CC BY
124
Системный подход к обеспечению качества мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для клинического применения
Н.К. Шахпазян 1, И.В. Кобзева 1, Т.А. Астрелина 12, М.В. Яковлева 1, ЕЮ. Осипова 2,
ЕВ. Скоробогатова 2
1 ГУЗ Банк стволовых клеток Департамента Здравоохранения, Москва
2 ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва
Systems approach to the guarantee of quality of mesenchymal stem cells of bone marrow for the clinical use
N.R. Shachpazyan 1,I.V. Kobzeva 1, T.A. Astrelina 12, M.V. Yakovleva 1, E.Y. Osipova 2, E.V. Skorobogatova 2
1 Stem Cell Bank, Moscow
2 Research Centre of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга (КМ) не только обеспечивают микроокружение для гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но способны к дифференцировке в остеогенном, адипогенном, хондро-генном и других направлениях. Известна роль МСК КМ в снижении выраженности и тяжести реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ). Целью исследования была оценка качества и биологической безопасности заготовленных МСК для клинического применения. Была проведена экспансия МСК 94 образцов КМ за период с 2007 г. по декабрь 2010 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» по медицинским технологиям, зарегистрированным в Роздравнадзоре. Полученные МСК КМ выдавались в нативном виде или подвергались криохранению в жидком азоте. Качество полученных МСК КМ оценивали с помощью бактериологического и вирусологического контроля; определяли жизнеспособность клеток с трипановым синим и окраской 7AAD; подтверждали иммунофенотип, характерный для клеток мезенхимального происхождения: CD73+; CD90+; CD105+; CD45-; CD34-; CD14-; CD133-; CD19-; HLA DR-. Биологическую безопасность МСК КМ оценивали методом кариотипирования метафазных хромосом и исследованием интерфазных хромосом X, Y, 6, 8, 11 методом FISH. Разработаны документы, регламентирующие этапы работы культивирования МСК КМ. Был заготовлен 71 образец МСК КМ (157 доз) и использован при трансплантации ГСК 23 пациентам (70 доз МСК) с целью приживления ГСК, профилактики или контроля РТПХ. В большинстве случаев котрансплантаця МСК проводилась в дозе 2 млн кл/кг. Острых реакций на введение МСК не было. Таким образом, оценка качества и безопасности МСК КМ, заготовленных в ГУЗ «БСК ДЗМ» для клинического применения, включала в себя строгое ведение документации по GMP стандартам, контроль количества клеток для достижения оптимальной дозы, бактериологический и вирусологический контроль, подтверждение мезенхимального происхождения МСК и оценку биологической безопасности.
Ключевые слова: банк стволовых клеток, мезенхимальные стволовые клетки, культивирование, качество материала, биологическая безопасность.
Mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) of bone marrow (BM) origin not only provide the supportive microenvironmental niche for hematopoietic stem cells (HSCs) but are also capable of differentiating into various cell types of mesenchymal origin, such as bone, fat, and cartilage. The role is known for bone marrow-derived MSCs in reducing the incidence and severity of graft-versus host disease (GVHD) during allogeneic transplantation. Purpose: to estimate quality and biological safety the MSC of bone marrow for the transplantation. Were analyzed data expansion MSC of 94 BM at the Stem Cell Bank of Moscow between 2007 and 2010 on the registered medical technologies. MSC were revealed in the native form or frozen in liquid nitrogen. Quality, MSC was evaluated with of the bacteriological and virusological control; determined the viability of cells with the trypan blue and 7AAD; markers that specifically identifies MSCs: CD73+; CD 90+; CD105+; CD45-; CD34-; CD14; CD133-; CD19-; HLA DR- by flow cytometry. The biological safety (karyotype) was analyzed by G-banding technique; 15-30 metaphase cells for each culture were analyzed. To analyze the level aneuploidy, fluorescent in situ hybridization (FISH) with chromosome enumeration probes (CEP) studies was performed. Are developed the documents, which regulate the stages of the work of expansion MSC of BM. Were prepared 71 MSC of BM (157 doses) and were used for allogeneic transplantation 23 to patients (70 doses MSC) for the purpose of adherence HSC, reducing the incidence and severity of GVHD. In the majority of the cases of transplantation MSC it was carried out at the dose of 2 x10B/kg. There were no acute reactions during the transplantation MSC BM. Thus, the estimation of quality and safety MSC of BM for allogeneic transplantation, included: a conducting of documentation on GMP to standards, inspection of a quantity of cells for achievement of optimum dose, bacteriological and virusological control, confirmation the markers that specifically identifies MSCs and the estimation of biological safety.
