CC BY
94
Скелет натуральных кораллов сем. Асгорога в замещении дефекта костной ткани у мелких и крупных лабораторных животных
И.К. Свиридова, Н.С. Сергеева, ГА. Франк, В.В. Тепляков, В А. Кирсанова,
С А. Ахмедова, И.В. Мыслевцев, Я.Д. Шанский
ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. ПА. Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва
A skeleton of Асгорога corals in replacing bone tissue defects in small and large laboratory animals
IK. Sviridova. NS. Sergeeva, GA. Frank, V.V. Teplyakov, V.A. Kirsanova, SA. Akhmedova,
I.V. Myslevtsev, Ya.D. Shansky
Moscow PA. Gerzen Research Institute of Oncology
Цель работы — оценка in vitro острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности образцов натурального коралла (НК) семейства Асгорога, in vivo — их биосовместимости и остеозамещающих потенций.
Исследование острой цитотоксичности (24 ч культивирования) и матриксных свойств поверхности частиц НК (1—14 сут. культивирования) было выполнено на культуре иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ), жизнеспособность которых оценивали с помощью МТТ-теста. Биосовместимость НК изучали на модели подкожной имплантации крысам его частиц. Остеозамещающие потенции НК оценивали на моделях ограниченного (краевая резекция большеберцовой кости крыс) и критического (сегментарная резекция бедренной кости барана) костных дефектов. Оперативные вмешательства на животных производили под общим обезболиванием.
В экспериментах in vitro с помощью МТТ-теста было показано, что НК нетоксичны в отношении культуры ФЧ и обладают выраженными матриксными свойствами. При подкожной имплантации происходила биорезорбция частиц НК без признаков отторжения и воспалительной реакции вокруг них. У крыс замещение костного дефекта частицами НК обеспечивало полное закрытие дефекта через 9 нед. При этом остеогенез в зоне дефекта происходил в непосредственной топической связи с частицами имплантированного НК. У барана при использовании цельного НК-имплантата через В мес. после операции на микропрепаратах наблюдалось почти полное замещение вещества НК компактной костной тканью с формированием органотипических структур (остеонов).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что скелет НК сем. Асгорога обеспечивает эффективную адгезию и длительную пролиферацию ФЧ, биосовместим и обладает выраженными остеорепаративными свойствами, способствует формированию в зоне дефекта зрелой костной ткани путем периостального остеогенеза.
Ключевые слова: натуральный коралл, костные дефекты, биосовместимость, острая цитотоксичность, матриксные свойства поверхности, биорезорбируемость.
The aim of study was to estimate an acute cytotoxicity and matrix properties of Acropora natural coral (NC) skeleton surface (in vitro) and their biocompatibility and abilities to replace bone defect (in vivo).
The investigation of acute cytotoxicity (24 hours of cultivation) and matrix properties of NC particles surface (1— 14 days of cultivation) was carried out on immortalized normal human fibroblasts (HF) cell line. Fibroblasts' vitality was evaluated by means of MTT-test. Biocompatibility of NC was studied on model of subcutaneous implantation (rats). Properties of NC to replace bone defects were estimated on models of limited (rats femur border resection) and critical (sheep femur segmental resection) bone defects. Surgical inventions on animals were accomplished with general anesthesia.
In vitro experiments showed, that NC are non-toxic for HF culture and have good matrix properties. After subcutaneous implantation the bioresorption of NC particles had take place without rejection signs and inflammation reaction around them. The bone defect replacement by NC particles (rats model) leads to full defect regeneration was observed in 9 weeks. Thereby, zones of osteogenesis in defect area were topically connected with implanted NC particles. The monolithic NC implant (sheep model) was replaced by organotypical bone tissue with osteons formation in 6 months after surgery.
These results show that NC skeleton provide effective adhesion and long-term proliferation of HF, are biocompatible and have good osteoreparative properties, providing mature bone tissue formation in defect zone by means of periosteal osteogenesis.
Key words: natural coral, bone defects, biocompatibility, acute cytotoxicity, matrix properties of surface, bioresorption.
