CC BY
22
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
ВЛИЯНИЕ АГОНИСТА ОБЩЕЙ р-РЕЦЕПТОРНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ (^R) РЕЦЕПТОРА ЭРИТРОПОЭТИНА НА ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ МЫШЕЙ С57BL/6
Щелчкова Н.А.1, 2, Ермин К.В.1, 2, Логинов П.А.1, Глявина М.М.1' 2, Жученко М.3, Мухина И.В.1 2
1 Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, Нижний Новгород, Россия
2 Нижегородский университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия
3 ООО «Фармапарк», Москва, Россия
Благодаря ряду исследований в области тканепротек-ции, собрана сумма доказательств, позволяющих рассматривать общую Р-рецепторную субъединицу (PсR) рецептора грануляцитарно-макрофагального фактора роста, рецептора интерлейкина-3 и рецептора интерлейкина-5 и мономерную форму рецептора эритропоэтина (EPOR) как части гетеромерного рецепторного комплекса, запускающего каскад молекулярных событий, приводящий к цитопротективным эффектам в ряде тканей. С другой стороны, в разных клеточных типах, экспрессирующих указанные молекулы, сигнальный каскад и его последствия могут различаться. В связи с обнаружением слабой экспрессии EPOR на поверхности лимфоцитов возникает вопрос об участии рецепторного комплекса EPOR^R в иммуномодуляторных механизмах.
Цель. Изучить влияние агониста негематопоэтиче-ской формы рецептора EPOR (EPOR-PсR) на основе ре-комбинантного человеческого эритропоэтина на иммунологические показатели крови мышей линии C57BL/6 в динамике.
Исследования проводились на мышах линии C57BL/6. Мышам пятикратно вводили внутривенно раствор реком-бинантного полипептида «карбамилированный дарбэпоэ-тин (CdEPO) (ООО«Фармапарк», Россия) в течение 24 ч в дозе 50 мкг/кг. В качестве контрольной группы использовали интактных животных (n = 8). Иммунограммы животных оценивали на 4, 10, 20 дни после введения препарата (n = 5 в каждой точке). Анализ проводили на цитофлюориметре FACS Canto II (BD Biosciences). Гейтирование популяции лимфоцитов проводилось по графику CD45 PerCP/SSC с последующим выделением гейта для NK-клеток (NK1.1+), для В-лимфоцитов (CD3-CD19+), субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток (CD3+CD4+ и CD3+CD8+), субпопуляции активированных B-лимфоцитов (CD19+CD25+) и активированных T-лимфоцитов (CD3+CD25+) на соответствующих графиках. Данные представлены как арифметические средние значения и стандартная ошибка среднего. Данные представлены как арифметические средние значения и стандартная ошибка среднего. Для оценки статистической значимости различий между контрольной и опытными группами использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим применением критерия Тьюке и критерия Даннетта. Различия признавались значимыми при р < 0,05.
В ходе исследования на 4-е сутки после введения животным CdEPO отмечалась тенденция роста доли активированных В-лимфоцитов (10,28±1,51%) в общей популяции В-лимфоцитов в крови относительно контрольного значения (5,8±0,57%). Эта тенденция сохранялась в последующих временных точках, на 20 сутки различия становились статистически значимыми (12,28±0,30%; p = 0,0096). Доли NK-клеток (3,65±0,3%) и активирован-
ных Т-лимфоцитов (3,24±0,22%) не претерпевали выраженных изменений (контрольные значения 5,85±0,55% и 3,73±0,5% соответственно).
На 10-е сутки было отмечено статистически значимое нарастание показателя пула NK-клеток (10,03±0,90%) и увеличение относительного содержания активированных Т-лимфоцитов (5,36±0,47%) в сравнении с контролем (p = 0,035 и 0,066) и четвёртыми сутками после введения (p = 0,035 и 0,047). Значения обоих показателей сохранялись более высокими и в конечной фазе исследования (20 суток): доля CD25+Т-лимфоцитов (5,16±0,58%) и NK-клеток (9,09±1,77%).
Доля B- и T-лимфоцитов в лимфоцитарной фракции, соотношение Т-киллеров и T-хелперов колебались в пределах диапазона статистической значимости.
