CC BY
64
УДК 663.15.:577.15
СКРИНІНГ МІКРОМІЦЕТІВ — ПРОДУЦЕНТІВ ІНУЛІНАЗИ
В. І. Стойко
Н. М. Жданова Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного В. Л. Айзенберг НАН України, Київ
Г. П. Капічон
E-mail: v_stoiko@mail.ru
Проведено ступінчастий скринінг щодо здатності до синтезу інулінази серед 301 колекційної культури 106 видів 39 родів мікроміцетів. Найактивнішими продуцентами виявилися представники родів Aspergillus та Penicillium. Селекціоновано два нових ефективних штами Penicillium sp. 225 (мезофільна культура) і Aspergillus sp. 8ТХ (термотолерантна культура), що мають високі показники інуліназної активності й широкі перспективи застосування в біотехнології.
Ключові слова: скринінг, мікроскопічні гриби, інуліназна активність.
Інуліназа (2, l-ß-D-фруктозанфруктано-гідролаза, КФ 3.2.1.7) є недостатньо вивченим ензимом, який має значні перспективи використання: попереднє оброблення доступної сільськогосподарської сировини, наприклад такої як топінамбур і цикорій, для одержання фруктозних сиропів — дешевих замінників цукру для дієтичного харчування хворих на діабет. Інтерес до процесів ензиматичного гідролізу інуліну рослинного походження пов’язаний також із перспективою отримання цукристих речовин, етанолу та молочної кислоти [1-3].
Під час гідролізу інуліну, що здійснюється ензиматичним шляхом, який є екологічно сприятливішим порівняно з кислотним (хімічним), не отримують побічних продуктів, що ускладнюють виділення й очищення кінцевого продукту. У процесі кислотного гідролізу інуліну спостерігається утворення нередукувальних діангідридів дифруктози та оксиметилфурфуролу, який є отруйною речовиною [1].
В Україні інуліназу не виробляють. Одним із факторів, що лімітує процес її виробництва є, зокрема, відсутність конкурентоспроможних продуцентів.
Інуліназу здатні утворювати багато мікроорганізмів — гриби, дріжджі, бактерії. Серед бактерій, які синтезують внутрішньоклітинний ензим, відомі продуценти з родів Bacillus, Clostridium, Pseudomonas. Водночас, дріжджова і грибна інулінази є індуци-бельними ензимами. Вченими з Інституту мікробіології АН Вірменії було досліджено
інуліназу, отриману за допомогою Kluyvero-myces marxianus [4, 5].
Активнішими продуцентами інулінази є мікроміцети, серед яких на особливу увагу заслуговують представники родів Aspergillus та Penicillium. Екзоінуліназа грибного походження є більш технологічною порівняно з бактеріальною ендоінуліназою [2, 6-12].
Мета нашого дослідження — пошук продуцентів ензиму інулінази грибного походження для подальшого використання в біотехнології.
Матеріали і методи
Об’єктом дослідження був 301 штам з колекції культур відділу фізіології та систематики ІМВ НАНУ 106 видів 39 родів мезо- та термотолерантних мікроскопічних грибів. Переважну більшість штамів мікроміцетів виділено з ґрунтових зразків. Скринінг потенційно активних штамів проводили в кілька етапів.
Для відбору потенційних продуцентів інулінази використовували модифіковане нами рідке живильне середовище Чапека з додаванням 0,5%-го інуліну (Merck, Німеччина) як єдиного джерела вуглецю. Гриби вирощували в умовах глибинного культивування на лабораторних качалках (180-220 об/хв) при 26-28 °С (для мезофільних грибів) та 37-40 °С (для термофільних грибів). Здатність мікроскопічних грибів до розщеплення інуліну оцінювали в культуральних фільтратах досліджуваних штамів на 3-тю та 6-ту
добу культивування. На першому етапі скринінгу здатність до розщеплення інуліну оцінювали хроматографічним способом за наявністю в культуральному фільтраті грибів продукту гідролізу інуліну — D-фруктози.