Биоматериалы, используемые для замещения костных дефектов, должны отвечать ряду требований: быть биосовместимыми, биорезорбируемыми (в идеале скорость биорезорбции должна быть согласована со скоростью неоостеогенеза), биоактивными, иметь топографию и микрорельеф поверхности, способствующий активной адгезии и пролиферации клеток, обладать определенными физико-механическими характеристиками для обеспечения прочности конструкции
e-mail: prognoz.06@mail.ru
в переходный период и, наконец, иметь остеокондук-тивные/остеоиндуктивные потенции [1—3]. Части этих требований отвечает пористая биокерамика на основе гидроксиапатита. По химическому составу этот материал близок к внеклеточному веществу кости, нетоксичен и обладает высокой биосовместимостью. Глицерофосфат кальция, входящий в состав биокерамики, является индуктором остеогенной дифферен-цировки клеток в условиях in vitro, пористость обеспе-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
чивает этому материалу развитую поверхность для активной экспансии клеток, возможность доставки питательных веществ и неоваскуляризации имплантата [4—6]. Однако недостаточные механические свойства калыдийфосфатной керамики ограничивают ее клиническое использование в качестве остеозамещающего материала в зонах, работающих под нагрузкой [1, 7]. В последнее десятилетие внимание исследователей в аспекте остеозамещения все чаще привлекают материалы природного происхождения, в частности, скелет натуральных кораллов (НК) [7—9]. Уникальные механические свойства этого материала во многом определяются химическим составом (на 98% скелет кораллов представлен кальцитом — СаС03, кристаллическая решетка — арагонит), а также микротопографией и рельефом поверхности: высокой степенью пористости (до 50%), большим размером пор (2^20 мм), их взаимосвязанностью и структурной регулярностью [10,11]. Существенно, что скорость биорезорбции НК практически совпадает со скоростью неоостеогенеза [12,10]. В литературе описан положительный клинический опыт использования кораллов различных семейств в качестве остеозамещающего материала при различных патологических состояниях опорно-двигательного аппарата и лицевого скелета [7, 13-15].
Целью настоящей работы являлась оценка in vitro острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности образцов натурального коралла сем. Асгорога, а в экспериментах in vivo — их биосовместимости и остеозамещающих потенций.
Материалы и методы
Перед началом экспериментов образцы НК механически измельчали в планетарной шаровой мельнице (Retch, Германия; размеры частиц ЗООЧЗОО мкм), тщательно отмывали по разработанной ранее методике и стерилизовали у-облучением в дозе 25 КГр.
Исследования по оценке острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности НК были выполнены на культуре иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ), которая была любезно предоставлена д.б.н. Е.Е. Егоровым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Знгельгардта РАН). За сутки до начала опыта in vitro частицы НК помещали в 96-луночные культуральные планшеты (Costar, США) и заливали для насыщения полной ростовой средой (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ («ПанЗко», Россия), 10% эмбриональная телячья сыворотка («HyClone», США), глютамин (292 мг/л), ген-тамицин (50 мг/л) («ПанЗко», Россия). Перед началом эксперимента из лунок с образцами НК (опыт)
декантировали среду и вносили суспензию ФЧ в объеме 200 мкл ПРС (плотность посева 70 тыс. клеток на лунку). Контролем служила культура ФЧ на поли-стирене (культуральный пластик). Опытные и контрольные лунки были представлены в триплетах. Культивирование осуществляли при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% С02. Смену ПРС в планшетах осуществляли дважды в неделю. Острую цитотоксичность НК определяли через 24 ч, мат-риксные свойства кораллов оценивали в динамике культивирования на них клеток в сроки 3, 7 и 14 сут. Жизнеспособность ФЧ на этапах экспериментов оценивали с помощью МТТ-теста [16], рассчитывая пул жизнеспособных клеток (ПЖК) в каждый конкретный срок по оптической плотности раствора формазана, в сравнении с контролем.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы «Statistics».
Для исследования биосовместимости образцов НК в экспериментах in vivo использовали модель подкожной трансплантации. Для этого крысам — самкам линии Wistar весом 180^200 г — под наркозом делали кожный надрез в области грудного отдела позвоночника. Тупым концом скальпеля кожу осторожно отделяли от прилегающего слоя подкожной клетчатки и мышц, в образованный «карман» имплантировали предварительно подготовленный образец НК весом около 120 мг и затем на область раны накладывали швы. Животных выводили из эксперимента через 3, 6, 9 и 12 нед., извлекали материал с прилежащими тканями и проводили их визуальную оценку (стереомикроскоп с цифровой видеокамерой «Olympus», Япония). Гистологические исследования в этих и последующих экспериментах были выполнены по общепринятым методикам: фрагмент ткани с НК фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, декальцинировали в 0,ЗМ растворе ЗДТА («Sigma», США), готовили парафиновые блоки, далее — гистологические препараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином [17].