Таким образом, можно предполагать, что введение специфичного агониста рецепторного комплекса EPOR^R мышам линии C57BL/6 вызвало повышение доли NK-клеток в составе общей лимфоцитарной фракции на 10 сутки после введения. Также отмечается рост доли CD25+B-клеток, наиболее выраженный на 20 сутки эксперимента.
Следовательно, стимуляция негематопоэтической гетеромерной формы рецептора эритропоэтина обладает некоторым иммунотропным действием на клеточное звено иммунитета, модальности которого при различных условиях и состояниях организма требуют дальнейшего изучения.
СИСТЕМНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ В ДИНАМИКЕ ФТОРИСТОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Ядыкина Т.К., Михайлова Н.Н., Жукова А.Г., Горохова Л.Г., Казицкая А.С., Бугаева М.С.
ФГБНУ«Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний», Новокузнецк, Россия
Алюминиевая промышленность — одна из наиболее перспективных и быстроразвивающихся отраслей цветной металлургии, однако длительное воздействие на организм рабочих соединений фтора в условиях электролитической технологии производства алюминия, несет потенциальную опасность для здоровья, являясь определяющим фактором развития хронической фтористой интоксикации (ХФИ) — профессионального флюороза.
Изменение направленности высокоспецифичных иммунных реакций, обеспечивающих адаптацию организма к длительной нагрузке фторидами, изучено недостаточно. Открытыми остаются системные иммунологические аспекты течения флюороза. Повреждение печени при ХФИ имеет иммуннопосредованный характер, так как фторид-ион не обладает прямым цитопатическим действием на гепатоциты. Иммунное нарушение функциональной активности печени, индуцированное фтором, осуществляется посредством развития неспецифического хронического воспаления, обусловленного изменением иммунного статуса организма. Цель: изучить системные проявления механизмов иммунной защиты в динамике экспериментального флюороза.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на белых нелинейных крысах-самцах массой 200 г, разделённых на 2 группы: контроль (n = 20); опыт (n = 40), с ХФИ (свободный доступ крыс к раствору NaF в концентрации 10 мг/л в течение 12 недель). Для изучения иммунного статуса ис-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
следовали кровь из хвостовой вены через 1, 3 суток и 1, 3, 6, 9, 12 недель. Стандартными методами определяли: общее число лейкоцитов; цитокинов (TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10); уровень гаптоглобина (Нр), церулоплазмина (Ср); иммуноглобулинов (Ig) А, М, G; адренокортикотропный гормон (АКТГ). В отдельной серии забирали образцы печени для гистологического анализа тканей. Уровень HSP73 (heat shock protein 73), HOx-2 (heme oxygenase-2) в печени определяли вестерн-блоттингом. Данные обрабатывали в Statistica 6.0.
Результаты. Ранние сроки (1, 3 недели) эксперимента сопровождались активацией клеточного иммунитета (лейкоцитоз на фоне сниженного числа лимфоцитов и увеличенного — моноцитов) с последующим запуском цитоки-нового каскада (гиперпродукция TNFa на фоне снижения уровня противовоспалительных цитокинов [IL-4, IL-10]). Уровень IL-6, 8 сохранялся в физиологических пределах. Двукратное повышение содержания АКТГ уже на 3-и сутки эксперимента выполняет регулирующую роль в ранней индукции TNFa, повлекшей за собой активацию синтеза Ср в печени, что следует рассматривать как защитную реакцию организма, направленную на предупреждение «окислительного стресса». Пусковым механизмом, инициирующим формирование процессов клеточной адаптации, является скачок синтеза белка с защитной функцией HSP73 и повышение в 2 раза уровня HOx-2 в печени на фоне гиперфункции ее ретикулоэндотелиальной системы на 1-й неделе. Усиление фагоцитарной функции системы органоспецифических макрофагов — клеток Купфера с 3-й недели, свидетельствовало об активном их участии в организации иммунного ответа. Выявленное утолщение базальной мембраны капилляров, связано с накоплением в ней иммунных комплексов и Ig. Адаптивным признаком гиперфункции на данном сроке также являлось скопление белка в цитоплазме, обусловленное компенсаторной активацией внутридолькового кровотока в печени, о чем свидетельствовало расширение синусоидальных капилляров и увеличение их массы, что обеспечивало лабильность метаболизма клеток печени. На начальной стадии развития ХФИ данные механизмы выступают первой линией защиты организма, что подтверждалось и отсутствием изменений в гуморальном звене иммунитета. Уровень Ig сохранялся в пределах физиологической нормы до 6-й недели. С 6-й недели запускался воспалительный процесс, развитие которого подтверждалось полуторакратным повышением уровня нейтрофилов и индукцией синтеза I1-6 на фоне достоверно высокого значения TNFa, свидетельствуя о развитии системного воспалительного ответа. Снижение иммунной реактивности с 9-й недели подтверждалось достоверным снижением уровня Ig^ M, G; лейкопенией на фоне лимфоцитоза, высоким уровнем Нр, доминированием воспалительной реакции и необратимыми деструктивными изменениями в печени, сопровождающимися скоплением лейкоцитов в синусоидах и развитием некроза к 12-й неделе ХФИ.
