СМЕЩЕНИЕ РЕПЕРТУАРА ГЕНОВ ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ В-КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

 УДК 571.27

Смещение репертуара генов зародышевой линии В-клеточных рецепторов при рассеянном склерозе

Я. А. Ломакин1*, Л. А. Овчинникова1, М. Н. Захарова2, М. В. Иванова2, Т. О. Симанив2,

М. Р. Кабилов3, Н. А. Быкова4, В. С. Мухина4,5, А. Н. Каминская1, А. Е. Тупикин3,

М. Ю. Захарова1, А. В. Фаворов4, С. Н. Иллариошкин2, А. А. Белогуров1,6, А. Г. Габибов1,7 1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия

2Научный центр неврологии, 6 неврологическое отделение, Москва, 125367 Россия 3Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, 630090 Россия

4Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 119991 Россия 5Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН, Москва, 127051 Россия 6Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава России, Москва, 127473 Россия

7Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991 Россия

*E-mail: lomakin@ibch.ru

Поступила в редакцию 02.09.2022

Принята к печати 20.10.2022

DOI: 10.32607/actanaturae.11794

РЕФЕРАТ Регуляторные функции B-лимфоцитов играют важную роль в развитии и подавлении иммунного ответа. Нарушение противовоспалительной функции В-клеток (Breg) может привести к развитию иммунопатологических процессов, в частности, аутоиммунных заболеваний. К сожалению, точный механизм функционирования и развития регуляторных В-клеток пока не известен, почти ничего не известно об их специфичности и структуре В-клеточного рецептора. С использованием широкомасштабного секвенирования мы проанализировали репертуар B-клеточных рецепторов субпопуляции транзиторных Breg CD19+CD24highCD38high у пациентов с рассеянным склерозом (РС). Впервые показано, что частота встречаемости ряда генов зародышевой линии транзиторных Breg при развитии РС отличается от распределения генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Зарегистрированный сдвиг более выражен у пациентов с высокоактивным РС, чем у пациентов с доброкачественным течением РС. Полученные нами данные позволяют предположить, что изменение репертуара Breg при развитии РС происходит уже на раннем этапе созревания В-клеток.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА рассеянный склероз, нейродегенерация, иммуноглобулины, транзиторные В-клетки, широкомасштабное секвенирование, регуляторные В-клетки, BCR-Seq, зародышевая линия.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ РС - рассеянный склероз; ЦНС - центральная нервная система; ВАРС - высокоактивный рассеянный склероз; ДРС - доброкачественный рассеянный склероз; Breg - регуляторная В-клетка.

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) является наиболее распространенным хроническим аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), диагностированным более чем у 2.3 миллиона человек по всему миру [1]. Механизм запуска этой тяжелой патологии, в частности механизм иммуноопосредованной нейродегенерации, до сих пор не установлен, что существенно затрудняет поиск

стратегии лечения РС [2-4]. Ранее мы показали, что в репертуар антител больных РС входят антитела, кросс-реактивные к белкам вируса Эпштейна-Барр, и определили их структурно-функциональные особенности [5, 6]. С момента открытия РС основная роль в патогенезе этого заболевания отводилась исключительно Т-клеточному звену иммунитета. Однако за последнее десятилетие накоплено множество доказательств, подтверждающих непосред-

ственное участие В-клеток в развитии аутоиммунных процессов, в том числе и при РС [7]. Несмотря на длительность изучения РС, его точная этиология все еще неизвестна. В основе механизмов вирусной индукции заболевания могут лежать молекулярная мимикрия и перекрестная реактивность с последующим увеличением числа узнаваемых эпитопов (epitope spreading) между Т- и В-клетками [5, 8-13]. У пациентов с РС повышен титр аутореактивных антител, специфически связывающих компоненты миелиновой оболочки, у них обнаружены также каталитические иммуноглобулины, гидролизующие основной белок миелина - один из характерных аутоантигенов при РС [14-16].

В последние годы регуляторные В-клетки (Breg) привлекают все большее внимание исследователей [17, 18]. Фундаментальный интерес к этому компоненту гуморального иммунитета обусловлен стремлением понять, как именно В-клетки участвуют в подавлении воспалительного ответа, на какой стадии созревания В-клетка приобретает регуляторные функции и как на это влияет специфичность В-клеточного рецептора. С практической точки зрения Breg привлекают внимание как клетки, непосредственно участвующие в развитии аутоиммунных и лимфопролиферативных патологий. Однако на сегодняшний день невозможно прийти к однозначному выводу, какие процессы происходят при возникновении аутоиммунного воспаления: изменение количества В-регуляторных клеток, нарушение их функций или сочетание двух этих явлений. Также имеется ограниченная информация о специфичности Breg, хотя и показано, что для их правильного функционирования необходим В-клеточный рецептор [19]. Неясно, сопутствуют ли развитию аутоиммунного ответа нарушения в созревании генов иммуноглобулинов Breg, являются ли эти клетки аутореактивными? Неизвестно, на какой стадии развития происходят наиболее значимые изменения в пуле Breg: у наивных, тран-зиторных или зрелых В-клеток. Ранее мы обнаружили повышенное содержание транзиторных Breg в периферической крови пациентов с РС [20]. При этом тяжелая цепь иммуноглобулинов транзи-торных Breg при развитии РС содержит меньшее количество гипермутаций, чем у здоровых доноров.

