CC BY
12УДК 616.28-008.14-08-092.4
СЛУХОВОССТАНАВЛИВАЮЩИЙ ЭФФЕКТ N-СУКЦИНИЛ-ХИТОЗАНА В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИ ОСТРОГО АКУСТИЧЕСКОГО СУБПОВРЕЖДАЮЩЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
А. А. Паневин
ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова», Санкт-Петербург, Россия (Ректор - акад. РАН, проф. С. Ф. Багненко)
ФГБУ «Северо-западный федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия (Директор - академик РАН Е. В. Шляхто)
RESTORATION OF HEARING EFFECT OF N-SUCCINYL-CHITOSAN IN CONDITIONS OF THE MODEL OF THE ACUTE ACOUSTIC SUBDAMAGING ACTION
A. A. Panevin
I. P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University, St Petersburg, Russia Federal North-West Medical Research Centre, St Petersburg, Russia
В эксперименте на 30 крысах (самцы, Wistar, 200-250 г) оценивали отопротективный потенциал однократного внутривенного введения 1,4%-ного раствора N-сукцинил-хитозана в сравнении с офи-цинальным препаратом «Реамберин» (1,5%-ный раствор меглюмина натрия сукцината). После острой акустической экспозиции субтравматического характера (подача в свободном звуковом поле непрерывного тонального сигнала 5 кГц, интенсивностью 110-112 дБ в течение 2 ч) через 1, 24 ч, 7 суток регистрировали отоакустическую эмиссию на частоте продукта искажения в диапазоне от 4 до 8 кГц. Показано, что однократное парентеральное введение раствора N-сукцинил-хитозана сразу после акустического воздействия не провоцирует общую летальность, не является кохлеотоксичным и оказывает слуховосстанавливающий эффект, сравнимый с эффектом «Реамберина».
Ключевые слова: сукцинил-хитозан, меглюмина натрия сукцинат, «Реамберин», модель острой акустической травмы, системы доставки лекарственных средств, слуховосстанавливающая терапия.
Библиография: 19 источников.
In experiment on 30 rats (males, Wistar, 200-250 g) the otoprotectivity potential of a single intravenous injection of Nsuccinylchitosan 1,4% solution in comparison with the drug „Reamberin" (1,5% solution of a meglumin sodium succinate) was evaluated. After acute acoustic exposition of subtraumatic character (giving in a free sound field of 5 kHz of continuous tone signal, the intensity of 110-112 dB within 2 hours) in an hour and 24 hours, 7 days later otoacoustic emission at the frequency of distortion product from 4 to 8 kHz was recorded. It was shown that a single parenteral injection of Nsuccinylchitosan solution just after acoustic impact does not provoke the general lethality. It is not cochleatoxic, it provides the restoration of hearing effect, comparable with the effect of „Reamberin".
Key words: succinyl-chitosan, meglumin sodium succinate, Reamberin, acute acoustic trauma model, drug delivery systems, restoration hearing therapy.
Bibliography: 19 sources.
Наличие самого селективного из гистогемати-ческих барьеров (ГГБ) - гематолабиринтного барьера (ГЛБ) - создает непреодолимые препятствия для попадания лекарственных веществ во внутреннее ухо при традиционных способах введения [11]. В настоящее время в отопротекции и слухоулучшающей терапии актуальной задачей является не только поиск активных цитопротекторов, но и эффективного способа лекарственного транспорта, который мог бы обеспечить физиологически адекватное форсирование ГЛБ [13, 19].
Природный биорезорбируемый, нетоксичный полимер хитозан [16] в последнее десятилетие яв-
ляется излюбленным объектом в исследованиях, касающихся совершенствования доставки и контролируемого высвобождения фармакологических веществ [10, 12, 15], в том числе и для достижения отодоступности [8]. Наиболее изучаемое сегодня его соединение - водорастворимый ^сукцинил-хитозан (^СХ) [17] - содержит ковалентно связанный остаток янтарной кислоты.