Заключение. Экспериментальные исследования показали, что начальная (1-3 недели) ответная реакция организма на фтористую агрессию характеризуется компенсаторной реакцией печени, активацией клеточного звена иммунитета, индукцией синтеза цитокинов; защитных белков в гепатоцитах. Шестая неделя сопровождается снижением иммунной реактивности, приобретающей к 9-й неделе патологический характер, протекающий с нарушением баланса между регенерацией гепатоцитов и их локальным воспалением, обусловленным снижением иммунной защиты организма.
ИССЛЕДОВАНИЕ СТАНДАРТНОСТИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОПОЭТИНА НА НОРМОЦИТЕМИЧЕСКИХ МЫШАХ
Яковлев А.К., Алпатова Н.А., Постнова Е.Л., Симутенко Л.В., Батуашвили Т.А.
ФГБУ«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Введение. За последние два десятилетия препараты рчЭПО использованы более чем у миллиона пациентов, их применение устраняет анемический синдром, уменьшает потребность в гемотрансфузиях, снижает инфекционную заболеваемость, повышает качество жизни. Данные средства входят в «Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения». В РФ зарегистрировано 13 препаратов рчЭПО (6 отечественных и 7 зарубежных). Им-портозамещение в здравоохранении обострило вопросы повышения эффективности и безопасности лекарств. Отсутствие ОФС на эритропоэтин в ГФ РФ привело к различию в методиках определения качества препаратов у отечественных производителей, так как у препаратов рчЭПО, зарегистрированных в начале 1990-х гг., показатели качества и нормативные требования, отличаются от поступающих на регистрацию в настоящее время. По требованиям ЕФ основной показатель качества — специфическую активность определяют по стимуляции эри-тропоэза, у мышей линии B6D2F1, подсчитывая количество ретикулоцитов с помощью проточной цитометрии. Рассчитанная активность должна быть не менее 80 и не белее 125 %, доверительный интервал (Р = 0,95) — не менее 64 и не более 156%. В РФ определение проводят на линейных и беспородных мышах, подсчитывая ретику-лоциты с помощью проточной цитометрии и световой микроскопии. Требования к полученным результатам ограничиваются правильностью без учета их прецизионности, что влияет на точность. Условия, допускающие применение световой микроскопии, необходимы при разработке ОФС рчЭПО, гармонизированной с Европейской фармакопеей. Гармонизация с ЕФ позволит выйти на более высокий уровень контроля качества в соответствии с международными требованиями и повысит эффективность и безопасность лекарственных препаратов рчЭПО при клиническом применении.
Цель. Совершенствование и стандартизация методики определения специфической активности эритропоэ-тина для включения в ОФС ГФ РФ.
Задачи. 1) стандартизовать лабораторную модель определения активности эритропоэтина; 2) оценить правильность и прецизионность метода при подсчете ретикулоцитов проточной цитометрией и световой микроскопией; 3) изучить возможность гармонизации методик по показателям стандартности ЕФ.
Материалы и методы. Специфическую активность оценивали методом in vivo по стимуляции гемопоэза у мышей линий B6D2F1 и Balb/c, и беспородных в ответ на введение им в качестве испытуемого и стандартного образцов независимых разведений биологического ре-ференс препарата (BRP batch#3). Подсчет ретикулоцитов проводили на проточном цитофлуориметре (Navios, Beckman Coulter) и световом микроскопе (Axio Scope A1, Carl Zeiss). При выполнении работы учтены требования НД отечественных производителей и Европейской фар-
