CC BY
181
УДК 619:616
СЛЮНА - НОВЫЙ ОЪЕКТ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ У ЖИВОТНЫХ
Р.Я. ГИЛЬМУТДИНОВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
А.В. ИВАНОВ, член-корреспондент РАСХН, директор
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
М.К. МАХАМАТ, аспирант Е.С. ПОКРОВСКАЯ, аспирант Казанская ГАВМим. Н.Э. Баумана E-mail: gilmrust@rambler.ru
Резюме. Рассмотрен ряд методологических вопросов получения (фармакологическая стимуляция растворами цитрата натрия, пилокарпина гидрохлорида, прозерина) и исследования (сезонность, половая принадлежность животного, преанали-тические процедуры) слюны крупного рогатого скота и овец, изменения ее комплементарной активности при гельминтозах (стронгилоидоз и мониезиоз) и дегельминтизации фебталом. Изучено влияние фармакологических препаратов (2 %-ный раствор цитрата натрия, 1 %-ный раствор пилокарпина гидрохлорида и 0,05 %-ный раствор прозерина) на интенсивность и продолжительность слюнотечения у коров и овец. Наиболее предпочтительно использовать пилокарпина гидрохлорид, 1 %-ный раствор которого с целью уменьшения побочных эффектов рекомендуется применять в половинной дозе. После стимуляции пилокарпином появление первых и выраженных признаков слюноотделения наблюдали у животных через одинаковые периоды времени (15 и 20 мин.) не зависимо от их видовой принадлежности. Различия отмечали лишь в скорости слюноотделения. Показаны половые различия и сезонная зависимость качественного и количественного состава транзиторной микрофлоры жвачных, связанные, скорее всего, с рационом питания, способом содержания и температурой окружающей среды. При сравнительном исследовании эффективности методик Вагнера Г.Ф. (1963) и РезниковойЛ.С. (1967) по определению комплементарной активности слюны выявлено преимущество последней и предлагается ее модификация, путем дополнения стандартного ряда еще одной пробой, в которую рекомендуется вносить по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. При этом слюна должна быть неразбавленной и нецентрифугированной. При гельминтозах комплементарная активность слюны животных снижение, после дегельминтизации она увеличивается и приближается к нормативному значению (хотя у овец остается ниже нормы).
Ключевые слова: слюна, крупный рогатый скот, овцы, комплемент, паразитозы, неспецифическая резистентность, пилокарпин, резерпин.
Слюна гораздо динамичнее отражает изменения в организме, чем такой классический диагностический объект, как кровь [1, 2]. В ней, помимо воды и минеральных компонентом, содержатся белки, их фракции и аминокислоты (в том числе муцин), широкий спектр ферментов, холестерин, витамины, большое разнообразие факторов специфической и неспецифической защиты [3]. Присутствие факторов неспецифического иммунитета и резистентности в слюне определяется, очевидно, и наличием в ротовой полости широкого видового спектра микроорганизмов [4].
На сегодня ряд выявленных протеинов слюны человека используют как индикаторы болезней Альцгеймера и Паркинсона, онкологических заболеваний, диабета, ВИЧ и гепатита. Предполагается, что в ближайшей перспективе исследования слюны станут основой для быстрой первичной диагностики многих заболеваний, диагностируемых сегодня только по образцам крови [5]. Несмотря на более высокую точность анализа крови, слюна в качестве объекта
экспресс-диагностики, очевидно, имеет право на существование. Большие перспективы, на наш взгляд, есть у скрининга патологических состояний по слюне в ветеринарии, так как животные, особенно сельскохозяйственные, содержатся продолжительное время в практически идентичных условиях, получая один и тот же рацион, что, естественно, должно повышать стабильность величин показателей их слюны. Тем не менее, в ветеринарии изучение слюны осуществляется в значительно меньших объемах, и не вышло пока за пределы исследовательских лабораторий.