Исследование in vivo остеозамещающих потенций НК проводили на двух экспериментальных моделях: краевой резекции большеберцовой кости крыс и сегментарной резекции бедренной кости барана.
Для проведения остеотомии у крыс на границе верхней и средней трети кости голени с помощью бора формировали «окончатый дефект» (длина 6^8 мм, ширина 1,5^2 мм, глубина 2,5^3 мм) до нижнего кортикального слоя. Область дефекта заполняли стерильными частицами НК (рис. 1А). На заключительном этапе операционную рану послойно ушивали.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
■■■ ■ I I I I I I I -ф- I ■ ■ игл
Было сформировано две группы животных: контроль — незамещенный костный дефект, опыт — костный дефект, замещенный по всей протяженности гранулированным НК.
Для проведения морфологических исследований зоны дефекта животных выводили из эксперимента через 3, 6, 9 и 12 нед. (по 2 животных в каждый срок), производили выделение костного фрагмента и готовили гистологические препараты по описанной выше методике.
Сегментарная резекция бедренной кости барана в данном исследовании была моделью критического дефекта костной ткани. Перед операцией для каждого животного по рентгенограммам были изготовлены индивидуальные цельные имплантаты из НК, представляющие собой цилиндр с выступами для фиксации в костномозговом канале. В среднем, высота цилиндра составляла 2 см, диаметр — 1,8 см. В зону проведения сегментарной резекции бедренной кости помещали подготовленный имплантат, фиксировали выступами в костномозговом канале и закрепляли между костными фрагментами с помощью пластины для накостного остеосинтеза («Synthes», Швейцария) (рис. 1Б).
Рентгенологическое исследование животным проводили сразу после завершения операции и в динамике наблюдения через 1, 4 и 6 мес. Оперативные вмешательства и динамическое рентгенологическое обследование баранов осуществляли под наркозом.
Через 6 мес. животных выводили из эксперимента, проводили оценку макропрепарата, который затем распиливали на фрагменты и по стандартной методике готовили микропрепараты.
Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием лабораторных животных», 12 августа 1977).
Результаты и обсуждение
Поверхность коралла сем. Асгорога пронизана сквозными мелкими и крупными (120—940 мкм) порами, при этом общая пористость составляет 40^50% [7, 11, 14]. На снимках, полученных методом сканирующей электронной микроскопии (СЗМ), видно, что каждое последующее увеличение визуализирует упорядоченную структурированность поверхности участка, который выглядел сравнительно «гладким» на предыдущем снимке. Эти рисунки демонстрируют фрактальность поверхности НК с размером зерна не менее чем в нанодиапазоне (рис. 2А^Г). Таким образом, по развитости и структурированности поверхности скелет НК сем. Асгорога существенно превосходит используемые в клинике синтетические кальцийфосфатные материалы.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
В экспериментах in vitro с помощью МТТ-теста было показано, что через 24 ч инкубации клеток с частицами НК к их поверхности прикреплялся практически весь пул посеянных ФЧ (93,7%). При увеличении сроков культивирования ФЧ до 14 сут. было выявлено монотонное нарастание оптической плотности раствора формазана, косвенно свидетельствующее об увеличении клеточной популяции фибробластов, статистически достоверно превосходящее (с 7-х сут. наблюдения) контрольные значения (табл.).
Таким образом, на основании экспериментов in vitro можно заключить, что образцы НК не токсичны в отношении культуры ФЧ и обладают выраженными матриксными качествами, которые выражаются в способности обеспечивать эффективную адгезию и длительную пролиферацию клеток. В результате этих процессов через две недели культивирования поверхность коралла, включая поровые пространства, оказывается достаточно равномерно заселенной культурой ФЧ.
Биосовместимость НК оценивали на модели подкожной имплантации крысам частиц НК. На макропрепаратах, полученных через 9 нед. после операции, видно, что вокруг частиц коралла начала формироваться соединительная капсула, интимно прилегающая к ним и пронизанная новообразующейся капиллярной сетью (рис. 3). На первом этапе макропрепарат
подвергали декальцинации, поэтому места, где были гранулы НК, на гистологических срезах выглядели в виде пустых пространств округлой или овальной формы (рис. 4). Через 3 нед. вокруг частиц НК отмечалось формирование соединительной ткани (рис. 4А), количество которой через 3^6 мес. нарастало, наблюдалась активная неоваскуляризация (рис. 4Б, В). Ни в одном из препаратов не было обнаружено признаков отторжения НК, и, следовательно, его можно рассматривать как биосовместимый материал (рис. 4А, Б, В).