Key words: Key words: bank of stem cells, mesenchymal stem cell, culturing, material quality, biosafety.
Термин «стволовая клетка» введен в научный обиход в начале прошлого века русским гистологом А.А. Максимовым [1], сформулировавшим идею о наличии клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и способностью дифференцироваться в более «зрелые» клетки, которые составляют сотни клеточных типов, выделяемых у млекопитающих. Известен ряд стволовых клеток с разными на-
e-mail: [email protected]
правлениями дифференцировки, выявленных в различных тканях.
Во второй половине XX в. А.Я. Фриденштейном с соавт. (1970) [2] впервые было доказано существование в костном мозге стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток. Учитывая их способность дифференцироваться в рамках мезенхимальной линии в различных
направлениях, они получили название мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
Одним из основных источников МСК, предназначенных для клинического применения, служит костный мозг — аутогенный или аллогенный (донорский). МСК обладают способностью положительно влиять на репарационные характеристики различных тканей за счет высокого уровня пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке в зрелые мезенхимальные клетки (остеогенная, хондроген-ная, адипогенная, мышечная, периваскулярная и др. дифференцировка), обеспечивать микроокружение гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [3].
В последнее время наиболее активно МСК используются в лечении гематологических, иммунологических, наследственных заболеваний и др. в качестве котрансплантата ГСК. Спектр заболеваний, при которых применяется МСК в качестве котрансплан-таната, широк и включает в себя аплазию костного мозга, лейкозы, генетические заболевания, например, синдром Вискотта — Олдрича, Чедиака — Хигаси, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, мукополиса-харидоз первого типа и др. Применение МСК преследует две основные цели — облегчить приживление ГСК и предупредить развитие острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [4].
МСК в качестве котрансплантата формируют микроокружение для трансплантированных ГСК костного мозга или пуповинной крови. Микроокружение костного мозга представляет собой сложную трехмерную структуру, где ГСК пролиферируют, «созревают», мигрируют в синусоидальное пространство и выходят в циркуляцию регулируемым образом. Сами МСК и происходящие из них клетки стромы в микроокружении костного мозга обеспечивают подходящую среду для самообновления, пролиферации и дифференцировки ГСК. Микроокружение гемопоэ-тических клеток не только контролирует транспорт и хоуминг ГСК, но также обеспечивает межклеточные контакты и секретирует цитокины, которые поддерживают устойчивое состояние гемопоэза.
Вторым важнейшим клиническим применением МСК костного мозга является профилактика и коррекция острой и хронической РТПХ, возникающей при аллогенной трансплантации ГСК [5—7]. При РТПХ развивается комплекс иммунологических реакций, который приводит к утяжелению состояния здоровья пациента вплоть до летального исхода.
Известно, что аллогенные МСК не обладают иммуностимулирующими свойствами in vitro: они не индуцируют пролиферацию лимфоцитов и не являются мишенями для действия NK-клеток. Кроме того, in vitro исследования показали иммуносупрес-сивные свойства МСК в отношении цитотоксических Т-лимфоцитов, что делает их весьма привлекательным объектом с точки зрения иммунокоррегирующей терапии аутоиммунных реакций и реакций отторжения трансплантата [8—11].
