CC BY
62
см со
es
Случай выявления антигена weak D type 4.2 (категория DAR)
системы Резус
Л.Л. Головкина, А.Г. Стремоухова, Т.Д. Пушкина, Е.Н. Паровичникова
ФГБУ«Гематологический научный центр» Минздрава России; Россия, 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4
Контакты: Лариса Леонидовна Головкина [email protected]
es u
Серологические методы идентификации резус-принадлежности человека не могут выявить варианты антигена D. В статье описаны серологические характеристики антигена системы Резус weak D type 4.2 (категория DAR).
Ключевые слова: система Резус, варианты антигена D, weak D, D-парциальный, генотип, фенотип, типы weak D, weak D type 4.2, кластеры антигена weakD, категория DAR, генотипирование
см со
DOI: 10.17650/1818-8346-2015-10-3-70-72
Case of rhesus antigen weak D type 4.2. (DAR category) detection L.L. Golovkina, A.G. Stremouchova, T.D. Pushkina, E.N. Parovichnikova
Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia; 4a Novyy Zykovskiy Pr-d, Moscow, 125167, Russia
Serological methods of Rhesus antigens identification in humans cannot identify D-antigen variants. In this article the serological characteristics of Rhesus antigen D weak type 4.2. (Category DAR) are described.
Key words: rhesus, D-antigen variants, weak D, D partial, genotype, phenotype, weak D types, weak D type 4.2, weak D-antigen clusters, DAR category, genotyping
Введение
Антиген D (RhD) — один из основных антигенов эритроцитов человека, входит в систему Резус, насчитывающую в настоящее время 59 антигенов. Антигены системы Резус кодируются 2 генами: RHD и RHCE, расположенными на коротком плече хромосомы 1 (1p34.3-1p36.1), они определяют биосинтез полипептида, состоящего из 417 аминокислот. Гидрофобные белки пронизывают мембрану эритроцита в 12 местах, образуя 6 петель, состоящих из внеклеточной, внутри-мембранной и внутриклеточной частей и имеющих внутримембранные N- и C-концевые последовательности.
Классический антиген D состоит из 36 составных частей (эпитопов) [1]. Среди множества его вариантов принято выделять 3 основных: слабый антиген D — D weak (его количество на эритроците снижено), парциальный, у которого отсутствует какой-либо из эпи-топов (лица с таким антигеном D могут вырабатывать антитела к отсутствующим у них эпитопам), и DEL [2]. Эритроциты с антигеном DEL обычно идентифицируют как RhD-отрицательные при использовании серологических методов.
Первым сообщил о существовании варианта антигена D, обозначенного как Du, F. Stratton в 1946 г. [3]. Термином Du обозначали антиген D на тех эритроцитах, которые не агглютинировались полными IgM анти^-антителами, но показывали положительный результат с IgG-антителами в непрямом
антиглобулиновом тесте. Чистых анти^ц-антител не выделено: все резус-отрицательные больные вырабатывали антитела со специфичностью анти-D после переливания Du-положительных эритроцитов, что указывало исключительно на количественные различия между антигенами D и Du. Поэтому в 1992 г. антиген Du переименовали в антиген weak D [4]. В настоящее время описано более 80 вариантов этого антигена, появление которых обусловлено мутациями в гене RHD, приводящими к аминокислотным заменам, в основном в трансмембранной и внутриклеточной частях белковой молекулы антигена RhD [5]. Количество антигена D на 1 эритроците у лиц с weak D варьирует от 60 до 3800, в то время как у пациентов с «нормальным» D — 13 000—24 000 [6]. Позднее A.S. Wiener и L.J. Unger [7], P. Tippett и R. Sanger [8] выявили больных с нормальным или ослабленным антигенами D, способными вырабатывать анти^-антитела. Исследователи пришли к заключению о существовании парциального варианта антигена D, имеющего качественные отличия от «нормального» D.
Филогенез гена RHD человека доказывает существование 4 главных кластеров, которые выделяют по аллелям, отличающимся от обычных аллелей гена RHD и включающим варианты антигена D с дополнительными аминокислотными заменами: DIV, DAU, слабый weak D type 4 и Евразийский [9—11]. Кластеры weak D type 4, DIV a и DAU ассоциированы с гаплоти-
Фундаментальные исследования в практической медицине на современном этапе
71
пом cDe и встречаются преимущественно у представителей негроидной расы, в то время как гаплотипы Cde и cDE ассоциированы с Евразийским кластером [12] и представлены у людей европеоидной расы.