В представленной работе мы решили прояснить, отличаются ли структуры В-клеточных рецепторов в одной из наиболее полно описанных субпопуляций транзиторных Breg CD19+CD24highCD38high у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Анализ широкомасштабного секвенирования иммуноглобулиновых последовательностей отобранных В-клеток (BCR-Seq) показал, что распределение целого ряда

генов зародышевой линии у больных РС отличается от распределения у здорового человека. Причем анализ общего пула В-клеток периферической крови и субпопуляции регуляторных транзиторных В-клеток у обследованных нами пациентов выявляет как превышение, так и уменьшение встречаемости различных генов зародышевой линии по сравнению со здоровыми донорами. Важно отметить, что это различие более выражено у пациентов со злокачественным типом течения РС - высокоактивным РС (ВАРС) [21] в сравнении с пациентами с доброкачественным течением РС (ДРС) [22].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пациенты с РС и здоровые доноры

Произведен забор периферической крови у девяти пациентов 6 неврологического отделения Научного центра неврологии (Москва, Россия) с РС в возрасте 23-61 года (40.0 ± 9.1) и шести здоровых доноров (табл. 1). Тяжесть заболевания, оцененная по шкале EDSS, варьировала от 1.5 до 8.5 балла. Значения EDSS от 0 до 10 вычисляли по шкале Куртцке EDSS (англ. Expanded Disability Status Scale - расширенная шкала оценки степени инва-лидизации) [23]. В исследование вошли пять пациентов с высокоактивным РС (ВАРС) [21] и четыре пациента с доброкачественным течением РС (ДРС) [22]. Были собраны данные о течении болезни, продолжительности и истории лечения (табл. 1). Исследование одобрено локальным этическим комитетом Научного центра неврологии и проводилось в полном соответствии с Декларацией WMA Хельсинки, ICH GCP и местным законодательством. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие после обсуждения протокола исследования.

Выделение В-клеток из периферической крови

Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с РС и здоровых доноров получены путем седиментационного обогащения в градиенте фикол-ла. Остаточную эритроцитарную фракцию удаляли с помощью лизирующего буфера ACK. Полученные мононуклеарные клетки фильтровали через 40-мм нейлоновый фильтр и окрашивали флуоресцентными антителами: a-CD19-PE-Cy7, a-CD24-PE, a-CD38-APC, a-CD45-APC-Cy7 (Bio-legend, США), и красителем мертвых клеток sytox green dead cell stain (ThermoFisher Scientific, США) в течение 60 мин при +4°C в темноте. Популяции регуляторных транзиторных В-клеток (CD19+CD24highCD38high) и общего пула В-клеток (CD19+) отбирали непосредственно в микроцентрифужные пробирки с лизиру-

Таблица 1. Пациенты с РС и здоровые доноры, участвующие в исследовании

Форма РС1 Возраст, Пол EDSS2 Терапия3 Длительность

лет заболевания, лет

РС1 ДРС 56 Жен. 2.5 Без лечения 11

РС2 ДРС 61 Жен. 3 Без лечения 26

РС3 ДРС 43 Жен. 1.5 Без лечения 12

РС4 ДРС 36 Муж. 2.5 Без лечения 14

РС5 ВАРС 33 Муж. 6 IFNP1b (2006-2011; 2014-2017). 12

РС6 ВАРС 23 Муж. 5 Без лечения 3

РС7 ВАРС 37 Жен. 5 IFNP1b (2014-2016). ГА (2016-2017). 5

РС8 ВАРС 29 Жен. 8 ГА (2012-2014). IVIG (2014). IFNP1b (2015-2016). 12

РС9 ВАРС 39 Жен. 8.5 Без лечения 8

К1 Здоровый 24 Жен. - - -

К2 Здоровый 40 Жен. - - -

К3 Здоровый 36 Муж. - - -

К4 Здоровый 27 Жен. - - -

К5 Здоровый 42 Жен. - - -

К6 Здоровый 25 Жен. - - -

1 РС - пациент с доброкачественным РС; ВАРС - пациент с высокоактивным РС.

2 EDSS - расширенная шкала оценки степени инвалидизации (expanded disability status scale).

3 IFNβ 1Ь - интерферон^-lb; ГА - глатирамера ацетат; IVIG - внутривенный иммуноглобулин.

ющим буфером Qiazol (Qiagen, Германия). Сортинг клеток проводили с помощью проточного флуориме-тра BD FACSAria III.