Проведенные исследования продемонстрировали, что применение МСК обеспечивает поддержку полного приживления ГСК, а медиана выживаемости пациентов с трансплантированными МСК намного выше, чем в контрольной группе — без использования МСК [5, 6]. Хотя еще не получены неоспоримые доказательства того, что именно трансплантация МСК приводит к позитивной иммуномодуляции in vivo. Однако можно сделать вывод, что котрансплан-
тация МСК может быть практически безопасной при надлежащем контроле качества полученных клеток.
Иммуномодулирующее свойство МСК связывают с действием цитокинов и непосредственным влиянием на иммунокомпетентные клетки, они являются «клетками-дипломатами», регулирующими межклеточные взаимоотношения [7]. Такое свойство МСК служит основой для еще одной сферы их клинического применения — терапии аутоиммунных заболеваний (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, демиелинизирующие заболевания и др.).
Следует отметить, что спектр клинического применения МСК расширяется: имеются сообщения об использовании трансплантаций МСК с регенеративной целью в травматологии и ортопедии, существуют обнадеживающие экспериментальные данные, показывающие противоопухолевый эффект МСК, в том числе на солидные опухоли [12] и т.д.
Целью настоящего исследования явилась оценка качества и биологической безопасности заготовленных МСК костного мозга для клинического применения.
Материал и методы
В 2003 г. по распоряжению Правительства Москвы был создан государственный банк — Государственное учреждение здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «БСК ДЗМ»). На все виды деятельности ГУЗ «БСК ДЗМ» имеет лицензию на осуществление высокотехнологичной медицинской помощи, 15 зарегистрированных в Росздравнадзоре медицинских технологий. ГУЗ «БСК ДЗМ» оснащено современным оборудованием для выделения и криохранения стволовых клеток, соответствующего мировым стандартам безопасности и качества, имеет диагностические лаборатории.
Основным документом, регламентирующим деятельность банков пуповинной крови, является приказ МЗ РФ № 325 от 25 июля 2003 года «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации».
Образцы костного мозга собирались в отделении трансплантации костного мозга ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава и доставлялись в ГУЗ «БСК ДЗМ». За период с 2007 г. по декабрь 201 0 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» проводилось культивирование (экспансия) согласно зарегистрированным медицинским технологиям аутогенных, аллогенных и гаплоиден-тичных МСК 94 образцов костного мозга [13, 14].
Выдача образцов МСК для котрансплантации осуществлялась после получения запроса из трансплантационного отделения, выписки из истории болезни пациента, содержащей показания к применению МСК за подписью лечащего врача и руководителя учреждения, а также ряда документов, регламентирующих транспортировку и обоснование применения МСК у данного пациента. Единая форма запроса на выдачу МСК была разработана и принята к использованию в ГУЗ «БСК ДЗМ». Котрансплантация образцов МСК, выданных ГУЗ «БСК ДЗМ», проводилась в отделении трансплантации костного мозга ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава.
Известно, что терапевтический эффект образца МСК зависит от дозы, которая определяется количеством клеток на единицу массы тела пациента. Поэтому целью процесса культивирования МСК «ex vivo», осуществляемого в ГУЗ «БСК ДЗМ», было
добиться необходимого количества клеток для достижения оптимальной дозы МСК для пациента. Таким образом, на один образец было несколько доз.
При планировании клинического применения МСК доза подбиралась с учетом количества МСК на 1кг массы тела пациента. Культивирование МСК было регламентировано соответствующими документами, подготовленными в ГУЗ «БСК ДЗМ». Досье с информацией по каждому образцу, начиная от начала выделения и культивирования МСК до закладки на криохранение или выдачи дозы МСК в нативном виде, хранятся в ГУЗ «БСК ДЗМ», для чего разработаны и используются соответствующие формы документов и базы данных.
К образцу МСК, выданному для трансплантации прилагаются:
— информация об общем числе МСК в образце;
— данные, свидетельствующие о качестве и безопасности материала (результаты бактериального анализа, анализа метафазных хромосом (кариоти-пирование) и анализа частоты анеуплоидии);
— информация о любых отклонениях, возникших при сборе, обработке, хранении дозы МСК;
— протокол изъятия дозы МСК из криохранения в связи с передачей в трансплантационный центр, где содержится следующая информация: номер и штрих-код образца ПК, название трасплантационно-го центра, дата закладки и дата изъятия образца из криохранилища, личность курьера.
