CC BY
18DOI:10.24412/1999-6780-2020-1-58-63 УДК 582.28:57.012.4:57.086.3
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК КУЛЬТУР LICHTHEIMIA CORYMBIFERA И RHIZOPUS ARRHIZUS
Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Чилина Г.А. (зав. лаб.), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), Босак И.А. (с.н.с.), Выборнова И.В. (н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Павлова И.Э. (н.с.), Спиридонова В.А. (н.с.), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой)
Stepanova А.А. (head of the laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Aak O.V. (leading scientific collaborator), Solovieva G.I. (leading scientific collaborator), Pavlova I.E. (scientific collaborator), Spiridonova V.A. (scientific collaborator), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department),
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) изучали особенности микро-морфологии культур Lichtheimia corymbifera (Cohn) Vuill (PKnTF-1601/1966) и Rhizopus arrhizus A. Fisch. (РКП.TF-1537), выращенных на среде Сабуро. Для культур L. corymbifera характерно умеренно выраженное асинхронное спороношение. Для зрелых клеток вегетативного мицелия, спорангиеносцев, спорангиев и спорангиоспор этого вида свойственно наличие мелкозернистой скульптуры поверхности. Для колоний R. arrhizus характерно обильное спороношение. Выявлено, что поверхность клеточных стенок споран-гиеносцев молодых спорангиев и клеток вегетативного мицелия данного вида гладкая, тогда как с возрастом она становится поперечно-складчатой. Показано, что формирование элементов слоя орнаментации спорангиоспор обоих видов происходит асинхронно после их освобождения из спорангия.
Ключевые слова: in vitro, Lichtheimia corymbifera, Rhizopus arrhizus, сканирующая электронная микроскопия
SCANNING ELECTRON MICROSCOPY OF THE CULTURAL CELLS OF LICHTHEIMIA CORYMBIFERA AND RHIZOPUS ARRHIZUS
* Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: [email protected]
In scanning electron microscopes (SEM) micro-morphological peculiarities of the Lichtheimia corym-bifera (Cohn) Vuill (PKnrF-1601/1966) and Rhizopus arrhizus A. Fisch. (PKnrF-1537) cultures grown on Sabouraud medium were studied. For cultures of L. corymbifera was typical moderately asynchronous sporulation. For the mature cells of vegetative mycelium, stipes of the sporangies, sporangia and sporangiospores of this species were typical the presence of fine-grained surface sculpture. Colonies R. arrhizus were characterized by abundant sporulation. It was revealed that the surface of the cell walls of the stipes of young sporangia and cells of vegetative mycelium of this species were smooth, while with age it becomes transversely folded. It is shown that the formation of elements of the sporangiospores ornamentation layer in both species takes place asynchronous after their release from sporangium.
Key words: in vitro, Lichtheimia corymbifera, Rhizopus arrhizus, scanning electron microscopy
ВВЕДЕНИЕ
Ранее мы провели исследование ультраструктурной организации мукоромицета Lichtheimia corymbifera (Cohn) Vuill (штамм PKnrF-1601/1966) in vitro [1] и in vivo [2]. Для завершения этой работы были изучены особенности микро-морфологии клеток культур гриба в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ).
Представляло интерес продолжить изучение мукоромицетов на примере Rhizopus arrhizus A. Fisch. - широко распространенного вида микро-мицета, вызывающего риноцеребральные [3], кожные инфекции [4], а также язву желудка у больных после пересадки почки [5]. Данный вид
гриба может вызывать поражение легких после пересадки сердца [6], мочеполовой системы [7], является причиной риноцеребрального мукор-микоза у больных сахарным диабетом [8] и др. Полученные данные по ультраструктурной организации R. arrhizus станут основой для его последующего изучения в трансмиссионном электронном микроскопе в ходе in vitro ^in vivo трансформации, что чрезвычайно важно для понимания закономерностей патогенеза микозов, вызываемых данными видами грибов.