Подготовка библиотек для секвенирования вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов (RT-PCR)

РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию (RT) проводили с набором MMLV RT с oligo(dT) и случайными праймерами в соответствии с инструкциями производителя («Евроген», Россия). Для амплификации вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека VH и VL использовали 15 прямых праймеров для VH и четыре обратных праймера для J-фрагмента генов тяжелой цепи человека, 13 прямых праймеров Vx, два обратных праймера Jx для легкой каппа-цепи, 16 прямых праймеров Vλ и три обратных праймера Jλ для легкой лямбда-цепи [24]. 15 прямых праймеров VH использовали по отдельности в каждом образце в 50 мкл реакционной смеси с эквимолярной смесью четырех обратных праймеров JH. 13 праймеров Vx и 16 праймеров Vλ использовали по отдельности для амплификации генов VL с соответствующей смесью двух обратных праймеров Vx или трех обратных праймеров Vλ в 50 мкл реакционной смеси для каждого образца. В качестве матрицы в каждой

реакции ПЦР использовали 0.02 мкг кДНК и набор Hot Start Taq Master Mix («Евроген»). Условия ПЦР были следующими: 1 шаг (94°C - 3 мин); 1 цикл (94°C - 25 с, 62°C - 25 с, 72°C - 25 с); 2 цикла (94°C - 25 с, 60°C - 25 с, 72°C - 25 с); 2 цикла (94°C - 25 с, 58°C - 25 с, 72°C - 25 с); 3 цикла (94°C -25 с, 56°C - 25 с, 72°C - 25 с); 3 цикла (94°C - 25 с, 54°C - 25 с, 72°C - 25 с); 30 циклов (94°C - 25 с, 52°C - 25 с, 72°C - 25 с); и финальная элонгация (72°C - 4 мин). Смеси ПЦР 15 образцов для генов VH, 13 образцов для генов Vx и 16 образцов для генов νλ были объединены по отдельности для генов VH, Vx и νλ и сконцентрированы до 50-80 мкл с использованием Amicon 30 кДа (Merck, Millipore). Продукты ПЦР (около 400 п.н.) VH, Vx и Vλ наносили на 1.5% агарозные гели и очищали с помощью набора для очистки ДНК из агарозного геля (Monarch, NEB).

Глубокое секвенирование вариабельных фрагментов генов VH, Vx и Vk иммуноглобулинов

Очищенный ПЦР-продукт (1 мкг) VH, Vx и Vλ лигировали с адаптерами NEBNext Multiplex Oligos с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra для Illumina (NEB). Библиотеки секвенировали на Miseq с использованием набора для секвенирования 2*300 п.н. (Illumina) в ЦКП «Геномика» СО РАН (ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск, Россия).

Анализ данных высокопроизводительного секвенирования

Данные высокопроизводительного секвенирования анализировали с использованием программы MiXCR [25] в два этапа. Сначала исходные данные обрабатывали с помощью алгоритма MiXCR по умолчанию (выравнивание, сборка, экспорт) с использованием библиотеки IMGT в качестве референса на гены зародышевых линий. Полученные прочтения, успешно выровненные с генами зародышевой линии и содержащие полную целевую последовательность гена иммуноглобулина (CDR1 + FR2 + CDR2 + FR3 + CDR3), подвергали повторной выборке для нормирования различных количеств прочтений. При анализе частоты встречаемости генов зародышевой линии не учитывали мутации в вариабельных фрагментах VH, Vx и VL

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы Prism 6 с использованием теста Манна-Уитни и парного ί-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы появляется все больше свидетельств, доказывающих значимость В-клеток в регуляции аутоиммунных заболеваний, включая РС [26, 27]. Тем не менее, субпопуляции Breg у пациентов с РС все еще недостаточно охарактеризованы. На текущий момент опубликовано чрезвычайно мало данных о специфичности и последовательности их В-клеточных рецепторов. Чтобы глубже понять природу развития и охарактеризовать процесс созревания Breg, мы проанализировали субпопуляцию CD19+CD24highCD38high - один из наиболее подтвержденных фенотипических портретов тран-зиторных Breg, находящихся на промежуточной стадии между незрелыми клетками костного мозга и полностью зрелыми наивными В-клетками периферической крови и вторичных лимфоидных тканей [28, 29]. Образцы периферической крови получены от 9 больных c РС и шести условно здоровых доноров (табл. 1). Мононуклеарные клетки окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD19, CD24 и CD38. Общий пул CD19+ B-клеток и субпопуляцию транзиторных Breg CD19+CD24highCD38high сортировали по отдельности для последующего выделения РНК и анализа последовательностей В-клеточных рецепторов. Для этого последовательности генов вариабельных фрагментов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей иммуноглобулинов каждого пациента были амплифицированы с кДНК, синтезированной на основе выделенной РНК, после чего проводили широкомасштабное секвенирование генов

вариабельных фрагментов VH, Vx и νλ. Целевое секвенирование репертуара иммуноглобулинов общего пула В-клеток и субпопуляции транзиторных Breg было выполнено с покрытием не менее пяти функциональных прочтений на отобранную клетку. После всех этапов биоинформатической фильтрации было получено в среднем по 83100 функциональных последовательностей тяжелой цепи, 37591 - каппа-цепи и 34565 последовательностей лямбда-цепи общего пула CD19+ клеток и субпопуляции CD19+CD24highCD38high транзиторных Breg каждого индивида. Последовательности доступны на репозитории ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/ arrayexpress/experiments/E-MTAB-10859).

