CC BY
6УДК 633.63:575.174.015. 3 doi.org/10.24412/2413-5518-2024-1-16-19
Скрининг селекционно ценных генотипов сахарной свёклы на наличие митохондриальных локусов, сцепленно наследуемых с генами ЦМС
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук Т.Н. БАГМУТОВА, мл. научн. сотрудник Е.Н. ВАСИЛЬЧЕНКО, ст. научн. сотрудник
М.Н. САЩЕНКО, канд. биолог. наук, вед. науч. сотрудник, зав. лаб. селекции на ЦМС-основе
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
(e-mail: [email protected])
Введение
Современная селекция перекрёстноопыляемых сельскохозяйственных культур чаще всего ведётся по пути создания гибридов на ЦМС-основе* [2, 6, 4]. Непременным условием успешной работы является полнота переопыления данных культур, что решается путём использования материнского компонента с цитоплазматической мужской стерильностью, а также высокой комбинационной способностью скрещиваемых компонентов. Создание гибридов на ЦМС-основе позволяет достигать полного переопыления и использования эффекта гетерозиса по комплексу хозяйственно полезных признаков. На современном этапе развития селекции сахарной свёклы на ЦМС-основе необходимо применение инновационных методов биотехнологии и молекулярной генетики. Ценный для селекции признак ЦМС позволяет экономить время и средства, избегая кастрации гер-мафродитных цветков при гибридизации. Поэтому изучению генетического контроля данного признака уделяется большое внимание.
Установлено, что гены, ответственные за стерильность андроцея растений сахарной свёклы, находятся в митохондриальном геноме [10]. Изучение генетического полиморфизма митохондриального генома Beta vulgaris проводили с использованием высоковариабельных тандемных повторов — минисателлитов. S. Nishizawa с соавторами в результате исследований обнаружили и описали четыре локуса тандемных
* ЦМС - цитоплазматическая мужская стерильность.
повторов (TRI, TR2, TR3 и TR4) в митохондриальном геноме сахарной свёклы [9, 7]. Семейство минисателлитов TR состоит из тандемных повторов длиной 30—32 п. н., количество которых варьировало от 2 до 13 среди исследованных генотипов свёклы [11]. Было показано, что маркеры TR1 и TR3 сцеплены с генами, контролирующими ЦМС [9].
Влияние митохондриального и хлоропластного генома на тип цитоплазмы у сахарной свёклы было изучено зарубежными и российскими исследователями [1, 8, 3]. Исследование полиморфизма митохондриального генома сахарной свёклы является актуальным направлением, так как помогает ранжировать растения по типу цитоплазмы в лабораторных условиях за достаточно короткий промежуток времени.
Цель исследований — проведение молекулярно-генетического тестирования гаплоидных растений-регенерантов сахарной свёклы и исходного материала отечественной селекции на наличие локусов, сцепленных с генами, отвечающими за цитоплазма-тическую мужскую стерильность у растений данной культуры.
Объект и методика проведения исследований
Материалом для исследования служили гаплоидные растения-регенеранты сахарной свёклы, выращенные в культуре in vitro, и селекционные образцы, выращенные в полевых условиях.
Экстракция геномной ДНК из растительной ткани осуществлялась наборами «ДНК-Экстран-3» по протоколу производителя (ООО «Синтол», Россия).
Качество полученных препаратов ДНК оценивали путём электрофореза в 1%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора для анализа ДНК HS Qubit (Thermo Fisher Scientific, США) на флуори-метре Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Далее 5 нг ДНК элюировали 10 мМ трис-НС1-буфером, рН 8,0, содержащим 0,1 мМ ЭДТА, и использовали для проведения ПЦР-анализа. Полимеразно-цепную реакцию проводили на амплификаторе SimpliAmp (By life technologies, Сингапур). Параметры проведения ПЦР-реакции (температуру отжига праймеров) подбирали, исходя из характеристик используемых праймеров. Протокол ПЦР: 1) предварительная денатурация 94 °C в течение 5 мин; 2) далее 30—33 цикла: денатурация 94 °C — 30 сек; отжиг — 40 сек; элонгация при 72 °C — 60 сек; 3) заключительная элонгация при 72 °C — 3 мин. Состав ПЦР-смеси: 1 *ПЦР-буфер, 2,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ смеси dm^ 1 ед. Taq ДнК-полимеразы, ДНК 500 нг, праймеры 0,5 мкМ. В работе были использованы два праймера к минисателлит-ным локусам митохондриального генома сахарной свёклы.
