецепторов в реализации кардиопротекторных воздействий АХ [8, 9] в условиях окислительного стресса, испытываемого организмом новорожденного. Связь изменения роли М3-рецепторов с началом симпатической регуляции

НК

Щ=6

ТНК

п=6

ВК п=6

А ед

а р

о т п

е ^

е р

-

2 М2

К Н Р м

о в т с е ч и л о К

д

е н.

т

о а,

р

о т п

е ^

е р

К Н Р м о

с е ч и л о К

3000

2500

2000

1500

1000

500

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Предсердие

Желудочек

Предсердие

Желудочек

Рис. 3. Уровень экспрессии генов М2- (А) и М3-рецептора (Б) в предсердном и желудочковом миокарде НК, ТНК и ВК, выраженный в относительных единицах количества мРНК М2- и М3-рецепторов. * - статистическая значимость различий между возрастными группами, критерий Манна-Уитни, р < 0.05

миокарда представляется маловероятной, поскольку в трехнедельном возрасте перед включением симпатической регуляции эффект стимуляции М3-рецепторов уже отсутствует. •

Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 14-04-01564).

0

Б

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dhein S., van Koppen C.J., Brodde O. // Pharmacol. Res. 2001. V. 44. P. 161-182.

2. Wang H., Lu Y., Wang Z. // Auton. Autac. Pharmacol. 2007. V. 27. P. 1-11.

3. Shi H., Wang H., Yang B., Xu D., Wang Z. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 21. P. 21774-21778.

4. Abramochkin D.V., Tapilina S.V., Sukhova G.S., Nikolsky E.E., Nurullin L.F. // Pflug. Arch. 2012. V. 463. № 4. P. 523-529.

5. Shi H., Wang H., Lu Y., Yang B., Wang Z. // J. Membrane Biol. 1999. V. 169. P. 55-64.

6. Abramochkin D.V., Suris M.A., Borodinova A.A., Kuzmin V.S., Sukhova G.S. // Neurochem. J. 2008. V. 2. P. 90-94.

7. Wang H., Shi H., Lu Y., Yang B., Wang Z. // Br. J. Pharmacol. 1999. V. 126. P. 1725-1734.

8. Yang B., Lin H., Xu C., Liu Y., Wang H., Han H., Wang Z. // Cell. Physiol. Biochem. 2005. V. 16. № 4-6. P. 163-174.

9. Zhao J., Su Y., Zhang Y., Pan Z., Yang L., Chen X., Liu Y., Lu Y., Du Z., Yang B. // Br. J. Pharmacol. 2010. V. 159. № 6. P. 1217-1225.

10. Robinson R.B. // Cardiovasc. Res. 1996. V. 31. P. E68-E76.

11. Зиятдинова Н.И., Сергеева А.М., Дементьева Р.Е., Зефиров Т.Л. // Бюл. эксп. биол. мед. 2012. T. 154. № 7. C. 4-6.

12. Тапилина С.В., Абрамочкин Д.В. // Бюл. эксп. биол. мед. 2015. Т. 159. № 1. С. 11-14.