Частоту встречаемости генов зародышевой линии VH, Vx, Vλ мы анализировали с использованием праймеров, способных амплифицировать практически все возможные варианты функциональных фрагментов VHDJH, VJx и VJr При сравнении распределения генов IgVH у пациентов с РС и условно здоровых доноров амплифицировались все семь функциональных семейств VH. Гены зародышевой линии IGHV3 наиболее часто встречались у пациентов с РС и здоровых доноров как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. Последовательности иммуноглобулинов, относящихся к генам зародышевой линии IGHV2-26, IGHV2-5, IGHV2-70, представленные в небольшом количестве практически у каждого здорового индивида, исчезают при развитии РС (рис. 1). Необходимо отметить, что при более тяжелой форме заболевания (ВАРС) смещение репертуара генов иммуноглобулинов по сравнению с условно здоровыми донорами более значительно, чем в случае сравнения ДРС и условно здоровых доноров. Гермлайн IGHV3-66 встречается у здоровых доноров и ДРС на сопоставимом уровне, но практически полностью исчезает у пациентов с ВАРС. Один из наиболее распространенных гермлайнов IGHV5-51 выявлен у всех анализируемых доноров, но в случае развития РС частота встречаемости этого гена зародышевой линии также значимо снижается. При этом единственный ген IGHV4-31, наоборот, при РС чаще встречается как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. Это коррелирует с ранее опубликованными данными о повышенном содержании семейства IGHV4 в репертуаре В-клеток из периферической крови и цереброспинальной жидкости пациентов с РС [30, 31].

Репертуар генов, кодирующих легкие цепи иммуноглобулинов Breg, различается также у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Гермлайн IGKV1-12, встречающийся в норме примерно в 2% иммуноглобулиновых последовательностей, падает ниже

с;

ξ

Q.

О

О

<D

>.

О

CD

CD

З

л

се

о

Q.

>.

О

>.

*

Э-

о

>5~

Q)

Ι-

Ο

0

1 л

о

о

с

X

-О

со

о

£

0

1

>.

20 **p=0.0479

20 "p=0.038

10

*p=0.035

10 0 tBreg Tot

0 0

10

Q- CL И- Q- ÇL а.

< d і <5 і

LÛ "l2J

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

IGHV2-26

^0009, "p=0 019

0 3 *p=0^115 [^00 20 1 0

0 0

.і: i·

OOOb ...........

CL CL CL < d I

t_U

tBreg

tBreg Total

•. \ РС_ ВАРС ~дрс

IGHV2-70

"p=0. 009

0 25 0.20 0.15 0.10 0.05 0

1.0-

0.0

РС ВАРС ДРС

_ί-:—i

РС ВАРС ~ДРС

: h

Lü

tBreg

: : ■ :

Total

B-клетки

РС ВАРС ДРС

! il l

о о о о о о х

CL CL CL CL CL CL

< d І < d І

tBreg Total

В-клетки

20 ""p=0.0423

tBreg Total

r"p=0.0465

:ί:."

РС ВАРС ДРС

IGHV3-66

2 "p=0.038 4

■І .1

о о о ооох

CL d CL CL LÜ.

< d I < d I

UJ zü

tBreg Total

В-клетки

IGHV4-31

"p=0.038

"p=0.022

p=0.008

"p=0.019

m

ooo^c ooo^c

CL CL CL CL CL CL < d I < d I

lJ uJ

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

χ:

РС ВАРС ДРС

*0=0.022 8

4 0

і 0 і

ООО^ О О О

CL CL CL CL CL CL

< d і < d і

tBreg Total

В-клетки

"p=0.01<

І І

ООО* О О О X

CL CL CL CL CL CL

< d i < d і

?_J LJ

tBreg Total

L L L L L L

< d I < d I

Zj Zj

tBreg Total

В-клетки

IGHV5-51

"p=0.009

10 "p=0r°l·4 15

РС ВАРС ДРС

о о о * υ ο ο ο ^

CL CL CL CL CL CL

< d I < d I

< d і

LjJ

tBreg

< d і

id

Total

'I -!:

РС~ ВАРС ДРС

Тяжелая цепь иммуноглобулина (IGHV)

транзиторные Breg общий пул В-клеток

tBreg

CD19*CD24h|ghCD38h|gh

пациенты с высокоактивным РС (ВАРС) Z пациенты с доброкачественным РС (ДРС) I I пациенты с рассеянным склерозом (РС) здоровые доноры (К)

"p - тест Манна-Уи ""p - парный f-тес

К

К

К

2.0

tBreg Total

0.08

20

0.04

0.00

tBreg

Total

B-клетки

К

К

К

p=0 023 7

6

4

tBreg Total

tBreg Total

2

8

0

4

0

К

К

К

p=0.047

8

0

tBreg Total

tBreg Total

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

К

К

К

4

0

tBreg Total

tBreg Total

tBreg Total

4

РС ВАРС ДРС

B-клетки

Рис. 1. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты тяжелой цепи (VH) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализировано 49 функциональных генов VH в группах пациентов с РС, с доброкачественным течением РС (ДРС) и с высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) - частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19+) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19+CD24hlghCD38hlgh. Сравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean± SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total - серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg - зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров - тест Манна-Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) - парный t-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

CÖ

2

Q.

0

О

>S

0

>.

о

m

0

З

-Û

d

о

о.

>.

о

>

*

3

о

о

>sf

0

Ι-

Ο

0

1 -О

о

X

-Û

m

о

с.