При оценке остеозамещающих потенций НК у крыс было показано, что в контрольной группе животных с краевой резекцией большеберцовой кости (I группа) через 6 и 9 нед. после операции не происходило закрытия костного дефекта. В то же время, заполнение дефекта частицами НК (II группа) значительно ускоряло процессы репаративной регенерации: на микропрепаратах, полученных через 6 нед. после операции, отмечался активный остеогенез с частичным замещением коралла образованной de novo костной тканью (рис. 5А). При этом было отмечено, что остеогенез в зоне дефекта осуществляется в непосредственной топической связи с частицами имплантированного НК. Через 9 нед. происходило полное закрытие дефекта с формированием по периферии компактной, а в центре — губчатой кости с очагами гемопоэза (рис. 5Б).
Динамика изменения оптической плотности раствора формазана (усл.ед. ± ш, МТТ-тест) и величины ПЖК (в %) при культивировании фибробластов человека на полистирене (контроль) и натуральном коралле сем. Асгорога
Образцы Величина оптической плотности раствора формазана (усл.ед., МТТ-тест) и ПЖК в разные сроки культивирования (сут.)
1 3 7 14
Контроль (полистирен) 0,634±0,031 (100,0%)* 0,810±0,004 (100,0%) 1,072±0,0S2 (100,0%) 1,362±0,070 (100,0%)
Опыт (натуральный коралл) 0,S94±0,01 (93,7%) 0,866±0,023 (107,0%) 1,S12±0,087** (141,0%) 2,083±0,097** (153,0%)
Примечание: * — в скобках — величина ПЖК; ** — статистически достоверная разница с контролем [р< 0,05).
'Гд
■ J
уз?»
Рис. 3.
Внешний вид капсулы с частицами натурального коралла, имплантированными под кожу крысы, через 9 нед.
У в. х16
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Рис. 4. Частицы коралла сем. Асгорога, имплантированные под кожу крыс, в разные сроки после операции:
А- 3 нед.; Б- 3 мес.; В - В мес. [гистологический препарат после декальцинации). Окраска: гематоксилин-эозин. У в. х100
Рис. 5.
Динамика замещения костного дефекта крысы с использованием натурального коралла:
А —6 нед.;
Б - 9 нед.
Окраска: гематоксилин-эозин. Ув. А — х700; Б — хбО
Таким образом, на модели ограниченного костного дефекта — краевой резекции большой берцовой кости крыс — показано, что скелет НК сем. Асгорога обладает выраженными остеопластическими потенциями, способствуя формированию зрелой костной ткани в зоне имплантации. Репарация утраченного объема костной ткани при этом протекает путем периостального остеогенеза.
Эксперименты по исследованию возможности замещения критического костного дефекта цельным НК-имплантатом были проведены на баранах (модель — сегментарный дефект бедренной кости). На рентгенологических снимках, сделанных сразу после операции, отчетливо контурируется имплантат, фиксированный выступами в костно-мозговом канале и фиксирован-
ный в зоне дефекта титановой пластиной и винтами. Через 1 мес. после операции стабильность конструкции сохранялась и наблюдалось постепенное «размывание» ее границ с окружающей костной тканью (рис. 6А, Б, В). Через 4 мес. по рентгенограммам видно формирование костной мозоли и признаки резорбции вещества НК имплантата, через 6 мес. отмечались явные признаки консолидации костных фрагментов с имплантатом в зоне дефекта. Это явилось основанием для вывода животного из эксперимента с целью изучения макро- и микропрепаратов из этой зоны.
На продольном распиле кости было выявлено полное закрытие зоны дефекта с формированием по всему объему губчатой костной ткани в центре и компактной — снаружи (рис. 7).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Рис. 7.
Макропрепарат зоны дефекта, замещенного цельным коралловым имплантатом, через 6 мес. после операции
На микропрепаратах из периферической части этой зоны наблюдалось почти полное замещение вещества НК компактной костной тканью с формированием органотипических структур (остеонов). В отдельных полях зрения между остеонами были отмечены остатки вещества коралла, зоны скопления остеобластов, активная неоваскуляризация. В центре некоторых остеонов были выявлены полости с жировой тканью и цепочками остеобластов по периферии полости — вероятно, зачатками костномозгового матрикса (рис. 8).