Характеристика использованных праймеров приведена в таблице.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М
fni k"31 ^Ч1 EPi iFTp -
Рис. 1. Идентификация гаплоидныхрегенерантов сахарной свёклы по типу цитоплазмы с использованием минисателлитных маркеров TR 1. Дорожки: 1, 3, 7 - закрепители стерильности О-типа; 2, 5, 6, 8-14 - МС-формы; 15 - МС-2113 (линия 1); 16 - МС-2113 (линия 2); 17-18 - межвидовые гибриды (B. vulgaris L. х B. corolliflora Zoss.). М — маркер молекулярных масс ДНКGeneRuler™, 100-3000 п. н. (ThermoScientific, США)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 1415 16 1718 М
Характеристика минисателлитных маркеров
Прай-мер Последовательность Tm, °С Ссылка
TR1 F AGAACTTCGATAGGCGAGAGG R GCAA1T1TCAGGGCATGAACC 59 Nishizawa et. al., 2000
TR3 F AGATCCAAACAGAGGGACTG R CGGATCACCCTATTCATTTG 56 Nishizawa et. al., 2000
Результаты исследований и их обсуждение
Как известно, одним из важнейших селекционно ценных признаков у сахарной свёклы при создании гибридов, обладающих гетерозисным эффектом, является цитоплазматическая мужская стерильность. В связи с этим большое значение имеет идентификация типа цитоплазмы на ранних этапах создания гаплоидных форм в культуре in vitro для отбора стерильных генотипов и опылителей — закрепителей стерильности Оуэн-типа (О-типа).
С использованием минисателлитных маркеров TR1 семейства TR изучено разнообразие митохон-дриального генома сахарной свёклы у 18 гаплоидных генотипов растений-регенерантов (рис. 1). Для генотипов МС-формы характерны ампликоны длиной 400 п. н., для форм закрепителей стерильности — ампликоны размером 700 п. н. Образец под № 4 нельзя
Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР с использованием праймера TR3.
Дорожки: 1, 3, 7 - закрепители стерильности О-типа; 2, 5, 6, 8-14 - МС-формы; 15 - МС-2113 (линия 1); 16 - МС-2113 (линия 2); 17-18 - межвидовые гибриды (B. vulgaris L. х B. corolliflora Zoss.). М — маркер молекулярных масс ДНКGeneRuler™, 100-3000 п. н. (ThermoScientific, США)
отнести к определённому генотипу по типу цитоплазмы.
Также данные гаплоидные регенераты были изучены по типу цитоплазмы и с использованием минисателлитных маркеров TR3 семейства TR (рис. 2). Для генотипов МС-формы характерны ампликоны длиной 400 п. н., для форм закрепителей стерильности — ампликоны размером 500 п. н.
По результатам молекулярно-генетических анализов установлено, что образцы под номерами 1, 3, 7 являются закрепителями стерильности О-типа; образцы под номерами 2, 5, 6, 8—18 характеризуются как МС-формы. У генотипа № 4 не выявлено чёткой градации, так как на электрофореграммах проявились
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М
Рис. 3. Идентификация генотипов сахарной свёклы по типу цитоплазмы с использованием минисателлитных маркеров т 1 (а) и т з (б).
Дорожки: 1—13 — селекционные материалы сахарной свёклы. М — маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™, 100-3000 п. н. (ThemoSaentific, США)
ДНК-ампликоны, свойственные и МС-растениям, и О-типам.
Кроме того, были проанализированы по типу цитоплазмы селекционные образцы лаборатории селекции сахарной свёклы на стерильной основе, выращенные в полевых условиях (рис. 3). По результатам проведённой с праймерами TR1 и TR3 амплификации выяснилось, что генотипы 22-01, 22-03, 22-04, 22-07, 22-09, 22-11 и 22-13 являются МС-формами; линии 22-02, 22-05, 22-08, 22-10 — закрепителями стерильности О-типа; образцы 22-06 и 22-12 содержат в своём геноме ампликоны, характерные и для МС-форм, и для О-типов.
Таким образом, данные исследования имеют большое значение в практической селекции, поскольку позволяют на ранних этапах формирования гаплоидных регенерантов идентифицировать их по типу цитоплазмы.
Заключение
Результаты исследований позволили сделать следующие выводы:
— митохондриальные минисателлитные маркеры (TR1 и TR3) позволяют точно ранжировать растения сахарной свёклы на МС- и О-тип-формы;
— выделено 3 закрепителя стерильности О-типа из растений-регенерантов сахарной свёклы и 12 растений МС-форм; 4 О-типа и 7 растений МС-форм рекомендованы селекционерам как новый исходный материал для дальнейшего вовлечения в селекционный процесс.
Список литературы
1. Анализ гетероплазматического состояния мито-хондриальной ДНК фертильных и мужскостерильных растений сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) / А.Г. Бра-
гин, М.К. Иванов, Л.А. Федосеева, Г.М. Дымшиц // Вавиловский журнал генетики и селекции. — 2011. — № 15 (3). - C. 585-590.
2. Стабилизация признака односемянности при создании компонентов гибридов сахарной свёклы / В.П. Ошевнев, Н.П. Грибанова, Е.Н. Васильченко, Р.В. Бердников // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2018. — № 20 (2). — C. 186—191.