При различных заболеваниях, в том числе гельминтозах, активность комплемента слюны падает. Например, стронгилоидоз связан с сенсибилизирующим, механическим и токсическим действием нематоды Strongyloides papШosus, которая вызывает сенсибилизацию организма животного продуктами собственного метаболизма. Продукты жизнедеятельности мониезий также обусловливают значительные патологические изменения в организме инвазированного животного, интоксикация задерживает развитие, ослабляет сопротивляемость воздействию различных вредных факторов, увеличивает восприимчивость ко всякого рода вторичным инфекциям и инвазиям. Все эти изменения отражаются и на комплементарной активности слюны.
В связи с изложенным цель нашей работы - рассмотреть ряд методологических вопросов получения и исследования слюны крупного рогатого скота и овец, определить изменение ее комплементарной активности при паразитозах.
При этом решали следующие задачи:
подобрать оптимальную методику получения достаточных для проведения исследований объемов слюны;
определить сезонную вариабельность видового спектра микрофлоры ротовой полости крупного и мелкого рогатого скота;
изучить методологические особенности исследования комплементарной активности слюны и сыворотки крови;
выявить изменения в активности комплемента при гельминтозах и после дегельминтизации.
Условия, материалы и методы. Опыты проводили на клинически здоровых овцах (15 гол.) и баранах (15 гол.) романовской породы в возрасте 2-х лет, а также коровах (30 гол.) черно-пестрой породы в возрасте 4...6 лет.
При определении оптимальной методики получения достаточных объемов слюны испытаны методы локального (2 %-ным раствором цитрата натрия) и системного (1 %-ным раствором пилокарпина гидрохлорида и 0,05 %-ным раствором прозерина) фармакологического стимулирования слюноотделения у животных.
Раствор цитрата натрия наносили с помощью тампона на дорсо-латеральную поверхность языка через каждые 30 сек. в течение 2 мин. Пилокарпин для подкожного введения в виде порошка труднодоступен, поэтому использовали его официнальную форму: глазные капли. Прозерин применяли в виде раствора в ампулах по 1 мл.
Учитывая рекомендации [6], согласно которым терапевтическая доза раствора пилокарпина у овец составляет 5 мл, у коров - 30 мл; раствора прозерина -
Таблица 1. Зависимость видового спектра микроорганизмов ротовой полости коров и овец от сезона года
Сезон года Крупный рогатый скот Овцы
вид встречаемость, % вид встречаемость, %
Лето Citrobacter sp. 25 Enterococcus faecalis 25
Pantoea agglomerans 25 Escherichia coli 25
Candida crusei 25 Alcaligenes faecalis 25
Candida albicans 25 Staphylococcus sp. 25
Streptococcus viridans 50
Осень Streptococcus aga- 75
lactie
Зима Streptococcus aga- 50 Stomatococcus 50
lactie mucilaginosis
Streptococcus galloliticus 25
ssp. macedonicus
Kocuria kristinae 25
Staphylococcus schleiferi 25
ssp. schleiferi
Весна Proteus mirabilis 50 Staphylococcus lentus 75
Staphylococcus sciuri ssp. 25
sciuri
Staphylococcus lentus 50 Staphylococcus gallinarum 25
10 и 120 мл, соответственно, мы использовали полную и половинную дозы этих препаратов, которые вводили животным в область шеи подкожно. Объем и скорость (интенсивность) слюноотделения определяли только у коров и овец, при этом объем собранной слюны делили на длительность проведения процедуры (5 мин).
При исследовании сезонной вариабельности видового спектра микрофлоры ротовой полости изучали ее количественный и качественный состав, используя бактериоскопический и бактериологический методы. Материал для исследования брали с участка слизистых оболочек и поверхности языка площадью 1 см2 с помощью бактериологического набора (тампон на металлическом стержне в среде Amies с углем) и высевали на специальные питательные среды.