Для характеристики вмісту продуктів гідролізу інуліну застосовували кругову паперову хроматографію [13]. Цей метод базувався на візуальному порівнянні інтенсивності забарвлення плям за п’ятибальною шкалою. Як розчинник використовували нормальний бутиловий спирт, насичений водою, для чого змішували два об’єми спирту з одним об’ємом води і старанно струшували. Використовували верхній відстояний шар суміші. Досліджувані культуральні фільтрати наносили на «швидкий» хроматографічний папір у кількості 0,02 мл за допомогою мікрошприців. «Свідками» слугували 0,5%-ні розчини D-фруктози, D-глюкози, а також інулінвмісне живильне середовище (як контроль). Цукри на хрома-тограмі виявляли за допомогою реактиву, що містив: 10 мл 96%-го етилового спирту, 1 мл водного розчину 1 н. соляної кислоти та 0,1 г сечовини. З фруктозою цей реактив дає плями сіро-синього кольору, який під час зберігання хроматограм переходить у темно-сірий.
Наступним етапом скринінгу було визначення інуліназної активності штамів, що їх було відібрано кількісним методом з використанням реактиву Самнера [14], який належить до методів відновлення редукуваль-них цукрів. При цьому динітросаліцилова кислота зв’язується з редукувальним гідроксилом, унаслідок чого виникає забарвлення, інтенсивність якого залежить від кількості редукувальних речовин, які вступили в реакцію.
За одиницю інуліназної активності приймали кількість ензиму, яка каталізує утворення 1 мкМ фруктози з інуліну за 1 хв у стандартних умовах проведення реакції (Ч 50 °С, pH 4,6).
Масу міцелію культур різного віку визначали шляхом висушування в сушильній шафі при 105 ± 2 °С до постійної маси.
За здатністю до росту та кількістю утвореної біомаси досліджувані мікроскопічні гриби розподілили на такі групи: не ростуть, мають задовільний (1,3 мг/мл середовища), помірний (до 1,6 мг/мл середовища) та інтенсивний (>1,6 мг/мл середовища) ріст.
Результати та обговорення
Здатність до росту на живильному середовищі, до складу якого входив інулін, та рівень активності ензиму — основні критерії, якими ми послуговувались під час селекції культур мікроміцетів, що синтезують позаклітинну інуліназу.
Було показано, що 65% культур мікроміцетів добре ростуть на інулінвмісному середовищі; 33% культур характеризувалися слабким ростом, а 2% — були не здатні засвоювати інулін як єдине джерело вуглецю (рис. 1).
48%
2% 17%
■ Не ростуть
■ Ріст задовільний (1,3 мг/мл середовища)
□ Ріст помірний (до 1,6 мг/мл середовища)
■ Ріст інтенсивний ( >1,6 мг/мл середовища)
Рис. 1. Ріст мікроміцетів на модифікованому середовищі Чапека з інуліном
Дані про кількість ізолятів потенційно активних штамів щодо синтезу інулінази наведено в табл.1.
Із 301 штаму досліджуваних мікроскопічних грибів здатних гідролізувати інулін до фруктози було 35. Серед них 28 штамів — представники роду Aspergillus, інші 7 культур — представники родів Penicillium (Peni-cillium sp. 225), Acremonium (A. flavum 61968), Fusarium (F. solani 50589), Trichocla-dium (T. asperum 394), Cunninghamella (C. ele-gans 3), Trichoderma (Trichoderma sp. ITP).
Із 90 ізолятів роду Aspergillus 30% виявили здатність до розщеплення інуліну (рис. 2). У наших дослідах досить активними були штами A. ustus (12 штамів), A. carbonarius (5 штамів), A. foetidus (4 штами), A. awamori (3 штами). Активність інулінази відзначено також в окремих штамів Aspergillus sp. 8 TX,