Исследовали штаммы L. corymbifera (PKnrF-1601/1966) и R. arrhizus A. Fisch. (PKnrF-1537) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина. Первый штамм был выделен от больного с риноцеребральным мукормикозом, тогда как второй - из брон-хоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациента с диагнозом «острый миелоидный лейкоз». Штаммы L. corymbifera (PKnrF-1601/1966) и R. arrhizus (PKnrF-1537) были определены молекулярно-генетическими методами по ITS локусу.
Для СЭМ кусочки питательной среды с частью трехсуточных колоний двух видов грибов фиксировали по методике, описанной нами ранее [9]. Образцы высушивали при критической точке на приборе HCP-2 15 минут, после чего напыляли золотом и изучали в СЭМ JSM 35 (Jeol, Токио, Япония).
При изучении колоний гриба, выращенных в чашках Петри, на малом увеличении СЭМ выявили, что они состоят из радиально и рыхло ориентированных гиф (Рис. 1 а). В маргинальной молодой части колоний гифы мицелия имеют гладкую поверхность (Рис. 1 б). Характерной особенностью строения поверхности гиф, локализующихся в средней и центральной колониях, является наличие на их поверхности многочисленных мелкозернистых элементов скульптуры (Рис. 1 в, стрелки). Характерной особенностью строения гиф вегетативного мицелия была редкая встречаемость латеральных ответвлений, располагающихся под прямым углом к несущей их гифе. Для колонии анализируемого штамма характерно умеренно выраженное спороноше-ние в виде разновозрастных, хаотично располо-
женных одиночных спорангиев или в немногочисленных группах, в основном, локализующихся по ее периферии.
Молодые (Рис. 1 г) и зрелые до освобождения спорангиоспор спорангии (Рис. 1 д, е) округлой формы (от 50 до 80 мкм). Поверхность молодых спорангиев гладкая (Рис. 1 г), тогда как зрелых - с характерным мелкозернистым рисунком (Рис. 1 д, е). Апофиза конической формы. В молодых спорангиях с гладкой структурой поверхности она имеет мелко складчатую поверхность (Рис. 1 г), в зрелых - к этому добавлялись плотно расположенные мелкозернистые элементы скульптуры (Рис. 1 е, ж).
Локальный (Рис. 1 ж) или тотальный лизис оболочки зрелого спорангия приводит к «оголению» еще молодых спорангиоспор. Именно после лизиса оболочки спорангия начинается их созревание и формирование элементов скульптуры спородермы. На рисунке 1 з продемонстрировано асинхронное формирование элементов скульптуры спорангиоспор. В ходе и после полного завершения этого процесса споран-гиоспоры все еще образуют плотную группу, повторяющую округлую форму зрелого спорангия (Рис. 1 и). Скульптура поверхности зрелых спорангиев мелкозернистая, что характерно для зрелых клеток вегетативного мицелия, спорангиев и спорангиеносцев. Форма зрелых спорангиоспор округлая (3,0-5,0 мкм) либо эллипсоидальная (3,8-5,0х 2,5-4,4 мкм). Вне спорангиев умеренное количество одиночных или собранных в небольшие группы зрелых спорангио-спор можно было наблюдать на поверхности питательной среды и клеток вегетативного мицелия. Отметим, что до наших исследований общепринятым было считать наличие у данного вида зрелых спорангиоспор с гладкой поверхностью [10]. Ранее на примере культуры Lichtheim-ia spp. [11] было также показано наличие мелкозернистой скульптуры поверхности зрелых спо-рангиоспор данного вида.
Процессы старения в пределах колонии имеют центробежную направленность и асинхронный характер в пределах отдельно взятой гифы. В этот период содержимое клеток опустошается, оболочка клеток гиф сильно деформируется, большая часть элементов скульптуры лизирует. Стенка колумеллы после освобождения спорангия от спорангиоспор также сильно деформируется, теряет присущую ей форму.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
РУЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сканирующая электронная микроскопия клеток культур L. corymbifera.