Для оценки общего микробного обсеменения применяли 5 %-ный кровяной агар; для подсчета стафилококков - желточно-солевой агар; для лактобактерий - растительно-молочную среду; для других бактерий - сахарный бульон и колумбийский агар; для грибов рода Candida - среду Сабуро с полимиксином. Бакпосевы инкубировали в термостате 24 ч, посевы для идентификации грибов рода Candida - около 5 сут. [7]. Выделенные штаммы микроорганизмов окрашивали по Граму и идентифицировали на основании морфологических, культуральных и биохимических признаков [8].
Система комплемента ротовой полости - мощный стимулятор лизиса бактерий у животных и человека, она принимает ключевое участие в защите организма от инфекций. Между тем, исследования ее немногочисленны, осуществляются, в основном, в медицине зарубежными учеными и лишь в пределах лабораторий. Комплемент слюны изучают, как правило, с помощью иммунохимических методов, а функциональные тесты вообще не разработаны. Для определения методологических особенностей исследования комплементарной активности слюны жвачных животных сбор ее проводили после фармакологической активации секреции 1 %-ным раствором пилокарпина гидрохлорида в дозах 15 и 2,5 мл/гол. коровам и овцам соответственно методом самоистечения из полости рта в стеклянную тару.
Для сравнительных исследований использовали сыворотку крови этих же животных, полученную из яремной вены стерильно специальными системами во флаконы вместимостью 250 мл. Слюну замораживали сразу после сбора, после размораживания одну ее
половину центрифугировали при 3 тыс. об./мин. в течение 10 мин., после чего часть надосадочной жидкости фильтровали, пропуская через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, исследования проводили как с фильтрованными, так и не фильтрованными образцами. Другую половину пробы исследовали сразу после оттаивания нецентри-фугированной. Комплементарную активность слюны животных определяли по двум методикам [9,10].
Кроме того, изменение активности комплемента изучали при гельминтозах и после дегельминтизации животных, а именно у коров - при стронгилоидозах, у овец - при сочетании стронгилоидоза с мониезиозом.
В качестве антгельментика использовали фебтал.
Пробы отбирали непосредственно со свежевыделенных фекалий сверху, следя за тем, чтобы проба не соприкасалась с землей. Дальнейшее исследование осуществляли флотационным методом с насыщенным раствором нитрата аммония по методике [11]. В опыт включали только особей с интенсивностью инвазии паразитами не менее 10 и 5 экз./поле зрения соответственно для мониезий и стронгилид.
Фебтал вводили однократно перорально индивидуально в смеси с комбикормом (из расчета 50...100 г на животное). На 12-й день после дегельминтизации яйца мониезий и стронгилид в пробе фекалий отсутствовали.
Результаты и обсуждение. При местном применении 2 %-ного раствора цитрата натрия у животных усиление секреции слюны было невыраженным. После введения 1 %-ного раствора пилокарпина гидрохлорида, как в полной, так и в половинной дозах, первые признаки непроизвольного слюноотделения (частое облизывание и глотательные движения) у овец и коров отмечали через 15 мин., а выраженную гиперсаливацию - через 20 мин. Интенсивность слюноотделения зависела от дозировки. Так, у овец после инъекции 2,5 мл скорость саливации равнялась 9 мл/мин. и длилась 1 ч, после введения 5 мл величины этих показателей составляли 14 мл/мин. и 3 ч. У коров половинная доза пилокарпина гидрохлорида увеличивала скорость слюноотделения до 66 мл/мин., а период гиперсаливации длился 1 ч, состояние характеризовалось признаками тахипноэ и незначительными истечениями из носа.
После введения 10 мл прозерина первые признаки непроизвольного слюноотделения у овец отмечали через 20 мин. В последующий период гиперсаливации (2 ч; 6,4 мл/мин.) наблюдали тахипноэ и незначительное истечение из носа. После введения 5 мл раствора прозерина у овец спустя 20 мин. усиления слюноотделения и изменений в общем состоянии не отмечали.