A. carneus, A. niger, A. terreus. Натомість
A. candidus, A. egiptiacus, A. ochraceus, A. par-vulus, A. versicolor були нездатні гідролізува-ти інулін.
Таблиця 1. Досліджувані мікроскопічні гриби — продуценти інулінази
№ п/п Назва виду гриба Кількість досліджуваних штамів
1 2 3
pig Absidia 4
1 Absidia glauca Hagem 1
2 Absidia sp. 3
pig Acremonium 4
3 Acremonium charticola (Lindau) W. Gams 1
4 A. flavum W. Gams 1
5 A. thermophilum W. Gams & Lacey 1
6 Acremonium sp. 1
pig Actinomucor 1
7 Actinomucor elegans (Eidam) C. R. Benjamin & Hesseltine 1
pig Aspergillus 90
8 Aspergillus awamori Nakazawa 18
9 A. candidus Link: Fries 2
10 A. carbonarius (Bainier) Thom 7
11 A. carneus (van Tieghem) Blochwitz 1
12 A. egiptiacus Moubasher & Moustafa 1
13 A. flavipes Wiley & Simmons 3
14 A. foetidus Thom & Raper 6
15 A. niger van Tieghem 21
16 A. ochraceus Wilhelm 1
17 A. parvulus G. Smith 1
18 A. terreus Thom & Raper var. aureus 1
19 A. terreus Thom var. terreus 2
20 A. ustus (Bainier) Thom & Church 22
21 A. versicolor (Vuillemin) Tiraboschi 4
pig Chaetomium 4
22 Chaetomium. succineum L. Ames 1
23 Ch. termophilum La Touche var. termophilum 2
24 Ch. virescens (von Arx) Udagawa 1
pig Chrysosporium 5
25 Chrysosporium sp. 5
pig Cladosporium 11
26 Cladosporium cladosporioides (Fresenius) de Vries 6
27 C. herbarum (Persoon: Fries) Link 8
28 C. sphaerospermum Penzig 4
pig Cochliobolus 1
29 Cochliobolus lunatus R. Nelson & Haasis 1
pig Corynascus 2
30 Corynascus sepedonium (C. W. Emmons) von Arx 1
31 Corynascus sp. 1
pig Cunninghamella 3
32 Cunninghamella elegans Lendner 3
pig Drechslera 1
33 Drechslera sp. 1
pig Epicoccum 1
34 Epicoccum nigrum Link 1
Продовження табл. 1
1 2 3
pig Eupenicillum 2
35 Eupenicillum parvum (Raper & Fennell) Stolk & D. B. Scott 1
36 E. stolkiae D.B. Scott 1
pig Fusarium 100
37 Fusarium avenaceum (Corda: Fries) Saccardo 7
38 F. camptoceras Wollenweber & Reinking 1
39 F. culmorum (W.G. Smith) Saccardo 7
40 F. graminearum Schwabe 1
41 F. heterosporum Ness: Fries 1
42 F. incarnatum (Roberge) Saccardo 2
43 F. javanicum Koorders 1
44 F. lateritium Ness: Fries var. lateritium 1
45 F. oxysporum Schlechlendahl: Fries 16
46 F. sambucinum Fuckel var. sambucinum 37
47 F. solani (Martius) Saccardo 18
48 Fusarium sp. 6
49 F. tumidum Sherbakoff 1
50 F. virticillioides (Saccardo) Nirenberg 1
рід Geotrichum 4
51 Geotrichum candidum Link: Fries 1
52 G. capitatum (Diddens & Lodder) von Arx 1
53 Geotrichum sp. 2
рід Humicola 3
54 Humicola grisea Traaen var. grisea 1
55 H. insolens Cooney & Emerson 2
рід Malbranchea 1
56 Malbranchea cinnamomea (Libert) van Oorschot & de Hoog 1
рід Melanocarpus 2
57 Melanocarpus albomyces (Cooney & Emerson) von Arx 2
рід Mortierella 2
58 Mortierella isabellina Oudemans 1
59 M. vinacea Dixon-Stewart 1
рід Mucor 3
60 Mucor sp. 3
61 Mycelia sterilia (white) 1
рід Myceliophthora 1
62 Myceliophthora hinnulea Awao & Udagawa 1
рід Oidiodendron 1