Транспортировка замороженного образца жестко регламентирована и осуществлялась в максимально сжатые сроки в течение 24—36 ч при температуре не выше -135°С с соблюдением норм пересылки контейнеров, содержащих жидкий азот. Транспортировка нативного образца осуществлялась в течение 2 ч непосредственно после выделения.
При условии использования образца МСК для клинических целей в ГУЗ «БСК ДЗМ» трансплантационным центром предоставлялась информация о клинических особенностях процедуры (наличие нежелательных проявлений, связанных с инфузи-ей МСК, если они были), данные о приживлении трансплантата, показателях химеризма. Полученные данные хранятся как на бумажных носителях, так и заносятся в электронную базу. Данные актуализируются по мере поступления новой информации.
Результаты и обсуждение
За период с 2007 по декабрь 2010 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» поступили для экспансии 94 образца костного мозга. При культивировании МСК костного мозга было отбраковано 3 образца (3,2%) по бактериальной контаминации; 3 образца (3,2%) по техническим причинам; 17 образцов (18,1%) из-за отсутствия роста в культуре. Таким образом, в ГУЗ «БСК ДЗМ» был заготовлен 71 образец МСК (157 доз) костного мозга.
Полученные образцы МСК были использованы для клинического применения 23 пациентам (70 доз) при котрансплантации с ГСК. Гендерный состав группы был следующий: 13 мальчиков и 10 девочек — медиана возраста составила 7 лет (от 1 года до 18 лет). Все образцы прошли бактериологический и вирусологический контроль. При выявлении положительных результатов образцы были отбракованы.
Иммунофенотипирование МСК проводилось до культивирования и перед выдачей или закладкой на
криохранение. Иммунофенотипирование было проведено у 4ї образца МСК. По данным иммунофеноти-пирования, выданные для клинического применения дозы МСК имели характеристики, свойственные клеткам мезенхимального происхождения: CD73 + ; CD90 + ; CD^5 + ; CD45—; CD34—; CDM—; CD^—; CD^—; HLA DR—.
Жизнеспособность полученных МСК исследовалась окрашиванием трипановым синим (жизнеспособность клеток составляла не менее 95%) и окраской 7AAD.
40 образцов МСК прошли кариологический контроль на 4—5 пассаже и 9—ї0 пассаже с целью обнаружения потенциально опасных для пациентов генетических отклонений в трансплантируемом материале путем анализа частоты анеуплоидии. Анализ частоты анеуплоидии проводился методом кариоти-пирования метафазных хромосом и исследования интерфазных хромосом X, Y, 6, B, її FISH методом. В двух культурах МСК были обнаружены клоны анеу-плоидных клеток. В одной культуре — с трисомией по хромосоме B, в другом случае в культуре МСК, выделенной из костного мозга здоровой женщины, был выявлен клон клеток, несущих одну половую Х хромосому. На четвертом пассаже обнаружили ї2%, а к десятому пассажу количество анеуплоидных клеток увеличилось до 9ї%.
Таким образом, аномальные клоны были обнаружены на ранних пассажах и сохранялись до поздних этапов культивирования. Источниками клонов могли быть аномальные клетки костного мозга здоровых доноров, для которых не был запущен механизм апоптоза in vivo, или же аберрантные клетки, возникшие in vitro в процессе выделения из костного мозга и на ранних этапах культивирования МСК.