Сукцинат - естественный эндогенный метаболит клетки, субстрат одного из этапов цикла Кребса -представляется реальным претендентом на роль неспецифического цитопротектора, который мог бы иметь и широкое применение в сурдологической
Российская оториноларингология № 3 (76) 2015
практике [4]. Экзогенно-вводимый сукцинат в условиях аэробного метаболизма снижает концентрацию лактата, пирувата и цитрата, обеспечивая поддержание продукции необходимого объема АТФ [1, 18]. Антигипоксический и цитопротективный эффекты этого субстрата в условиях интенсивной метаболической активности (как функциональной, так и патологической) реализуются в известных фармакологических препаратах (реамберин, цитофлавин, ремаксол) [6]. Сукцинат, вводимый в форме Ы-СХ, способен дольше сохраняться в системном кровотоке, форсировать ГГБ, проявляет эффект потенциации своих фармакофизиологических эффектов [9, 14].
Цель исследования. Оценить способность Ы-СХ выступать в качестве лекарственного переносчика, обеспечивающего проникновение янтарной кислоты к структурам внутреннего уха.
Материалы и методы исследования. В работе использовали 30 крыс самцов Wistar, с массой тела 200-250 г, соматически здоровых, с нормальными отоскопической картиной и показателями тимпано-метрии.
В исследовании изучен образец Ы-сукцинил-хитозана натриевой соли, предоставленный сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН [3]. Ы-СХ получен реакцией крабового хитозана (молекулярная масса - 83000, степень деа-цетилирования - 0,93) с янтарным ангидридом в 1%-ной уксусной кислоте. Образец очищали диализом из 3%-го раствора ЫаНС03 против дистиллированной воды. По данным элементного анализа степень замещения по аминогруппам составила 0,85, содержание остатков янтарной кислоты - 2,70 ммоль/г.
В качестве препарата сравнения использовали официнальный препарат сукцината реамберин, представляющий собой 1,5%-ный раствор меглю-мина натрия сукцината (МНС). Раствор Ы-СХ для введения получали растворением 0,0138 г лио-фильно высушенного образца в 1 мл физиологического раствора, что соответствовало 1,4%-ному раствору. Концентрация раствора Ы-СХ подобрана таким образом, чтобы концентрация сукцинильных групп была эквивалентной концентрации сукцината в официнальном растворе МНС (44,7 ммоль/л). Стерилизацию раствора Ы-СХ перед парентеральным введением проводили ультрафиолетовым облучением в течение 1 ч.
В качестве экспериментальной модели патологии слухового анализатора использовали острое акустическое воздействие, создаваемое экспозицией тонального сигнала 5 кГц, интенсивностью 110-112 дБ непрерывно в течение 2 ч. Озвучивание животных производили в свободном звуковом поле в условиях акустической камеры собственной конструкции объемом 0,75 м3.
С помощью метода рандомизации (метода конвертов) выделены три группы животных (по 10 крыс в каждой):
1-я группа - контрольная - с введением физиологического раствора;
2-я группа - с введением 1,4%-ного раствора Ы-СХ в физиологическом растворе;
3-я группа - с введением реамберина.
Изучаемые растворы вводили внутривенно через
каудальную вену, медленной инфузией с применением шприцевого насоса (0,1 мл/мин), при общем объ-
50
40
30
20
10
0 50
40
30
20
10
0 50
40
30
20
10
0
-
1 1 1 1 1 1 1 11 -•г-'
- ''' —
4 кГц
5 кГц
6,4 кГц
До травмы После трав- 1 сутки 1 неделя мы (2 ч) + введение
Рис. Динамика изменения ПИ ОАЭ на изучаемых частотах в ходе эксперимента:
1-я группа (--•--) - контроль; 2-я группа (- -) - Ы-сукцинпл-хитозан; 3-я группа (—) - реамберин.
еме введения 1 мл, в «лечебном» режиме - через 20 мин после окончания акустической стимуляции.
Функциональное состояние слухового анализатора оценивали по амплитуде показателя продукта искажения отоакустической эмиссии (ПИ ОАЭ) в диапазоне 4-8 кГц на приборе Нейро-Аудио с программным обеспечением Neuro-Audio. NET. Амплитуду ПИ ОАЭ регистрировали за 1 сутки перед экспериментом, через 1, 24 ч и 7 суток после акустической экспозиции.