DAR1 (DAR, weak D type 4.2) принадлежит к кластеру антигена weak D type 4. Варианты антигена RhD DAR и weak D type 4.2 были выявлены у людей с анти-D-антителами. Эти 2 варианта антигена имеют одни и те же 3 замены нуклеотидов в гене RHD и 3 аминокислотные замены (602C>G (T201R), 667T>G (F223V), 1025T>C (I342T)), но отличаются только по одной единичной синонимичной мутации гена (957G>A (V319V)), не влияющей на фенотип RhD [6, 13]. Следовательно, антигены weak D type 4 и DAR являются вариантами антигена D с идентичным фенотипом и почти идентичным генотипом, хотя 1-й относят к слабому варианту антигена D, а 2-й — к парциальному антигену D.
В повседневной практике иммуногематологов антиген weak D можно определить серологическими методами по отсутствию или формированию мелкой агглютинации исследуемых эритроцитов с анти^-ре-агентами на плоскости и по положительному результату непрямой пробы Кумбса (непрямой антиглобули-новый тест), в которой агглютинация исследуемых эритроцитов формируется с временным отставанием по сравнению с положительным контролем. В реакции солевой агглютинации исследуемые эритроциты реагируют с анти^-реагентом в более низком титре по сравнению с положительным контролем (стандартные D-положительные эритроциты). Но серологические методы не позволяют определить тип антигена weak D. Это можно сделать только с помощью молекулярных исследований. В научно-клинической лаборатории трансфузиологической иммуногематологии Гематологического научного центра (ГНЦ) начата такая работа в рамках научно-исследовательской тематики. Ранее мы уже описали случаи выявления антигена weak D type 15 [14] и редкого аллеля Ael системы АВО [15]. В данной статье мы приводим серологические характеристики антигена weak D type 4.2, входящего в категорию антигенов DAR.
В нашу лабораторию обратилась женщина К. для уточнения резус-принадлежности. По данным разных лабораторий г. Москвы у нее выявляли то положительный, то отрицательный резус-фактор.
Материалы и методы
Мы исследовали стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты, эритроциты и ДНК из лейкоцитов периферической крови.
Групповую принадлежность выявляли по системам АВО и Резус в реакции агглютинации на плоскости цоликлонами соответствующей специфичности IgM-класса. Антиген D определяли в реакции солевой агглютинации в планшетах с полными моноклональ-ными анти^-антителами (ЭритротестТМ-Цоликлон
анти-D Супер) 2 серий, непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с неполными монокло-нальными антителами анти-D 2 серий (Эритротест™-Цоликлон анти-D) проводили в пробирках и в геле (фирма «Bio-Rad», США). Антиглобулиновую сыворотку 3 серий применяли для выявления фиксирования неполных анти-D-антител после проведенной инкубации на исследуемых и контрольных эритроцитах. Все реактивы произведены фирмой ООО «Гематолог» (Москва).
Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы «BAG» (Германия) по методике производителя. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала концентрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяемая по отношению показателей при 260 и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6-1,8, концентрация конечной ДНК — 50-100 нг/мкл.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяли с праймерами для выявления вариантов антигена D: weak D (Weak D-Type) и парциального D (Partial D-Type), также RH-Type производства фирмы «BAG» (Германия) по программе производителя. Детекцию полученных результатов осуществляли посредством электрофореза продуктов амплификации в 2 % агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1 мкг/мл) в Трис-боратном электродном (TBE) буфере при напряженности электрического поля 1015 В/см. В лунки геля вносили по 10 мкл амплифи-кационной смеси. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете (X = 310 нм) при помощи трансиллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос амплификации внутреннего положительного контроля свидетельствовало о корректности проведенной ПЦР.
Результаты
Определение групповой принадлежности по системам АВО и Резус на плоскости показало наличие группы крови В (III) с фенотипом системы Резус ccDweakee. С Цоликлоном анти-D супер на плоскости мелкие агглютинаты исследуемых эритроцитов появлялись после 2-й минуты. В реакции солевой агглютинации в круглодонных планшетах с тем же реактивом эритроциты склеивались в разведении антител 1:32. Контрольные резус-положительные эритроциты реагировали в разведении антител 1:2000. В гелевых колонках с полными анти-D-антителами результат оценивали на 2+. В непрямом антиглобулиновом тесте в пробирках при использовании цоликлона с анти-D-антителами IgG-класса исследуемых эритроцитов агглютинация появлялась на 2-й минуте, в то время как агглютинация с резус-положительными стандартными эритроцитами — на 10-й секунде. В непрямом антиглобулиновом тесте, выполненном в гелевых картах с тем же Цоликлоном анти-D, идентифицирован положительный результат на 4+ (табл.).