Котрансплантация была проведена 2З пациентам при следующих заболеваниях: острый лимфобластный лейкоз — 4 (ї7%); острый бифенотипический лейкоз — ї (4%); ювенильный миело-моноцитарный лейкоз — ї (4%); синдром Фанкони — 4 (ї7%), апластическая анемия — З (їЗ%); адренолейкоди-строфия — ї (4%); синдром Вискотта — Олдрича — ї (4%); тяжелый комбинированный иммуннодефицит
— ї (4%); лимфогистиоцитоз — 2 (9%); хронический миелолейкоз — ї (4%); миелодиспластический синдром — З (їЗ%); остеопетроз — ї (4%).
Показаниями для котрансплантации МСК являлись: трансплантация ГСК (создание условий для приживления ГСК, профилактика РТПХ) — її (48%); хроническая РТПХ — 2 (9%); острая РТПХ — 9 (З9%); гипофункция трансплантированных ГСК — ї (4%).
Таким образом, всего было проведено котран-сплантаций 70 доз МСК 2З пациентам. Во всех случаях пациентам были котрансплантированы МСК, выращенные из аллогенного донорского костного мозга, причем в 5 случаях (7,ї%) применения МСК использовались клетки, полученные от родственных доноров (родители, сибсы). ї2 пациентам (52%) котрансплантация проведена однократно, 4 пациентам (ї7%) — двукратно, 2 пациентам (9%) — трехкратно, 2 больным (9%) МСК котрансплантиро-вались 4 раза, ї пациенту (4%) — 6 раз; ї пациенту (4%) — 8 раз и 2 пациентам (9%) — її раз. В 62 случаях (88,6%) котрансплантаця МСК проводилось в дозе 2 млн кл/кг, в 5 случаях (7,ї%) МСК трансплантированы в дозе їмлн кл/кг, в ї случае (ї,4%) 0,8 млн кл/кг и в ї случае (ї,4%) 5,6 млн кл/кг.
На введение МСК не было отмечено острых реакций (острые реакции, развившиеся в течение трансфузии, или в течение 1—2 ч после нее — фебрильные, в т.ч. инфекционные, токсические, аллергические, острое поражение легких).
Определение донорского химеризма проводили для оценки приживления МСК костного мозга у пациентов на разных сроках наблюдения (от +26 дня до +302 дня) после аллогенной трансплантации ГСК у 18 пациентов. Использовали следующие праймеры: D3S4545, FXYTETRO, D7S1843, VWA, VNTR1+VNTR2, 17DUP4+17DUP5, D3S1358. Было выявлено, что у 16 больных (89%) при трансплантации ГСК отмечался 98% реципиентский химеризм МСК костного мозга вне зависимости от основного диагноза, режима кондиционирования, источника используемого трансплантата, объема трансплантата, качественного его состава (содержание нуклеарных и CD34+ клеток), времени, прошедшего после проведения трансплантации, и тяжести клинического состояния. У 2 детей (11%) с диагнозом ОМЛ отмечался временный донорский химеризм МСК костного мозга. У 1 ребенка донорский химеризм на 52-й день составлял 27 % и резко снизился к 58 дню до 6%. У другого ребенка на 33-й день химеризм МСК составлял 24% и более плавно снизился к 81-му дню на 17%.
Следует отметить, что в литературе описаны способы получения МСК из костного мозга без культивирования, на основе метода селекции по маркерам CD105; CD271 и STRO-1 [15—18]. По данным авторов метод обладает рядом преимуществ, таких как быстрота получения МСК, снижение риска микробной контаминации, контаминации ксеногенными белками (сыворотка животных и заменители), высокая «чистота» популяции по данным иммунофено-типирования.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Аничков Н.М., Константинов И.Э. А.А. Максимов: к 100-летию Унитарной теории кроветворения. Архив Патологии 2007; 69(5): 3-7.
2. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибро-бластоподобных клетках в культурах кроветворных тканей морских свинок. Цитология 1970; 12: 1147-55.
3. Владимирская Е.Б. Стромальное микроокружение кроветворного костного мозга: состав и функция. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2006; 5(4): 29-32.
4. Kebriaei P., Robinson S. Treatment of graft-versus-host-disease with mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2011; 13(3): 262-8.