Все манипуляции с животными (исследование ПИ ОАЭ, внутривенные инъекции) выполняли в условиях анестезии раствором золетила (6 мг/кг), вводимого внутрибрюшинно.
Значимость различий измеряемых параметров между группами в каждой точке оценивали с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений (ANOVA). Для статистической обработки данных применяли программный пакет SAS 9.3. Различия считали достоверными прир < 0,05.
Результаты исследования. В двух экспериментальных группах в течение 7 дней наблюдения не отмечено летальных исходов вследствие введения изучаемых препаратов. Динамика амплитуды ПИ ОАЭ на трех изучаемых частотах за период наблюдения представлена на рисунке.
К окончанию акустической стимуляции наблюдалось угнетение амплитуды ПИ ОАЭ у животных на всем диапазоне изучаемых частот (4; 5; 6,4 кГц) (p < 0,0001, ANOVA). Наблюдавшееся восстановление ПИ ОАЭ до исходных значений к 7-м суткам указывает на функциональный характер изменений на изучаемом рецепторном участке спирального органа в результате проведения выбранной акустической стимуляции. При этом характер депрессии ПИ ОАЭ демонстрировал известный градиент повреждения кохлеарных структур с увеличением в направлении от верхушки к основному завитку [2].
Введение изучаемых соединений сукцината -N-СХ и МНС - демонстрировало схожие ототропное воздействие на функциональную активность спирального органа. Так, в обеих группах при первом исследовании после озвучивания на двух из трех изучаемых частот ПИ ОАЭ не отличался от исходных по-
казателей (p > 0,05), а на частоте 6,4 кГц депрессия ПИ была явной, но не достигала уровня угнетения в контрольной группе (pN - CX = 0,01 и рМНС = 0,002).
Полное восстановление функциональной активности слухового рецептора на изучаемом участке в экспериментальных группах отмечено уже к концу первых суток, в то время как в контрольной группе это же происходило только к следующему наблюдению.
Таким образом, в нашем эксперименте на модели патологии внутреннего уха показано сохранение антигипоксической активности сукцината в условиях ковалентной связи с природным полимером хитозаном. По выраженности слуховосстанавлива-ющего эффекта изучаемый N-СХ не уступает МНС -основному действующему веществу препарата ре-амберин.
В то же время основным недостатком фарма-кокинетики существующих сукцинат-содержащих фармакологических препаратов является ультракороткий период полувыведения сукцината по причине высокого неспецифического метаболизма в невовлеченных в патологический процесс тканях и органах [5]. Исходя из этого нам представляется, что совершенствование сукцинат-содержащих лекарственных форм возможно в двух направлениях: увеличения длительности циркуляции в кровотоке (увеличение Т1/2) и форсирования капиллярно-тканевой проницаемости, если речь идет о патологии органов, располагающих ГГБ (внутреннее ухо, головной мозг).
В ранее проведенном исследовании мы обнаружили, что наночастицы хитозана (со средним диаметром 340 нм) в условиях простого смешивания с лекарственным веществом (амикацином) способны увеличивать отодепрессивный эффект препарата. Это позволило предположить, что наночастицы хи-тозана, вводимые в форме суспензии, способны форсировать ГЛБ и переносить сорбированные на своей поверхности лекарственные вещества [7]. Таким образом, для повышения органодоступности сукци-ната в дальнейшей работе мы предполагаем исследовать форму N-СХ, представленную в виде дисперсных частиц наноразмерной величины.
Выводы
В настоящей работе показано, что N-сукцинил-хитозан сохраняет антигипоксический потенциал сукцината, проявляющийся в слуховосстанавливающем эффекте в условиях модели острого акустического субтравматического воздействия на слуховой анализатор.
Отмеченный ототропный эффект сравним с подобным эффектом меглюмина натрия сукцината. Автор благодарит докт. мед. наук С. Г. Журавского и канд. хим. наук Ю. А. Скорика за консультации и помощь в организации исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьев В. В. Клиническая фармакология реамберина (очерк): пособие для врачей. СПб., 2005. 44 с.
2. Гайтон А., Холл Дж. Медицинская физиология. М.: Логосфера, 2008. 1273 с.