0

1

>

сс

I*

о о о х о о о х

Q- CL Q- CL CL CL

< с[ < с[

ш ш

t t—I L_LJ

tBreg Total

В-клетки

IGKV1-12

4 ”r>=0 009

JffliM

OOOX OOOX Q- CL Q_ CL CL CL < C[ < C[

m m

t 4-І t t_| tBreg Total

IGKV2D-29

4

*p=0.009 T *p=0.029

II-·.

ooox ooox

CL CL CL CL CL CL

< c[ < c[

CO CD

t_L=I t t-| tBreg Total В-клетки

IGKV4-1

20

ooox ooox

CL CL CL CL CL CL

< c[ < c[

CD Ш

t_LJ LLJ

tBreg Total

tBreg Total

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

£

ooox ooox

CL CL CL CL CL CL

< C[ < C[

CD Ш

t *—1 t t-l

tBreg Total

о oox ooox

CL CL CL CL CL CL

< c[ < c[

CD Ш

t t-l i_LJ

tBreg Total

В-клетки

IGKV1-33

4 *p=0.019

tBreg Total

””p=0.0167

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

І і '

10

CL CL CL CL CL CL

< c[ < c[

CD CD ■

t t-ι \___LJ

tBreg Total 0

В-клетки

РС ВАРС ДРС

о о о х ооох

CL CL CL CL CL CL

< с[ < с[

ш ш

t 4—I t t—I

tBreg Total

В-клетки

tBreg Total

””p=0.0346

РС ВАРС ДРС

IGKV3D-20

4ı

*p=0.009 ' ”p=0.029İ

И

о о о х о о о х

CL CL CL CL CL CL

< с[ < с[

m m

t t-l LJ=I

tBreg Total В-клетки

IGKV6D-21

*p=0.019

1

ЛТІпппП

o o o х о о о х

CL CL CL CL CL CL < C[ < C[

Ш Ш

i_LJ i_LJ tBreg Total

РС ВАРС ДРС

К

К

К

40

2

20

0

0

”"p=0.001U

0

К

К

0

2

2

4

0

0

p=0.0385

0

IGKV3-11

К

К

К

2

0

0

tBreg Total

tBreg Total

tBreg Total

4

0

0

IGKV6-21

К

К

К

20

0

tBreg Total

tBreg Total

2

p=0.0238

20

0

Легкая каппа-цепь иммуноглобулина (IGKV)

транзиторные Вгед общий пул В-клеток

CD19+CD24hıghCD38hıgh CD19+

I I пациенты с высокоактивным РС (ВАРС)

I I пациенты с доброкачественным РС (ДРС) I I пациенты с рассеянным склерозом (РС)

I I здоровые доноры (К)

*p - тест Манна-Уитни "p - парный Г-тест

Рис. 2. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты легкой каппа-цепи (Vx) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализирован 41 функциональный ген Vx у пациентов с РС, пациентов с доброкачественным течением РС (ДРС) и высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) - частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19+) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19+CD24h'9hCD38hlgh. Сравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean±SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total - серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg - зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров - тест Манна-Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) -парный t-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

1% при ВАРС (рис. 2). При более легком течении заболевания (ДРС) частота этого гена не отличается от частоты у условно здоровых доноров. Ген зародышевой линии IGKV1-33 встречается реже уже не только у пациентов с ВАРС, но и в объединенной группе больных РС, включающей оба течения заболевания. Гены IGKV2D-24, IGKV3-11 и IGKV6D-21, наоборот, значительно чаще встречаются у пациентов с ВАРС, чем у условно здоровых доноров. Гены IGKV2D-29, IGKV3D-20 и IGKV6-21 встречаются чаще как у пациентов с ВАРС, так и в группе РС в целом. Следует заметить, что распределение генов зародышевой линии, кодирующих легкую каппа-цепь, в популяции транзиторных Breg не отличается статистически значимо у пациентов с ДРС и условно здоровых доноров.

При анализе изотипа лямбда легкой цепи аналогично наблюдаются различия в распределении генов зародышевой линии (рис. 3). Гермлайн IGLV1-36 практически не встречается у здоровых доноров и ДРС, но его частота резко возрастает до 0.5% у пациентов с ВАРС. Частота встречаемости генов зародышевой линии IGLV1-44 и IGLV3-21 повышена при любом типе течения РС, однако статистически значимые различия наблюдаются только между пациентами с ВАРС и условно здоровыми донорами. Распределение гермлайнов IGLV2-8, IGLV2-14 и IGLV2-23 не различается между пациентами с ДРС и условно здоровыми донорами, но их частота резко падает при развитии ВАРС. Интересно, что представленность гена зародышевой линии IGLV7-43, наоборот, находится примерно на одинаковом уровне у пациентов с ВАРС и условно здоровых доноров, но резко уменьшается у пациентов с ДРС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунологические исследования XXI века подтвердили ключевую роль В-регуляторного звена в поддержании иммунотолерантности, контроле и подавлении воспалительного ответа. На сегодняшний день все еще остается множество открытых вопросов о точном механизме регуляции, но очевидно, что нарушения в количестве Breg и их функционировании приводят к возникновению целого ряда иммунологических патологий, среди которых особенно выделяется РС. Детальное прояснение механизмов регуляции воспалительного ответа Breg позволит не только определить этиологию аутоиммунных патологий, но и может способствовать созданию терапии на основе Breg в ближайшем будущем. Иммуноглобулины, экспонированные как антиген-специфичные рецепторы на поверхности В-клеток, а также в виде секретируемых