63 Oidiodendron cerealis (von Thunen) Barron 1
рід Paecilomyces 2
64 Paecilomyces lilacinus (Thom) Sam. 1
65 P. marquandii (Massee) S. Hughes 1
рід Penicillium 15
66 Penicillium aculeatum Raper & Fennell 1
67 P. citrinum Thom 1
68 P. decumbens Thom 1
69 P. diercxii Biourge 1
70 P. funiculosum Thom 1
71 P. glabrum (Wehmer) Westling 1
Продовження табл. 1
1 2 3
72 P. piceum Raper & Fennell 1
73 P. rubrum Stoll 1
74 P. sclerotiorum van Beyma 2
75 Penicillium sp. 2
7б P. tardum Thom 1
77 P. thomii Maire 1
78 P. verruculosum Peyronel 1
рід Pseudeurotium 1
79 Pseudeurotium zonatum van Beyma 1
рід Rhizomucor б
80 Rhizomucor miehei (Cooney et Emerson) Schipper 1
81 Rh. pusillus (Lindt) Schipper 3
82 Rhizomucor sp. 1
рід Rhizopus З
83 Rh. microsporus van Tieghem var. microsporus 1
84 Rhizopus sp. 2
рід Scopulariopsis 2
85 Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier 1
8б S. brumptii Salvanet-Duval 1
рід Scytalidium 1
87 Scytalidium thermophilum (Cooney & Emerson) Austwick 1
рід Sordaria 1
88 Sordaria sp. 1
рід Talaromyces 2
89 Talaromyces emersonii Stolk 1
90 T. luteus (Zukal) C.R. Benjamin 1
рід Thermoascus 2
91 Thermoascus aurantiacus Miehe 1
92 Th. crustaceus (Apinis & Chesters) Stolk 1
рід Thermomyces 1
93 Thermomyces lanuginosus Tsiklinsky 1
рід Thielavia 11
94 Thielavia sp. 4
95 Th. terrestris (Apinis) Malloch & Cain 7
рід Trichocladium 1
9б Trichocladium asperum Harz 1
рід Trichoderma 4
97 Trichoderma konindii Oudemans 1
98 T. pseudokoningii Rifai 1
99 Trichoderma sp. 1
100 T. viride Persoon: Fries 1
рід Ulocladium 3
101 Ulocladium atrum Preuss 1
102 U. botrytis Preuss 1
103 Ulocladium sp. 1
рід Verticillium З
104 Verticillium bulbillosum 1
105 V. chlamydosporium Goddard var. chlamydosporium 1
10б Verticillium sp. 1
Всього З01
■ Aspergillus ustus О Aspergillus awamori □ Aspergillus niger
■ Aspergillus carbonarius [I Aspergillus foetidus
U . і ч\'Г^;Ип \ canh і ¡' С . і чч'Г^іИи \ .-p. 4 Л
■ Aspergillus terreus
Рис. 2. Досліджувані штами роду Aspergillus, які виявили здатність до розщеплення інуліну
Найвищі показники активності на 3-тю добу росту відзначено у представників міто-спорових світлозабарвлених грибів Penicil-lium sp. 225, A. flavum 61968 та Mycelia ste-rilia (white) 16692, A. carneus 1957, а серед пігментованих — у T. asperum 394. У світлоза-барвлених грибів Aspergillus sp. 8 TX і A. ustus 57p високий рівень інуліназної активності встановлено на 6-ту добу росту (табл. 2).
Гриби з підвищеною здатністю до розщеплення інуліну характеризувалися задовіль-
ним, помірним та інтенсивним рівнями накопичення біомаси, проте кореляції між рівнем накопичення біомаси грибами на інулін-вмісному середовищі та їхніми гідролітичними властивостями ми не спостерігали.
Як показали наші дослідження, дані первинного скринінгу щодо виявлення активних штамів повністю збігалися з результатами кількісного методу визначення інуліназної активності грибів з використанням реактиву Самнера (табл. 3).