3. Голышев А. А., Скорик Ю. А. Синтез глутарил-хитозана в водной суспензии и растворе // Мат. XII Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Пермь, 2014. С. 112-115.
4. Журавский С. Г. Ухо и метаболизм (патобиохимические аспекты). Слухоулучшающий эффект цитофлавина в сурдологической практике: пособие для врачей. СПб., 2009. 72 с.
5. Коваленко А. Л., Петров А. Ю., Романцов М. Г. Фармакологическая активность янтарной кислоты и перспективы ее применения в клинике: сб. ст. / Под ред. М. Г. Романцова. СПб., 2002. С. 6-19.
Российская оториноларингология № 3 (76) 2015
6. Румянцева С. А., Афанасьев В. В., Силина Е. В. Патофизиология комплексной цитопротекции при ишемии мозга // Невропатол. и психиатр. 2009. - № 3. С. 64-68.
7. Хитозан потенцирует ототоксичность амикацина в условиях физиологически-адекватной нагрузки слухового анализатора / А. А. Паневин [и др.] // Рос. оторинолар. 2013. № 6. С. 99-102.
8. A Novel Chitosan-Hydrogel-Based Nanoparticle Delivery System for Local Inner Ear Application / S. A. Lajud [et al.] // Otol. Neurotol. 2014. Vol. 34, N 5. P. 98-106.
9. A novel permeation enhancer: N-succinyl chitosan on the intranasal absorption of isosorbide dinitrate in rats / L. Na [et al.] // Eur. Jurn. Pharm. Sci. - 2013. Vol. 48, N 1-2. P. 301-306.
10. Brain-targeting study of stearic acid-grafted chitosan micelle drug-delivery system / Y. T. Xie [et al.] // Int. Jurn. Nanomedicine. - 2012. - Vol. 7. - P. 3235-3244.
11. Drug Delivery for Treatment of Inner Ear Disease: Current State of Knowledge / A. A. McCall [et al.] // Ear. Hear. -2010. - Vol. 31, N 2. - P. 156-165.
12. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss / T. Rivera [et al.] // Curr. Drug. Deliv. - 2012. - Vol. 9, N 3. - P. 231-42.
13. Inner Ear Drug Delivery for Auditory Applications / E. E. Swan [et al.] // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2008. - Vol. 60, N 15. - P. 1583-1599.
14. N-succinyl-chitosan as a drug carrier: water-insoluble and water-solubleconjugates / Y. Kato [et al.] // Biomaterials. -2004. - Vol. 25, N 5. - P. 907-915.
15. Nanomedicine strategies for drug delivery to the ear / C. O. Pritz [et al.] // Nanomedicine (Lond). - 2013. - Vol. 8, N 7. - P. 1155-1172.
16. Nucleic acid delivery with chitosan and its derivatives / W. F. Lai [et al.] // Jurn. Control. Release. - 2009. - Vol. 134, N 3. - P. 158-168.
17. Preparation of N-succinyl-chitosan and its physical-chemical properties as a novel excipient / C. Yan [et al.] // Yakugaku Zasshi. - 2006. - Vol. 126, N 9. - P. 789-793.
18. Unsuspected task for an old team: succinate, fumarate and other Krebs cycleacids in metabolic remodeling / P. Bénit [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 2014. - Vol. 1837, N 8. - P. 1330-1337.
19. Use of the biodegradable polymer chitosan as a vehicle for applying drugs to the inner ear / A. Saber [et al.] // Eur. Jurn. Pharm. Sci. - 2010. - Vol. 39, N 1-3. - P. 110-115.
Паневин Алексей Александрович - аспирант лаборатории слуха и речи Научно-исследовательского центра Первого Санкт-Петербургского ГМУ им. акад. И. П. Павлова. Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8; мл. н. с. Института экспериментальной медицины ФГБУ «СЗФМИЦ» Минздрава России. 197341, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, д. 2, тел. 8-921-380-14-84; e-mail: apanevin86@mail.ru.