CV со
es
es u
см со
Результаты серологических реакций с полными и неполными анти-D-антителами (время появления агглютинации, разведение реагентов, сила реакции)
Эритроциты Методы исследования
Полные анти^-антитела Неполные анти^-антитела
Плоскость Солевая агглютинация Гелевый Непрямая проба Кумбса в пробирках Непрямая проба Кумбса в колонках с гелем
Пациентка К. 2-я минута 1:32 2+ 2-я минута 4+
D+ 10-я секунда 1:2000 4+ 10-я секунда 4+
D- Отрицательный Отрицательный Отрицательный Отрицательный Отрицательный
СМ со
es
es u
см со
Генотипирование с праймерами набора Weak D-Type позволило выявить ген weаk Dtype 4.2 (DAR), Partial D-Type — DAR (wвак D type 4.2), D-Type — cc ee. Таким образом, генотип системы Резус К. идентифицирован как сс weаk D type 4.2 (DAR) ße.
Заключение
Современные молекулярные методы исследования позволяют идентифицировать редкие аллели ге-
нов RHD, продукты которых определяют серологическими методами как слабый вариант антигена D. Описанный антиген можно отнести и к слабому, и к парциальному вариантам антигена D, поэтому потенциальным реципиентам с данным вариантом антигена показано переливание эритроцитов от резус-отрицательных доноров. Доноров с подобным антигеном следует относить к резус-положительным лицам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Scott M. Section 1A. Rh serology. Coordinators report. Transfus Clin Biol 2002;9:23-9.
2. Daniels G. Variants of RhD-current testing and clinical consequences. Br J Haematol 2013;161:461-70.
3. Stratton F. A new Rh allomorph. Nature 1946;158:25-6.
4. Agre P.C., Davies D.M., Issitt P.D. et al. A proposal to standardize terminology for weak D antigen. Transfusion 1992;32:86-7.
5. Wagner F.F., Gassner C., Muller T.H. et al. Molecular basis of weak D phenotypes. Blood 1999;93:385-93.
6. Wagner F.F., Frohmajer A., Ladewig B. et al. Weak D alleles express distinct phenotypes. Blood 2000;95:2699-708.
7. Wiener A.S., Unger L.J. Further observations on the blood factors RhA, RhB, RhC and RhD. Transfusion 1962;2:230-3.
8. Tippett P., Sanger R. Further observations of subdivisions of the Rh antigen D. Arztl Lab 1977;23:476-80.
9. Flegel W.A., Wagner F.F. Molecular genetics of RH. Vox Sang 2000;78:109-15.
10. Flegel W.A., von Zabern I., Doescher A. et al. D variants at the RhD vestibule in the weak D type 4 and Eurasian D clusters. Transfusion 2009;49:1059-69.
11. Wagner F.F., Ladewig B., Angert K.S. et al. The DAU allele cluster of the RHD gene. Blood 2002;100:306-11.
12. Wagner T., Kormoczi G.F., Buchta C. et al. Anti-D immunization by DEL red blood cells. Transfusion 2005;45:520-6.
13. Hemker M.B., Ligthart P.C., Berger L. et al. DAR, a new RhD variant involving exons 4, 5, and 7, often in linkage with ceAR, a new Rhce variant frequently found in African blacks. Blood 1999;94:4337-42.
14. Головкина Л.Л., Стремоухова А.Г., Пушкина Т.Д. и др. Случай выявления антигена системы Резус Dweak 15-го типа. Гематология и трансфузиология 2014;59(4):23-4. [Golovkina L.L., Stremouchova A.G., Pushkina T.D. et al. The case of Dweak 15-type Rhesus antigen detection. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2014;59(4):23-24 (In Russ.)].
15. Головкина Л.Л., Стремоухова А.Г., Пушкина Т.Д. Выявление редкого аллеля антигена А системы АВО Ael
у женщины из Дагестана. Интер-медикал 2015;1(7):25-8. [Golovkina L.L., Stremouchova A.G., Pushkina T.D. Identification of the rare Ael antigen A allele in Dagestan woman. Inter-medikal = Inter-Medical 2015;1(7):25-8 (In Russ.)].