Таблиця 2. Здатність грибів до розщеплення інуліну
№ п/п Вид гриба Штам 3-тя доба 6-та доба
1 2 3 4 5
1 Acremonium flavum 61968 +++ ++
2 Aspergillus awamori 131 p + +
3 Ca 1017 + +
4 Ca 162 K + +
5 Aspergillus carbonarius Ca 136 ap + +
6 Ca 136 K + +
7 Ca 136 p + +
8 Ca 137 ap + +
9 Ca 137 p + +
10 Aspergillus carneus 1957 +++ ++
11 Aspergillus sp. 8TX ++ ++++
12 Aspergillus foetidus 132 ap foet + +
13 Ca 132 p + +
14 Ca 133 ap + +
15 Ca 133 p + +
16 Aspergillus niger 1521 a ++ ++
17 Aspergillus terreus 85p + +
Продовження табл. 2
1 2 3 4 5
18 5б p + +
19 57 a + +
20 57 ap + +
21 57 p ++ +++
22 58 p + +
23 Aspergillus ustus б1 p + +
24 б3 p + +
25 б4 p + +
2б б5 p + +
27 бб p + +
28 б8 p + +
29 б9 p + +
30 Cunninghamella elegans 3 + +
31 Fusarium solani 50589 ++ ++
32 Mycelia sterilia (white) 1бб92 +++ ++
33 Penicillium aculeatum 225 ++++ ++
34 Trichocladium asperum 394 +++ ++
35 Trichoderma sp. ITP ++ ++
Примітка. «0» — ознака відсутня; «+» — ознака виявлена у слідових кількостях; «++» — ознака слабо виражена; «+++» — ознака помірно виражена; «++++» — ознака сильно виражена.
Таблиця 3. Інуліназна активність відібраних мікроміцетів
№ п/п Назва гриба Місце виділення Маса міцелію, мг/100 мл Інуліназна активність, мг/мл
1 Penicillium sp. 225 Київська область, Обухівський район 0,340 З,2З ± 0,02
2 Acremonium flavum 61968 Крим, Джанкойський район 0,17б 0,58 ± 0,03
3 Mycelia sterilia (white) 16692 Київська область, Обухів 0,170 0,98 ± 0,03
4 Trichocladium asperum 394 Київська область 0,195 0,40 ± 0,02
5 Aspergillus carneus 1957 Луганська область, Лисичанськ 0,175 1,25 ± 0,02
б Fusarium solani 50589 Житомирська область 0,178 0,б3 ± 0,05
7 Aspergillus sp. 8TX Крим 0,310 2,14 ± 0,02
8 Aspergillus ustus 57p Крим 0,230 0,42 ± 0,03
9 Trichoderma sp. ITP Полтавська область 0,187 0,7б ± 0,03
10 Aspergillus niger 1521 a Київська область, Обухівський район 0,211 0,б7 ± 0,03
У результаті первинного скринінгу продуцентів інулінази з 10 відібраних нами штамів найвищу інуліназну активність відзначено у Penicillium sp. 225, Aspergillus sp. 8TX, A. carneus 1957 — на середовищі з інуліном вона становила 3,23, 2,14 та 1,25 од/мл відповідно. В інших досліджених штамів культур мікроскопічних грибів величина інуліназної активності була нижчою за 1 од/мл.
Tаким чином, найактивнішими продуцентами інулінази виявилися представники родів Aspergillus та Penicillium. При цьому
штамова особливість мала велике значення. Отримані нами дані щодо скринінгу узгоджуються з даними інших дослідників [2, 6-12].
Унаслідок спрямованого ступінчастого скринінгу серед 301 культури мікроміцетів різного таксономічного положення селекціоновано два нових ефективних штами Penicillium sp. 225 (мезофільна культура) і Aspergillus sp. 8ТХ (термотолерантна культура), які мають високу інуліназну активність. Це може бути використано в подальших дослідженнях щодо можливого застосування у процесі виробництва цього ензиму.
ЛІТЕРАТУРА
1. Абелян В. А., Манукян Л. С., Африкян Э. Г. Получение фруктозо-глюкозного сиропа из инулинсодержащего сырья с применением иммобилизованных клеток дрожжей // Прикл. биохим. микробиол. — 1998. — Т. 34, № 5. — С. 544-548.
2. Грачова И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. — М.: Элевар,
2000. — 512 с.