REFERENOES
1. Afanas'ev V. V. Klinicheskaja farmakologija reamberina (ocherk): рсзсМа dlja vrachej. SPb., 2005, 44 p.
2. Gajton A., Holl Dzh. Medicinskaja fiziologija. M.: Logosfera, 2008, 1273 p.
3. Golyshev A. A., Skorik Ju. A. Sintez glutaril-hitozana v vodnoj suspenzii i rastvore. Covremennye perspektivy v issledovanii hitina i hitozana: Materialy XII Mezhdunarodnoj konferencii. Perm', 2014, pp. 112-115.
4. Zhuravskij S. G. Uho i metabolizm (patobiohimicheskie aspekty). Sluhouluchshajushhij jeffekt citoflavina v surdologicheskoj praktike: рosobie dlja vrachej. SPb., 2009, 72 p.
5. Kovalenko A. L., Petrov A. Ju., Romancov M. G. Farmakologicheskaja aktivnost' jantarnoj kisloty i perspektivy ee primenenija v klinike: sb. st. pod red. M. G. Romancova. SPb., 2002, pp. 6-19.
6. Rumjanceva S. A., Afanas'ev V. V., Silina E. V. Patofiziologija kompleksnoj citoprotekcii pri ishemii mozga. Nevropatologia ipsihiatria, 2009, N 3, pp. 64-68.
7. Hitozan potenciruet ototoksichnost' amikacina v uslovijah fiziologicheski-adekvatnoj nagruzki sluhovogo analizatora. A. A. Panevin [et al.]. Rossiiskaya otorinolaringologiya, 2013, N 6, pp. 99-102.
8. A Novel Chitosan-Hydrogel-Based Nanoparticle Delivery System for Local Inner Ear Application. S. A. Lajud [et al.]. Otol. Neurotol., 2014, vol. 34, N 5, pp. 98-106.
9. A novel permeation enhancer: N-succinyl chitosan on the intranasal absorption of isosorbide dinitrate in rats. L. Na [et al.]. Eur. J. Pharm. Sci, 2013, vol. 48, N 1-2, pp. 301-306.
10. Brain-targeting study of stearic acid-grafted chitosan micelle drug-delivery system. Y. T. Xie [et al.]. Int. J. Nanomedicine, 2012, vol. 7, pp. 3235-3244.
11. Drug Delivery for Treatment of Inner Ear Disease: Current State of Knowledge. A. A. McCall [et al.]. Ear. Hear., 2010, vol. 31, N 2, pp. 156-165.
12. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. T. Rivera [et al.]. Curr. Drug. Deliv., 2012, vol. 9, N 3, pp. 231-42.
13. Inner Ear Drug Delivery for Auditory Applications. E. E. Swan [et al.]. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2008, vol. 60, N 15, pp. 1583-1599.
14. N-succinyl-chitosan as a drug carrier: water-insoluble and water-solubleconjugates. Y. Kato [et al.]. Biomaterials., 2004, vol. 25, N 5, pp. 907-915.
15. Nanomedicine strategies for drug delivery to the ear. C. O. Pritz [et al.]. Nanomedicine (Lond)., 2013, vol. 8, N 7, pp. 1155-1172.
16. Nucleic acid delivery with chitosan and its derivatives. W. F. Lai [et al.]. J. Control. Release, 2009, vol. 134, N 3, pp. 158-168.
17. Preparation of N-succinyl-chitosan and its physical-chemical properties as a novel excipient. C. Yan [et al.]. Yakugaku Zasshi, 2006, vol. 126, N 9, pp. 789-793.
18. Unsuspected task for an old team: succinate, fumarate and other Krebs cycleacids in metabolic remodeling. P. Bénit [et al.]. Biochim. Biophys. Acta, 2014, vol. 1837, N 8, pp. 1330-1337.
19. Use of the biodegradable polymer chitosan as a vehicle for applying drugs to the inner ear. A. Saber [et al.]. Eur. J. Pharm. Sci., 2010, vol. 39, N 1-3, pp. 110-115.
Panevin Alexey A. - a graduate student of laboratory of hearing and speech of the Research center of Pavlov First St. Petersburg State Medical University. Russia, 197022, St. Petersburg, Lev Tolstoy St., 6-8, junior research assistant of the Institute of experimental medicine Federal North-West Medical Research Centre, 197341, Akkuratova Str., 2,St Petersburg, Russia, ph. 8-921-380-14-84; e-mail: apanevin86@mail.ru