Таким образом, полученные данные экспериментов по исследованию возможности замещения ограниченного (краевая резекция большеберцовой кости крыс) и протяженного (критического — сегментарная резекция бедренной кости барана) костных дефектов у лабораторных животных имплантатами на основе натуральных кораллов свидетельствуют о выраженных остеорепаративных потенциях скелета коралла из сем. Асгорога. Существенным, с нашей точки зрения, является факт обнаружения согласованной скорости биорезорбции вещества коралла со скоростью неоостеогенеза в случае использования цельного НК имплантата.
Рис. 8. Костная ткань разной степени зрелости на месте НК из периферической зоны дефекта [Б мес. после операции).
Окраска: гематоксилин-эозин. У в. х100
ЛИТЕРАТУРА
1. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. — М. : Техносфера; 2007. — 3D4 с.
2. Григорьян А.С., Топоркова А.К. Проблемы интеграции имплантатов в костную ткань [теоретические аспекты]. — М. : Техносфера, 2007. — 128 с.
3. Begley C.T., Doherty M.J., Mollan R.A. et al. Comparative study of the osteoinductive properties of bioceramic, coral and processed bone graft substitutes. Biomaterials 1995; 16: 1181—5.
4. Баринов C.M., Комлев B.C. Биокерамика на основе фосфатов кальция. — М.: Наука; 2DD5: 62—8.
5. Чиссов В.И., Свиридова И.К., Сергеева Н.С. и др. Исследование in vitro матриксных свойств поверхности пористых гранулированных кальций-фосфатных керамических материалов. Клеточные технологии в биологии и медицине 2DD8; 2: 68—82.
6. Чиссов В.И., Свиридова И.К., Сергеева Н.С. и др. Исследование in vivo биосовместимости и динамики замещения дефекта голени крыс пористыми гранулированными биокерамическими материалами. Клеточные технологии в биологии и медицине 2008; 3; 151-6.
7. Demers С., Hamdy C.R., Corsi К. et al. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: a review. Bio-med. Mater. Eng. 2002; 12C1 ]: 15-35.
8. Ehrlich H., Etnoyer P., Litvinov S.D. et al. Biomaterial structure in deep-sea bamboo coral [Anthozoa: Gorgonacea: Isididae): perspectives for the development of bone implants and templates for tissue engineering. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 2006; 37: 552—7.
9. Abramovitch-Gottlib L., Geresh S., Vago R. Biofabricated marine hydrozoan: a bioactive crystalline material promoting ossification of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 2006; 12: 729—39.
10. Fricain J.C., Roudier М., Rouais F. et al. Influence of the structure of three corals on their resorption kinetics. J. Periodontal Res. 1996; 31: 463-9.
11. Yu-Chun Wu, Tzer-Min Lee, Kuo-Hsun Chiu et al. A comparative study of the physical and mechanical properties of three natural corals based on the criteria for bone-tissue engineering scaffolds. J. Mater. Sci: Mater. Med. 2009; 20: 1273-80.
12. Braye F., Irigaray J.L., Jallot E. et al. Resorption kinetics of osseous substitute: natural coral and synthetic hydroxyapatite. Biomaterials. 1996; 17: 1345—50.
13. Cirotteau Y. A physiological approach in stabilization and consolidation of unstable femoral neck fracture in osteoporotic elderly patients: a retrospective review. Eur. J. Orthop. Surg. Traumatol. 2003; 13: 145—55.
14. Knackstedt M.A., Arns C.H., Senden T.J. et al. Structure and properties of clinical coralline implants measured via 3D imaging and analysis. Biomaterials 2006; 27: 2776—86.
15. Roux F.X., Brasnu D., Menard M. et al. Madreporic coral for cranial base reconstruction. 8 years experience. Acta Neurochir. [Wien], 1995; 133C3-4): 201-5.
16. Mossman T. J. Rapid colorimetric, assay for cellular growth and cytotoxity assays. Immunol. Methods. 1983; 65: 55—63.
17. Микроскопическая техника: руководство для врачей-лаборантов. Под ред. Д.С. Саркисова, ЮЛ. Перова. М.: Медицина. 1996.-542 с.
Поступила 30.052010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