3. Микробные ферменты и биотехнология / Под ред. В. М. Фогарти. — М: Агропромиз-дат, 1986. — 242 с.
4. Жеребцов Н. А., Абрамова И. Н., Шеламова С. А Выделение экстрацеллюлярной бактериальной инулиназы и изучение ее физико-химических свойств // Биотехнология. —
2002. — № 3. — С. 13-20.
5. Абелян В. А., Манукян Л. С. Характеристика экзо-инулиназ Kluyveromyces marxianus и Bacillius licheniformis // Биохимия. — 1996. — Т. 61, вып. 6. — С. 35-38.
6. Gill P. K., Manhas R. K., Singh J., Singh P. Purification and characterization of an exoin-ulinase from Aspergillus fumigatus // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2004. — V. 117, N 1. — Р. 19-32.
7. Kulminskaya A. A., Arand M., Eneyskaya E. V. еt al. Biochemical characterization of Aspergillus awamori exoinulinase: substrate binding characteristics and regioselectivity of hydrolysis // Biochim. Biophys. Acta. —
2003. — V. 1650, N 1-2. — Р. 22-29.
СКРИНИНГ МИКРОМИЦЕТОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ИНУЛИНАЗЫ
В. И. Стойко, Н. Н. Жданова,
В. Л. Айзенберг, А. П. Капичон
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: v_stoiko@mail.ru
Проведен ступенчатый скрининг способности к синтезу инулиназы среди 301 коллекционной культуры 106 видов 39 родов микро-мицетов. Самыми активными продуцентами оказались представители родов Aspergillus и Penicillium. Селекционированы два новых эффективных штамма Penicillium sp. 225 (ме-зофил) и Aspergillus sp.8TX (термотолерантная культура), которые имеют высокие показатели инулиназной активности и широкие перспективы применения в биотехнологии.
Ключевые слова: скрининг, микроскопические грибы, инулиназная активность.
8. Skowronek M, Fiedurek J. Optimisation of inulinase production by Aspergillus niger using simplex and classical method // Food Technol. Biotechnol. — 2004. — V. 42, N 3. — Р. 141-146.
9. Akimoto H, Kiyota, N, Kushima T, Nakamura T. Molecular cloning and sequence analysis of an endoinulinase gene from Peni-cillium sp. strain TN-88 // Biotechnol. Bio-chem. — 2000. — V. 64. — Р. 2328-2335.
10. Rosemeire A. B. Pessoni, Marcia R. Braga, Rita de Cassia L. Figueiredo-Ribeiro. Purification and properties of exo-inulinases from Penicillium janczewskii growing on distinct carbon sources // Mycologia. — 2007. — V. 99, N 4. — Р. 493-503.
11. Балаян А М., Пивазян Л. А, Хачатурян Р. Н. и др. Инулиназы Peniccilumpalitans и Penic-cilum cyclopium 895 // Биотехнология. —
2001. — № 3. — С. 72.
12. Корнеева О. С., Жеребцов Н. А., Шуваева Г. П. и др. Инулаза микромицета Aspergillus awamori 808. Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства // Там же. — 1993. — № 7. — С. 31-35.
13. Бояркин А. Н. Простой хроматографический и капельный метод определения сахаров на фильтровальной бумаге. — М.: Наука, 1989. — 115 с.
14. Айзенберг В. Л., Стойко В. И., Демиде-нокЕ. А. и др. Методика количественного определения активности грибной инулина-зы с использованием реактива Самнера // Биотехнология. — 2007. — № 5. — С. 95-96.
SCREENING OF MICROMYCETES AS PRODUCERS OF INULINASE
V. I. Stoiko, N. M. Zhdanova,
V. L. Aisenberg, A. P. Kapichon
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: v_stoiko@mail.ru
Screening of producers of inulinase among 301 collection strains of 106 species of 39 genus of micromycetes has been carried out. The most active inulinase producers of Aspergillus and Penicillium genus were found. The new effective strains Penicillium sp. 225 (mesophyl) and Aspergillus sp.8TX (thermophyl culture) with high level of inulinase activity were selected for use in biotechnology.
Key words: screening, microscopic fungi, inulinase activity.