3. A fertility-restoring genotype of beet (Beta vulgaris L.) is composed of a weak restorer-of-fertility gene and a modifier gene tightly linked to the Rf1 locus / T. Arakawa, D. Uchiyama, T. Ohgami [et al.] // PLoS ONE. — 2018. — № 13 (6). — e0198409. DOI 10.1371/journal. pone.0198409.
4. Origin of CMS-PET1 cytotype in cultivated sunflower: A new insight / K. Azarin, A. Usatov, A. Kasianova [et al.] // Gene. — 2023. — V. 888. — Elsevier. 1-4780. —1 https://doi.org/10.1016Xj.gene.2023.147801.
5. Chen, L. Male Sterility and Fertility Restoration in Crops / L. Chen, Y. Liu // Annual Review of Plant Biology. - 2014. — № 65. — Р. 579—606. DOI org/10.1146/ annurev-arplant-050213-040119.
6. Bohra, A. Cytoplasmic male sterility (CMS) in hybrid breeding in field crops. Review / A. Bohra, U. Jha, P. Adhimoolam // Plant Cell Rep. — 2016. — V. 35 (5). — P. 967—993. doi: 10.1007/s00299-016-1949-3.
7. Liu, Q. Analysis of Cytoplasm Polymorphism on the TR2 Locus of Mitochondria Genome in Leaf Beet Line SK-5 / Q. Liu, L. Liu, Ch. Luo [et al.] // Advances in Biological Sciences Research. — 2017. — № 4. — P. 292—296.
8. Matsuhira, H. Unusual and Typical Features of a Novel Restorer-of-Fertility Gene of Sugar Beet (Beta vulgaris L.) / H. Matsuhira, H. Kagami, M. Kurata // Genetics. — 2012. — № 192. — P. 1347—1358. DOI https:// doi.org/10.1534/genetics.112.145409.
305023, г. Курск, ул. Литовская, 12Д, помещение 3. Тел/факс: +7 (4712) 39-96-17 E-mail: [email protected] www.tts-filter.ru
9. Nishizawa, S. Variable number of tandem repeat loci in the mitochondrial genomes of beets / S. Nishizawa, T. Kubo, T. Mikami // Current Genetics. - 2000. - № 37. - P. 34-38. DOI 10.1007/ s002940050005.
10. Taniguchi, E. Nuclear DNA segments homologous to mitochondrial DNA are obstacles for detecting heteroplasmy in sugar beet (Beta vulgarisL.) / E. Taniguchi, K. Satoh, M. Ohkubo // PLoS ONE. - 2023. - № 18 (8): e0285430. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0285430.
11. Microhomologies Are Associated with Tandem Duplications and Structural Variation in Plant Mitochondrial Genomes / H. Xia, W. Zhao, Y. Shi [et al.] // Genome Biol. Evol. - 2020. - № 12 (11). -P. 1965-1974. DOI 10.1093/gbe/evaa/172.
Аннотация. Цель исследований - проведение молекулярно-генетического тестирования гаплоидных растений-регенерантов сахарной свёклы, а также исходного материала отечественной селекции на наличие локусов, сцепленных с генами, отвечающими за цитоплазматическую мужскую стерильность у растений сахарной свёклы. Был изучен полиморфизм митохондриального генома сахарной свёклы с использованием минисателлитных маркеров группы TR. Приведены результаты скрининга данных генотипов
с применением двух минисателлитных маркеров - TR1 и TR3. Установлено, что ДНК-маркеры митохондриального генома сахарной свёклы позволяют идентифицировать генотипы как мужскостерильные, так и О-тип-формы. Для растений-опылителей (закрепителей стерильности) О-типа характерно наличие ДНК-ампликонов длиной 700 п. н. для пары праймеров TRI F/R и 500 п. н. - для пары праймеров TR3 F/R. Растения МС-форм содержат ампликоны размером 400 п. н. Отобраны и рекомендованы для практической селекции растения МС- и О-тип форм.
Ключевые слова: минисателлитные локусы, праймеры, стерильность, ЦМС, ПЦР-анализ.
Summary. Aim of the investigations is to conduct molecular genetic testing of haploid regenerated sugar beet plants, as well as the source material of domestic selection, for the presence of loci linked to genes responsible for cytoplasmic male sterility in sugar beet plants. The polymorphism of the mitochondrial genome of sugar beet was studied using minisatellite markers of the TR group. The results of screening these genotypes using two minisatellite markers TR1 and TR3 are presented. It has been established that DNA markers of the mitochondrial genome of sugar beets make it possible to identify genotypes of both malesterile and O-type forms. Plants-pollinators (sterility maintainers) of O-type are characterized by the presence of DNA amplicons 700 bp long. for primer pair TR1 F/R and 500 bp. - for a pair of primers TR3 F/R. Plants of MS forms contain amplicons of 400 bp in size. Plants of MS- and O-type forms were selected and recommended for practical breeding. Keywords: microsatellite loci, primers, polymorphism, PCR-analysis, genetic distances.