5. Kidd S., Caldwell L., Dietrich M. et.al. Mesenchymal stromal cells alone or expressing interferon-beta suppress pancreatic tumors in vivo, an effect countered by anti-inflammatory treatment. Cytotherapy 2010; 12(5): 615-25.
6. Gieseke F., Bohringer J., Bussolari R. et.al. Human multipotent mesenchymal stromal cells use galectin-1 to inhibit immune effector cells. Blood 2010; 116(19): 3770-9.
7. Jorgensen C. Mesenchymal stem cells in arthritis: role of bone marrow microenvironment. Arthritis Res. Ther. 2010; 12(4): 135.
8. Aldinucci A., Rizzetto L., Pieri L. et.al. Inhibition of immune synapse by altered dendritic cell actin distribution: a new pathway of mesenchymal stem cell immune regulation. J. Immunol. 2010; 185(9): 5102-10.
9. Григорян А.С. Трансплантация мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток для лечения реакции «трансплантант против хозяина». Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 3 (5): 31-2.
10. Ringden O., Uzunel M., Rasmusson I. et.al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease.
Исходя из опыта ГУЗ «БСК ДЗМ» следует отметить, что выделение МСК из костного мозга методом культивирования обладает рядом преимуществ, которые позволяют ему сохранять свои позиции главного источника МСК для клинического применения. Одно из самых существенных преимуществ состоит в том, что метод культивирования позволяет получить необходимую дозу клеток для достижения максимального терапевтического эффекта, что осуществлялось в лаборатории культуральных исследований ГУЗ «БСК ДЗМ». Второй существенный положительный момент, использованый в ГУЗ «БСК ДЗМ», заключается в возможности культивирования клеток до Ю-го пассажа и исследования клеток на предмет биологической безопасности на генетические отклонения, которые в противном случае могут проявиться in vivo. Что касается микробной контаминации и иммунофенотипической «чистоты» популяции, то при надлежащем контроле качества выдаваемых образцов МСК, проводимом в ГУЗ «БСК ДЗМ», можно добиться получения бактериологически и вирусологически безопасного и качественного материала МСК.
Таким образом, МСК обладают рядом уникальных особенностей, которые обуславливают их применение в клинике: способность поддерживать гемопоэз, облегчая приживление ГСК; иммуномодулирющее действие, в том числе в отношении РТПХ; способность дифференцироваться в различные типы мезенхимальных клеток и, наконец, отсутствие экспрессии антигенов MHC II класса позволяет широко внедрить аллогенные трансплантации МСК. Развитие современных методов контроля качества выдаваемых образцов МСК позволяет исключить использование некачественного и биологически опасного материала для улучшения непосредственного эффекта клинического применения.
Transplantation 2006; 81(10): 1390-7.
11. Zhu F., Guo G.H., Chen W. et.al. Effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplantation on the inflammatory response and lung injury in rabbit with inhalation injury. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2010; 26(5): 360-5.
12. Baird K., Cooke K., Schultz K.R., Chronic graft-versus-host disease (GVHD) in children. Pediatr. Clin. North Am. 2010; 57(1): 297-322.
13. Яковлева М.В., Астрелина Т.А., Осипова Е.Ю. и др. Экспансия ex vivo мезенхимальных стволовых клеток. Медицинская технология от 13.10.2010; ФС №2010/374.
14. Яковлева М.В., Астрелина Т.А., Осипова Е.Ю. и др. Определение иммунофенотипа мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека при экспансии ex vivo. Медицинская технология от 15.09.10; ФС №2010/332.
15. Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P. et al. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells. J. Cell Physiol. 2000; 185:198106.
16. Goussetis E., Spiropoulos A. Theodosaki M. et al. Culture of bone marrow CD105+ cells allows rapid selection of pure BM-stromal cells for chimerism studies in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2005; 36: 557-9.
17. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. Blood 1995; 85:4
18. Gronthos S, Zannettino A.C., Hay S.J. et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J. Cell Sci. 2003; 116:1827-35.
Поступила 29.03.2011
