CC BY
24УДК: 543.433:543.38:543.05
СИСТЕМАТИЧЕСКИЙ ТОКСИКОЛОГО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. АПРОБАЦИЯ МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
В статье рассмотрены примеры оптимизации разрабатываемого нового подхода к токси-колого-аналитическому скринингу при анализе биологических жидкостей пациентов с различными симптомами острого отравления. Используемая процедура включает: анализ методом газовой хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС) паровой фазы над образцом в режиме твердофазной микроэкстракции и обработанных дериватизирующими агентами экстрактов из крови и мочи, а также автоматическую интерпретацию полученных масс-хро-матограмм. Особенностями используемого подхода являются обнаружение в скрининге легколетучих соединений при парофазном анализе, а также оптимизированные методы дери-ватизации аналитов для повышения возможностей их идентификации без использования стандартных соединений. Ключевым моментом скрининга является совмещение высокой производительности за счет автоматизированной обработки и интерпретации результатов ГХ-МС анализа и надежности за счет снижения вероятности ошибок, как первого, так и второго рода.
Ключевые слова: токсикологический скрининг, ГХ-МС, твердофазная экстракция, дериватизация, биологические пробы.
А.И. Уколов, Е.С. Уколова, Е.И. Савельева, А.С. Радилов
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России
188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г. п. Кузьмоловский
Введение. Токсиколого-аналитический скрининг, в общем виде, - это аналитическая стратегия, предназначенная для детектирования и идентификации ксенобиотиков в биологических жидкостях, что необходимо для подтверждения диагноза при острых отравлениях экзогенными соединениями. Газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) является общепризнанным золотым стандартом при проведении скрининга [1-4]. Для определения ксенобиотика, послужившего причиной отравления, необходимы процедуры скрининга, покрывающие большинство значимых сильнодействующих препаратов и токсинов, и такие процедуры востребованы практикой в значительно большей мере, чем оптимизированные для определения одного класса токсинов [5].
В практике Лаборатории аналитической токсикологии
ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России часто возникают задачи анализа биологических проб заведомо неизвестного состава (см. например, [6]). Для этого необходимо использовать стандартизированную процедуру токсиколого-ана-литического скрининга, включающую полный цикл исследования биологических образцов, а именно подготовку пробы для хроматографического анализа, непосредственно сам анализ и методы интерпретации полученных данных. На данный момент отсутствуют общепризнанные, единые процедуры определения широкого спектра ксенобиотиков в биологических образцах.
В статье обсуждается метод скрининга биологических проб и описаны примеры применения разрабатываемого метода токсиколого-аналитического скрининга при анали-
Уколов Антон Игоревич (Ukolov Anton Igoeich), кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, AntonUkolov@gmail.com
Уколова Елена Сергеевна (Ukolova Elena Sergeevna), кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, LenaIvleva07@
Савельева Елена Игоревна (Savelieva Elena Igorevna), доктор химических наук, заведующий лабораторией аналитической токсикологии ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, ESavelieva59@mail.m Радилов Андрей Станиславович (Radilov Andpey Stanislavovich), доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом токсикологии, заместитель директора по научной работе ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, radilov@rihophe.m
зе биологических проб пациентов с различными симптомами острого отравления.
Материалы и методы исследования. На рисунках 1 и 2 приведены принципиальные схемы систематического токсикологического скрининга, которые были использованы при определении ксенобиотиков в образцах крови и мочи. Особенности и новизна используемого подхода обсуждаются далее.
Подготовка образцов крови для анализа
1. Сыворотку из цельной крови получали центрифугированием при 4000G в течение 15 минут, после чего отбирали верхний слой.
2. Так как в основном ксенобиотики не образуют конъ-югатов с глюкуроновой кислотой в крови, их гидролиз в сыворотке крови не требуется.
Подготовка образцов мочи для анализа
1. Гидролиз конъюгатов в образцах мочи проводили следующим образом: в хро-матографическую виалу объемом 15 мл, содержащую 4 мл мочи, добавляли 1 мл фосфатного буфера (pH 6,5) и 50 мкл ß-глюкуронидазы E.Coli, затем выдерживали при температуре 55°С в течение одного часа. Пробу охлаждали до комнатной температуры.