антител играют важную роль в иммунном ответе. Прогресс последних лет в области широкомасштабного секвенирования позволяет исследовать репертуары иммуноглобулинов с беспрецедентно высоким уровнем детализации [32]. Таким образом, изучение структуры и функций иммуноглобулинов, их специфичности и эпигенетического статуса представляется чрезвычайно важным для понимания фундаментальных основ возникновения и прогрессии РС. В последние годы обнаруживается все больше закономерностей и стереотипных ответов антител, когда у разных индивидов вырабатываются иммуноглобулины, распознающие определенные антигенные эпитопы с использованием одних и тех же генов IgV [32-34]. Другими словами, определенные зародышевые линии иммуноглобулинов проявляют тропность к определенным антигенам. Соответственно, вариации использования некоторых генов зародышевой линии могут быть связаны с различной способностью организма генерировать эффективный иммунный ответ, что может проявляться в виде предрасположенности к различным заболеваниям, в том числе и аутоиммунной природы. Вполне вероятно, что различия в частоте встречаемости генов зародышевой линии у каждого конкретного индивида могут быть результатом противовирусного или аутоиммунного ответа организма. До начала антигензависимой дифференцировки В-клеток, обусловленной соматической гипермутацией генов иммуноглобулинов, разнообразие незрелых В-клеток, к которым относятся и транзиторные Breg, практически полностью обусловлено конфигурацией генов зародышевой линии организма (V(D) J-рекомбинация). Поэтому детальное изучение репертуара иммуноглобулинов незрелых В-клеток у пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, в том числе РС, поможет обнаружить, какие именно перестройки в генах зародышевой линии способны приводить к функциональным нарушениям иммунной системы.

В настоящей работе показано, что распределение генов зародышевой линии иммуноглобулинов в популяции транзиторных Breg у больных РС отличается от распределения у условно здорового человека. Особенно значимые отличия наблюдаются для гермлайнов IGLV1-44 и IGHV2-5. Ген лямбда-цепи IGLV1-44 практически не представлен в субпопуляции транзиторных Breg условно здорового человека, но достоверно проявляется у пациентов с РС. При РС гермлайн IGHV4-31 встречается чаще как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. С зародышевыми линиями IGHV2-26, IGHV2-5, IGHV2-70 тяжелой цепи наблюдается обратная картина - эти гермлайны,

СО

Q.

(D

(D

ω

о

>>

0

CÛ

(D

1

XI

d

о

Q.

СО

0

1 I

СО

со

СО

IX

о

о

CD

Ι-

Ο

0

1

X

с;

CD

Н

СО

CÛ

О

d

CD

О

О

1=

X

X

§.

νο

о

с;

ΐ-

Ο

X

с;

о

d

IGLV1-44

”p=0.009

201

IGLV3-1

20

J 0ι

О О О X О О О X

Q- Q- Q- Q- Q- О.

< С[ І < С[ І

lU lU

tBreg Total

B-клетки

IGLV7-43

*p=0.009 ”p=0.029

Ml

ooox ooox

CL CL Q_ CL CL CL < C[ I < C[ I

tBreg Total В-клетки

tBreg Total

"p=0.0201

N.:

РС ВАРС ДРС

Hi

OOQX OOQX CL CL CL CL CL CL < Hi I < Hi I

tBreg

В-клетки

IGLV3-19

40 20

İlil

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

tBreg Total

0 0 20

OOQX OOQX

CL CL CL CL CL CL

< C[ I < C[

0

tBreg Total

В-клетки

IGLV8-61

20 40

0.1

0 tBreg Total

40 "p=0.0i08

*p=0.0328 \

РС ВАРС ДРС

tBreg Total

20-

0 0й-

10CL CL CL CL CL CL

< C[ I < C[ i -

0і

tBreg Total

В-клетки

РС ВАРС ДРС

К

К

20

p=0.0085

0

0

Total

К

20

0

К

К

50

p=0.0470

К

К

40

20

0

ООО^ ООО^ CL CL CL CL CL CL

< Hi I < Hi I

tBreg Total

"p=0.0108

. _ Q

IN ^ In

tBreg

РС ВАРС ДРС

IGLV2-23

8

IGLV3-21

15

”p=0.009 ”p=0.007

U

OOQX OOQX CL CL CL CL CL CL

< C[ I < C[ I

tBreg Total

РС ВАРС ДРС

tBreg Total В-клетки

”p - тест Манна-Уитни "p - парный f-тест

К

20

10

0

20

0

Total

p=0.038

4

0

К

8

4

0

5

0

Легкая лямбда-цепь иммуноглобулина (IGLV) транзиторные Breg общий пул В-клеток

CD19+CD24h|ghCD3S1|gh CD19+

I I пациенты с высокоактивным РС (ВАРС)

I I пациенты с доброкачественным РС (ДРС) I I пациенты с рассеянным склерозом (РС)

I I здоровые доноры (К)

Рис. 3. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты легкой лямбда-цепи (νλ) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализировано 26 функциональных Vλ генов у пациентов с РС, пациентов с доброкачественным течением РС (ДРС) и высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) - частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19+) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19+CD24h'9hCD38hlgh. Сравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean±SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total - серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg - зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров - тест Манна-Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) - парный f-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