Учитывая наличие у пилокарпина гидрохлорида побочных эффектов и осложнений (тахипноэ, тахикардия, хрипы, сгущение крови), рациональнее, на наш взгляд, вводить половинную дозу этого препарата. Поскольку даже при такой обработке сохраняется достаточная для получения необходимого количества биологической жидкости интенсивность слюноотделения.
Таблица 2. Активность комплемента (% гемолиза) неразбавленной слюны
животных
Вид животного Образец слюны Количество слюны, мл
0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 1,0
Коровы Центрифугированная 0 0 1 2l4 3l2 6l6 14±3
Нецентрифугированная 0 1 2l3 3l8 6l5 11i5 23±3
Овцы Центрифугированная 0 0 1 119 2l8 5l7 12±2
Нецентрифугированная 0 0l8 1l2 3l5 5l8 10i2 20i5±2
При высеве на питательные среды многие из обнаруженных в ротовой полости микробов оказались тран-зиторными. У крупного рогатого скота - это Pantoea agglomerans, Citrobacter sp., Proteus mirabilis, Staphylococcus lentus, Streptococcusagalactie; у овец - E. coli, Alcaligenes faecalis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus sciuri, lentus и gallinarum. Они рассматриваются как условно-патогенные и считаются представителями нормальной микрофлоры кишечника, мочеполовой системы, дыхательных путей, кожи и ее производных.
Отдельные виды выявленных микроорганизмов -облигатные представители полости рта животных. У крупного рогатого скота - это Candida albicans и crusei; у овец - Streptococcus viridians и salivarius, Stomatococ-cus mucilaginosis.
В осенне-зимний период у животных отмечали меньшую выраженность признаков стоматита, что, возможно, объясняется потребелнием свежезаготов-ленных грубых кормов, а также низкой температурой окружающей среды, губительной для большинства микробов. Кроме того, весной ослабляется общая резистентность организма, что может привести к обострению различных заболеваний, в том числе и ротовой полости.
У овец и баранов выявлены различия в составе микроорганизмов ротовой полости. Так, у овец стрептококки в 50 % случаев представлены видом viridans и в 25 % - salivarius, тогда как у баранов в 25 % случаев встречается вид galloliticusssp. macedonicus. Стафилококки овец в 50 % случаев представлены видом lentus; у баранов же их видовой состав намного шире (schleiferi, sciuri, gallinarum) и встречаются они с частотой в 25 %. Помимо этого, только у овец в 50 % случаев выделен Stomatococcus mucilaginosis и в 25 % - Escherichia coli. Разные штаммы E. coli зачастую специфичны к определенным хозяевам, что делает возможным определение источника фекального заражения в образцах. В свою очередь, только у баранов (25 %) в мазках обнаруживали Alcaligenes faecalis, Enterococcus faecalis, Kocuria kristinae. При этом Enterococcus faecalis рассматривается как один из наиболее патогенных видов энтерококков и по некоторым данным [12], часто бывает причиной оппортунистических инфекций.
В наших опытах выявлены крайне низкие, вплоть до полного отсутствия, величины комплементарной активности слюны жвачных животных (табл. 2). В связи с этим точку 50 % гемолиза в опыте установить не удалось. Для повышения информативности данных (% гемолиза) мы видоизменили методику [10], добавив к стандартному ряду дополнительную пробу.
В эту пробу вносили по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. В результате в пробах с нецен-трифугированной неразбавленной слюной % гемолиза у коров возрос с 11,5 до 23±3;
у овец - с 10,2 до 20,5±2; с центрифугированной - соответственно с 6,6 до 14±3 и с 5,7 до 12±2. Исходя из этого, анализ и сравнение результатов проводили по данным дополнительной пробы каждого ряда исследований.
В пробах с центрифугированной нефильтрованной слюной у коров и овец % гемолиза был в 1,1 раза ниже, чем в вариантах с фильтрованной. Комплементарная активность не-центрифугированной неразбавленной слюны выше, чем центрифугированной нефильтрованной, у коров в 1,6, раза, у овец - в 1,7 раза; фильтрованной - в 1,4 и 1,5 раза соответственно. Комплементарная активность фильтрованной сыворотки крови коров и овец выше, чем у нецентрифугированной неразбавленной слюны, в 1,5 раза.