Рис.1. Особенности строения разных типов клеток культуры 1-. оогутЬ^егэ в СЭМ. Условные обозначения здесь и на рисунке 2: Гф - гифа(ы); Сп - спопанигий(и); Сс - спорангиоспоры.
Сгг^
Гф
у гт
7к\А Х130 100|лп 1044 23-8ЕР-19
< ;/
А -
а
Сканирующая электронная микроскопия клеток культур R. arrhizus.
На малых увеличениях СЭМ видно (Рис. 2 а), что спорангии (до 1500 мкм в длину и 18 мкм в ширину) простые или разветвленные, располагаются в группах по два либо более, либо одиночно (Рис. 2 б). Спорангии сферической формы, часто с несколько уплощённым основанием (Рис. 2 в, стрелка). В молодых спорангиях поверхность спорангиеносцев гладкая (Рис. 2 а, стрелка), а в зрелых - в виде неглубоких продольных дискретных складок (Рис. 2 е). Поверх-
ность зрелых спорангиев слегка шероховатая (Рис. 2 а-в, д). Оболочка зрелых спорангиев со временем лизирует, оголяя зрелые споран-гиоспоры. Последние эллипсоидальные (6-8 х 45 мкм, Рис. 2 е), с невысокими продольными протяженными «полосами» разной ширины, протяженности и глубины. Аналогичное строение было показано для данного вида и другими исследователями [10, 12 и др.]. Формирование элементов слоя орнаментации спорангиоспор происходит асинхронно после их освобождения из спорангия.
Поверхность клеточных стенок молодых (2 ж, з, стрелка) и зрелых гиф (Рис. 2 з, головки стрелок) вегетативного мицелия R. arrhizus анализируемой культуры гладкая. С возрастом гифы мицелия теряют присущую им форму, их клеточные стенки сильно деформируются, на их поверхности появляются поперечные складки разной глубины и протяженности. В пределах одной гифы процесс старения протекает асинхронно, что характерно и для других видов ми-целиальных грибов [13, 14].
спорангиев и спорангиоспор L. corymbifera в условиях культуры характерно наличие мелкозернистой скульптуры поверхности.
3. Поверхность клеточных стенок споран-гиеносцев молодых спорангиев и клеток вегетативного мицелия R. arrhizus гладкая, тогда как с возрастом становится поперечно-складчатой.
4. Формирование элементов слоя орнаментации спорангиоспор L. corymbifera и К arrhizus проходит асинхронно после их освобождения из спорангия.
5. По данным СЭМ, процессы старения в пределах одной гифы у изученных видов протекают асинхронно.
Данная работа выполнена в рамках Госзадания «Изучение морфо-биологических особенностей мукоромицетов-возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитом» (2019-2021).
ВЫВОДЫ
1. Для культур изученного штамма L. corymbifera характерно умеренно выраженное асинхронное спороношение. Формирование спорангионосцев и спорангиев происходит асинхронно.
2. Согласно данным СЭМ, для зрелых клеток вегетативного мицелия, спорангиеносцев,
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Степанова А.А., Богомолова Т.С. и др. Цитологическое изучение Lichtheimia corym-bifera in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2G19; 21 (3): 3-8. [Vasilyeva N.V., Stepanova A.A., Bo-gomolova T.S., et al. Cytological investigation of Lichtheimia corymbifera in vitro. Problems in Medical Mycology. 2G19; 21 (3): 3-8 (In Russ)].
2. Васильева Н.В., Степанова А.А., Богомолова Т.С. и др. Цитологическое изучение возбудителя муко-ромикоза Lichtheimia corymbifera in vivo. Проблемы медицинской микологии. 2G19; 21 (4): 3-7. [Vasilyeva N.V., Stepanova A.A., Bogomolova T.S., et al. Cytological study of the causative agent of mucormycosis Lichtheimia corymbifera in vivo. Problems in Medical Mycology. 2G19; 21 (4): 3-7 (In Russ)]. DOI:lG.244l2/l999-678G-2Gl9-4-3 -7
3. Adler D.E., Milhorat T.H., Miller J.I. Treatment of rhinocerebral mucormycosis with intravenous, interstitial, and cerebrospinal fluid administration of amphotericin B: case report. Neurosurgery. 1998; 42: 644-649. doi.org/lG.lG97/GGGG6l23-l998G3GGG-GGG37
4. Albízuri-Prado M.F., Sánchez-Orta A., Rodríguez-Bandera A., Feito-Rodríguez M. Primary œtaneous мucormycosis due to Rhizopus arrhizus in an 8-Year-Old Girl. Actas Dermosifiliogr. 2G18; 1G9 (6): 562-564. doi: lG.lGl6/j.ad.2Gl7.G7.G2G.