представленные, хоть и в небольшом количестве, практически у каждого здорового индивида, исчезают при развитии РС. При этом отличия от нормальных значений увеличиваются в случае более тяжелой формы заболевания. Интересно отметить, что ранее мы обнаружили также более существенные отличия в количестве транзиторных Breg и уровне их зрелости у пациентов с ВАРС по сравнению с ДРС и условно здоровыми донорами [20]. Таким образом, нами показано, что более значимые сдвиги в репертуаре субпопуляции транзиторных В-регуляторных клеток с фенотипом CD19+CD24hlghCD38hlgh ассоциированы с осложненным течением РС. В целом, для всех зародышевых линий, кроме IGLV1-44, мы наблюдаем сходную картину - если при развитии РС изменяется частота встречаемости данного гена в общем пуле циркулирующих В-клеток, то сходная картина выявляется также и у транзиторных В-регуляторных клеток. Таким образом, отклонения в распределении генов иммуноглобулиновых рецепторов при развитии аутоиммунной патологии РС могут быть предопределены генетически и происходят уже

на ранней стадии созревания В-клеток. Дальнейшее развитие этой гипотезы требует расширения когорт пациентов, а также изучения различий в структуре и специфичности В-клеточных рецепторов других субпопуляций Breg. ·

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 18-74-10079 «Самособирающиеся генетически кодируемые наноконтейнеры как инструмент лечения рассеянного склероза», гранта РФФИ № 17-00-00229 (получение периферической крови больных рассеянным склерозом и здоровых доноров) и проекта 075-15-2021-1033 (13.2251.21.0111) в терминах широкомасштабного секвенирования.

Клеточный сортинг проводили с использованием оборудования, предоставленного ИБХ Центром коллективного пользования (ЦКП ИБХ РАН), поддержан Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (075-15-2020-807).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Thompson A.J., Baranzini S.E., Geurts J., Hemmer B., Cic-carelli O. // Lancet. 2018. V. 391. P. 1622-1636. https://doi. org/10.1016/S0140-6736(18)30481-1.

2. Belogurov A., Kuzina E., Kudriaeva A., Kononikhin A., Kovalchuk S., Surina Y., Smirnov I., Lomakin Y., Bacheva A. Stepanov A., et al. // FASEB J. 2015. V. 29. P. 1901-1913. https://doi.org/10.1096/fj.14-259333.

3. Belogurov A.A., Stepanov A.V., Smirnov I.V., Melamed D., Bacon A., Mamedov A.E., Boitsov V.M., Sashchenko L.P., Ponomarenko N.A., Sharanova S.N., et al. // FASEB J. 2013. V. 27. P. 222-231. https://doi.org/10.1096/fj.12-213975.

4. Belogurov A., Kudriaeva A., Kuzina E., Smirnov I., Bobik T., Ponomarenko N., Kravtsova-Ivantsiv Y., Ciechanover A., Gabibov A. // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. P. 17758-17766. https://doi.org/10.1074/JBC.M113.544247.

5. Gabibov A.G., Belogurov A.A., Lomakin Y.A., Zakharova M.Y., Avakyan M.E., Dubrovskaya V.V., Smirnov I.V., Ivanov A.S., Molnar A.A., Gurtsevitch V.E., et al. // FASEB J. 2011.

V. 25. P. 4211-4221. https://doi.org/10.1096/fj.11-190769.

6. Lomakin Y.A., Zakharova M.Y., Stepanov A.V., Dronina

M. A., Smirnov I.V., Bobik T.V., Pyrkov A.Y., Tikunova N.V., Sharanova S.N., Boitsov V.M., et al. // Mol. Immunol. 2014.

V. 62. P. 305-314. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2014.01.013.

7. Baecher-Allan C., Kaskow B.J., Weiner H.L. // Neuron. 2018. V. 97. P. 742-768. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.01.021.

8. Ziganshin R.H., Ivanova O.M., Lomakin Y.A., Belogurov A.A., Kovalchuk S.I., Azarkin I.V., Arapidi G.P., Anikanov

N. A., Shender V.O., Piradov M.A., et al. // Mol. Cell. Pro-teomics. 2016. V. 15. P. 2366-2378. https://doi.org/10.1074/mcp. M115.056036.

9. Ramasamy R., Mohammed F., Meier U.C. // Immunol. Lett. 2020. V. 217. P. 15-24. https://doi.org/10.1016/j.imlet.2019.10.017.

10. Wekerle H., Hohlfeld R. // N. Engl. J. Med. 2003. V. 349.

P. 185-186. https://doi.org/10.1056/NEJMcibr035136.

11. Lomakin Y., Arapidi G.P., Chernov A., Ziganshin R., Tcy-ganov E., Lyadova I., Butenko I.O., Osetrova M., Ponomarenko N., Telegin G., et al. // Front. Immunol. 2017. V. 8. https:// doi.org/10.3389/fimmu.2017.00777.

12. Lanz T.V., Brewer R.C., Ho P.P., Moon J.-S., Jude K.M., Fernandez D., Fernandes R.A., Gomez A.M., Nadj G.S., Bartley C.M., et al. // Nature. 2022. V. 603. P. 321-327. https://doi. org/10.1038/s41586-022-04432-7.