Низкую активность комплемента в слюне жвачных животных мы связываем с их типом питания, в котором преобладают растительные корма с низким, неполноценным по аминокислотному составу, содержанием белка; образованием большого количества слюны с пониженной концентрацией белка вследствие стимуляции пилокарпином парасимпатических окончаний [10]; крайне малым количеством в слюне иммуноглобулинов О, М и А.
Меньшая комплементарная активность нефильтрованной слюны, возможно, связана с наличием в ней бактерий, способных инактивировать комплемент путем адсорбции и выделения определенных веществ [10]. Более высокий процент гемолиза в пробах с не-центрифугированной слюной, возможно, обусловлен с присутствием значительного количества разнообразных антимикробных факторов, губительно действующих на бактерии и оседающих вместе с отдельными фракциями комплемента, и муцина, способного связывать отдельные антибактериальные факторы, при центрифугировании.
Анализ результатов исследований свидетельствует, что при гельминтозах активность комплемента слюны падает, а при дегельминтизации возрастает и приближается к нормативному значению (табл. 3).
Выводы. Из исследованных фармакологических препаратов для получения слюны у крупного рогатого скота и овец рациональнее использовать пилокарпина гидрохлорид. 1 %-ный раствор этого препарата с целью уменьшения побочных эффектов рекомендуется применять в половинной дозе. Появление, первых и выраженных после стимуляции пилокарпином, признаков слюноотделения наблюдалось у животных через одинаковые периоды времени (15 и 20 мин. соответственно) и не зависело от их видовой принадлежности. Отличия отмечались лишь в скорости слюноотделения.
Качественный и количественный состав транзи-торной микрофлоры овец и коров имеет сезонные
Таблица 3. Активность комплемента (% гемолиза) слюны у коров и овец в
норме, инвазии гельминтами и после дегельминтизации
Вид животного Состояние Среднее значение (M ±m) Коэффициент вариации Cv (%)
Коровы Норма 30,53±5,61 36,7
Гельминтоз 09,38±2,91 69,3
Дегельминтизация 28,63±4,59 35,9
Овцы Норма 34,75±3,43 17,1
Гельминтоз 16,82±7,96 66,9
Дегельминтизация 24,44±8,93 51,7
особенности, связанные, скорее всего, с рационом которую необходимо вносить по 1 мл гемолитической си-
питания, способом содержания и температурой окру- стемы и исследуемой жидкости. При этом слюна должны
жающей среды. быть неразбавленной и нецентрифугированной.
Определение комплементарной активности слюны Гельминтозы снижают комплементарную актив-жвачных животных рациональнее проводить по методике ность слюны животных, а дегельминтизация - увели-
[10], дополнив стандартный ряд еще одной пробой, в чивает ее, приближая к нормативному значению.
Литература.
1. Плескова С.Н. Морфо-физиологические аспекты гуморальных и клеточных механизмов неспецифической резистентности организма: Дисс...докт. биол. наук. - 2009.
2. Покровская Е.С., Малев А. А., Гильмутдинов Р.Я. Методологические аспекты получения слюны у сельскохозяйственных животных// Ученые зап. Казанской Гос. Академии Ветеринарной Медицины. - 2011. - т. 208. - С. 95-99.
3. Сунцов В.Г., Лебедько О.А., Таловская В. С., Антонова А.А. Особенностихемилюминесценции слюны и микроэлементного состава волос удетей с различной активностью кариеса зубов// Стоматология. - 2008. - № 1. - С. 4-7.
4. Сафаров, Р. Т. Клинико-патогенетические аспекты нарушений микробиоценоза полости рта у больных пародонтитом и пути их коррекции: Автореф. дисс. - Ташкент, 2006.