5. Winkler S., Susani S., Willinger B., et al. Gastric mucormycosis due to Rhizopus oryzae in a renal transplant recipient. J. Clin. Microbiol. 1966: 34: 2585-2587. doi.org/lG.ll28/JCM.34.lG.2585-2587.l996
6. Muhm M., Zuckermann A., Prokesch R., et al. Early onset of pulmonary mucormycosis with pulmonary vein thrombosis in a heart transplant recipient. Transplantation. 1996; 62: 1185-1187. doi.org/10.1097/00007890-199610270-00029
7. Williams J.C., SchnedA.R., Richardson J.R, et al. Fatal genitourinary mucormycosis in a patient with undiagnosed diabetes. Clin. Infect. Dis. 1995; 21: 682-684. doi.org/10.1093/clinids/21.3.682
8. da Cunha M.A., Nery A.F., Lima F.P., et al. Rhinocerebral zygomycosis in a diabetic patient. Revista da So-ciedade Brasileira de Medicina Tropical. 2011; 44 (2): 257-259. doi.org/10.1590/S0037-86822011000200027
9. Степанова А.А., Чилина Г.А., Баракаева Ф.Р. Сканирующая электронная микроскопия Aspergillus fu-migatus. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (4): 39-42. [Stepanova A.A., Chilina G.A., Barakaeva F.R. Scanning electron microscopy of Aspergillus fumigatus Fres. Problems in Medical Mycology. 2018; 20 (4): 39-42 (In Russ)].
10. de Hoog G.S., Guarro J., Gené J., et al. Atlas of clinical fungi (e-version). Westerdijk Institute / Universi-tat Rovira i Virgili, Utrecht / Reus. 2019. clinicalfungi.org/BioloMicsInfo.aspx
11. Степанова А.А., Хостелиди С.Н., Аравийский Р.А. и др. Электронно-микроскопическое исследование Lichtheimia spp. in vivo и in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (4): 55-61. [Stepanova А.А., Khostelidi S.N., Araviyskiy R.A., et al. Electron-microscopic investigations of Lichtheimia corymbifera in vivo and in vitro. Problems in Medical Mycology. 2012; 14 (4): 55-61 (In Russ)].
12. Soccol C.R., Marin B., Roussos S., Raimbault M. Scanning electron microscopy of the development of Rhi-zopus arrhizus on raw cassava by solid state fermentation. Mycol. Neotrop. 1993; 6: 27-39.
13. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктурные аспекты старения клеток некоторых видов рода Aspergillus. Проблемы медицинской микологии. 2009. 11 (4): 24-29. [Stepanova A.A., Sinitskaya I.A. Ultrastructural aspects of cells senescence of some Aspergillus spp. Problems in Medical Mycology. 2009; 11 (4): 24-29 (In Russ)].
14. Савицкая Т.И., Степанова А.А., Синицкая И.А., Краснова Е.В. Ультраструктурные аспекты старения клеток вегетативного мицелия некоторых видов рода Trichophyton. Проблемы медицинской микологии. 2011; 13 (2): 106. [Savitskaya T.I., Stepanova A.A., Sinitskaya I.A., Krasnova E.V. Ultrastructural aspects of senescence of the vegetetive mycelium cells of some Trichophyton species. Problems in Medical Mycology. 2011; 13 (2): 106 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала:17.01.2020 Рецензент: О.Д. Васильев