13. Bjornevik K., Cortese M., Healy B.C., Kuhle J., Mina M.J., Leng Y., Elledge S.J., Niebuhr D.W., Scher A.I., Munger K.L., et al. // Science. 2022. V. 375. P. 296-301. https://doi. org/10.1126/science.abj8222.

14. Gabibov A.G., Ponomarenko N.A., Tretyak E.B., Paltsev M.A., Suchkov S.V. // Autoimmun. Rev. 2006. V. 5. P. 324-330. https://doi.org/10.1016/j.autrev.2006.01.004.

15. Ponomarenko N.A., Durova O.M., Vorobiev I.I., Belogurov A.A., Kurkova I.N., Petrenko A.G., Telegin G.B., Suchkov

S. V., Kiselev S.L., Lagarkova M.A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 281-286. https://doi.org/10.1073/ pnas.0509849103.

16. Lomakin Y., Kudriaeva A., Kostin N., Terekhov S., Kaminskaya A., Chernov A., Zakharova M., Ivanova M., Simaniv T., Telegin G., et al. // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 12679. https://doi. org/10.1038/s41598-018-30938-0.

17. Sokolov A.V., Shmidt A.A., Lomakin Y.A. // Acta Naturae. 2018. V. 10. P. 11-22.

18. Ran Z., Yue-Bei L., Qiu-Ming Z., Huan Y. // Front. Immunol. 2020. V. 11. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01884.

19. Matsumoto M., Fujii Y., Baba A., Hikida M., Kurosaki

T. , Baba Y. // Immunity. 2011. V. 34. P. 703-714. https://doi. org/10.1016/j.immuni.2011.03.016.

20. Lomakin Y.A., Zvyagin I.V., Ovchinnikova L.A., Kabilov M.R., Staroverov D.B., Mikelov A., Tupikin A.E., Zakharova M.Y., Bykova N.A., Mukhina V.S., et al. // Front. Immunol. 2022. V. 13. P. 3678. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.803229.

21. Diaz C., Zarco L.A., Rivera D.M. // Mult. Scler. Relat.

Disord. 2019. V. 30. P. 215-224. https://doi.org/10.1016/j. msard.2019.01.039.

22. Schaefer L.M., Poettgen J., Fischer A., Gold S., Stellmann J.P., Heesen C. // Brain Behav. 2019. V. 9. Р e01259. https://doi. org/10.1002/brb3.1259.

23. Sand I.K., Krieger S., Farrell C., Miller A.E. //

Mult. Scler. J. 2014. V. 20. P. 1654-1657. https://doi. org/10.1177/1352458514521517.

24. Cheng J., Torkamani A., Grover R.K., Jones T.M., Ruiz D.I., Schork N.J., Quigley M.M., Hall F.W., Salomon D.R., Lerner R.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. P. 560-565. https://doi.org/10.1073/pnas.n01148108.

25. Bolotin D.A., Poslavsky S., Mitrophanov I., Shugay M., Mamedov I.Z., Putintseva E.V., Chudakov D.M. // Nat. Meth. 2015. V. 12. P. 380-381. https://doi.org/10.1038/nmeth.3364.

26. Choi J.K., Yu C.R., Bing S.J., Jittayasothorn Y., Mattapal-lil M.J., Kang M., Park S.B., Lee H.S., Dong L., Shi G., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021. V. 118. https://doi. org/10.1073/PNAS.2109548118.

27. Radomir L., Kramer M.P., Perpinial M., Schottlender N., Rabani S., David K., Wiener A., Lewinsky H., Becker-Her-man S., Aharoni R., et al // Nat. Commun. 2021. V. 12. https://

doi.org/10.1038/S41467-021-22230-Z.

28. Blair P.A., Norena L.Y., Flores-Borja F., Rawlings D.J., Isenberg D.A., Ehrenstein M.R., Mauri C. // Immunity. 2010. V. 32. P. 129-140. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.11.009.

29. Zhu H.-Q., Xu R.-C., Chen Y.-Y., Yuan H.-J., Cao H., Zhao X.-Q., et al. // Br. J. Dermatol. 2015. V. 172. P. 101-110. https:// doi.org/10.1111/bjd.13192.

30. von Büdingen H.C., Kuo T.C., Sirota M., van Belle C.J., Apeltsin L., Glanville J., Cree B.A., Gourraud P.A., Schwartz-burg A., Huerta G., et al. // J. Clin. Invest. 2012. V. 122.

P. 4533-4543. https://doi.org/10.1172/JCI63842.

31. Owens G.P., Winges K.M., Ritchie A.M., Edwards S., Bur-goon M.P., Lehnhoff L., Nielsen K., Corboy J., Gilden D.H., Bennett J.L. // J. Immunol. 2007. V. 179. P. 6343-6351. https:// doi.org/10.4049/jimmunol.179.9.6343.

32. Mikocziova I., Greiff V., Sollid L.M. // Genes Immun. 2021. V. 22. P. 205-217. https://doi.org/10.1038/s41435-021-00145-5.

33. Henry Dunand C.J., Wilson P.C. // Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015. V. 370. https://doi.org/10.1098/ RSTB.2014.0238.

34. Wang Y., Yuan M., Lv H., Peng J., Wilson I.A., Wu N.C. // Immunity. 2022. V. 55. P. 1105-1117.e4. https://doi.org/10.1016/j. immuni.2022.03.019.