5. Фазылова Ю. В. Клинико-иммунологическая характеристика и терапевтическая коррекция хронических воспалительных заболеваний пародонта у больных вирусным гепатитом В: Дисс. канд. мед. наук. - Казань, 2005. - 188 с.
6. Мозгов, И.Е. Фармакология, 8-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1985. - 416 с.
7. Приказ Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».
8. Bergey D. Peter Ed. Bergey's manual of systematic bacteriology H. - Smeath., 1988. - V. 2.
9. Вагнер, Г. Ф. Колориметрическое определение комплементарной энергии крови //Лаб. дело. - 1963. - № 1. - С. 44-46.
10. Резникова Л. С. Комплемент и его значение в иммунологических реакциях. - М.: Медицина, 1967. - 272 с..
11. Котельников Г.А., Хренов В.М. Методические рекомендации подиагноситике наиболее распространенныхгельминтозов сельскохозяйственных животных. - М., 1980. - 34 с.
12. Бондаренко В. М., Суворов А. Н. Симбиотические энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистической инфекции. - М., 2007. - С. 30.
SALIVA - NEW OBJECT OF DIAGNOSTIC RESEARCHES AT ANIMALS R.Y. Gilmutdinov, A.V. Ivanov, M. Makundji, E.S. Pokrovskay
Summary. A number of methodological questions of reception (pharmacological stimulation by solutions sodium citrate, pilocarpini hydrochloridum, proserine) and researches (seasonal prevalence, a sexual accessory of an animal, procedures before the analysis) a saliva at cows and sheeps, its variation complement activity is considered at гельминтозах (strongyloidosis and monieziosis infections) and antiparasitic preparation by febtal. Influence of pharmacological preparations (2 % solution цитрата sodium is studied; 1 % solution pilocarpine hydrochloride and 0,05 % solution prozerine) on intensity and duration salivation at cows and sheep. It is revealed that which solution, for the purpose of reduction of by effects is optimum pilocarpine hydrochloride, 1 %, it is recommended to apply in half past to a dose. Occurrence both the first, and expressed after stimulation pilocarpine hydrochloride, salivation signs was observed at animals through the identical periods of time (15 and 20 min accordingly) and didn't depend on their specific accessory. Differences were marked only in speed of salivation. Sexual distinctions and seasonal dependence of qualitative and quantitative structure transit microflorae ruminant, connected, most likely, with a food allowance, way of the maintenance and ambient temperature are shown. At rather research of efficiency of techniques of Wagner G. (1963) and Reznikova L. (1967) by definition complement activity of a saliva, is revealed the big acceptability for these purposes of last and its updating, at the expense of addition standard of some one more test in which it is recommended to bring on 1 ml of haemolytic system and an investigated liquid is offered. Thus a saliva should be undiluted and uncentrifugated. Decrease complement activity of a saliva of animals is revealed at helmintosis and increase - after dehelmintisation which approaches its size to standard value (though at sheep it nevertheless remains below normal).
Key words: saliva, cattle, sheep, complement, parasitosis, nonspecific resistance, pilocarpine, rezerpine.
УДК 619: 616: 981. 42
КУПИРОВАНИЕ БРУЦЕЛЛЕЗА В ОСТРЫХ ОЧАГАХ ИНФЕКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ
Т.Г. ПОПОВА, кандидат ветеринарных наук, зав. лабораторией
ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Рос-сельхозакадемии
A.А. НОВИЦКИЙ, доктор ветеринарных наук, профессор
Омский ГАУ
B.С. БРОННИКОВ, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Рос-сельхозакадемии
E-mail: vniibtg@rambler.ru
Резюме. Производственные наблюдения по испытанию противобруцеллезной химической вакцины в остром очаге бруцеллеза крупного рогатого скота, ранее подвергавшегося иммунизации с нарушением регламента вакциной из штамма B. abortus 82, показали, что она эпизоотологически эффективна и обладает провоцирующими свойствами,