Экстракция целевых соединений из сыворотки и мочи
Пробы мочи (сыворотки) подкисляли 0.6 мл 6N HCl, добавляли 50 мг NaCl и обрабатывали 3 мл ацетонитри-ла в режиме экстракционного вымораживания (выдержка в течение одного часа в криотермостате при температуре -20°С). Верхний слой отделяли от замороженного водного остатка декантацией. Водный остаток размораживали и обрабатывали 2 мл диэтилового эфира. Затем водный остаток подщелачивали 1,2 мл 10% КОН и вновь последовательно обрабатывали ацетонитрилом и эфиром в режиме экстракционного вымораживания. Четыре органических экстракта объединяли, пропускали через воронку с 0,5 г безводного сульфата натрия и делили на 5 аликвотных частей. Каждую аликвотную часть упаривали в виале с коническим дном в токе азота досуха.
Дериватизация
Для получения производных в первую виалу прибавляли 50 мкл ^метил-^(триметилсилил)трифторацетамида
^1ика, кат. № 69479), во вторую - 50 мкл пиридина и 50 мкл уксусного ангидрида, в третью - 50 мкл метанола и 50 мкл йодистого метила ^1ика, кат. № 67692), в четвертую -50 мкл МБТФА (Sigma-Aldrich, кат. № М0789), в пятую - 50 мкл МТБСТФА ^та-АЫпЛ, кат. № 37593-4).
ГХ-МС анализ паровой фазы
В хроматографическую виалу объемом 4 мл вносили 1,0 мл крови или 3,0 мл мочи. Пробу термостатировали в течение 60 минут при 40°С при постоянном перемешивании. Отбор пробы производили на микроволокно 85 ит Carboxen/PDMS из равновесного пара в течение 60 минут при постоянном перемешивании пробы и при 40°С. Термодесорбцию сорбированных аналитов проводили в горячем инжекторе хроматографа в течение 1 минуты.
Газовый хроматограф - масс-спектрометр GCMS QP 2010 с капиллярной колонкой с неподвижной фазой HP1-MS 60 м х 0,25 мм х 0,25 мкм. Газохроматографическое разделение: температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (1,0 мин); температурная программа: начальная температура колонки 40°С (3 мин), скорость подъема температу-
Биопогический образец мочи
+ . +
ГХ-МС анализ паровой фазы 8 режиме твердофазной микроэкстракции [HS-SPME)
Разрушение коньюгатовс помощью ß-гпюкуронидазы
Жцдкость-жидкостная экстракция ацетонитрилом при pH 2 и pH 10
Дериватизация а на пито в в экстракте 1
сну
МСТФА
ГХ-МС
МБТФА
ГХ-МС
МТ5СТФА i
Ас,О
ГХ-МС 1
ГХ-МС
ГХ-МС
Рис. 2. Общая схема токсиколого-аналитического скрининга биологического образца мочи.
Оформление итогового отчета
ры 5°С/мин до 55°С, скорость подъема температуры 10°С/ мин, конечная температура колонки 220°С, выдержка при конечной температуре 20 мин; газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 см3/мин. Температура интерфейса 270°С.
Масс-спектрометрический анализ: энергия ионизирующих электронов 70 эВ, температура ионного источника 200°С, режим сканирования по полному ионному току, m/z 40-600.
ГХ-МС анализ экстрактов
Хромато-масс-спектрометр Shimadzu QP2010plus. Режим программирования температуры: от 70°С, подъем до 280°С со скоростью 10 градусов в минуту, выдержка при 280°С 30 минут, скорость потока газа-носителя 1 мл мин-1. Образец вводили в инжектор хроматографа без деления потока (split-less). Объем вводимой пробы 1 мкл. Условия регистрации масс-спектров: сканирование полного ионного тока в диапазоне m/z 40-600. Начало регистрации через 5 минут после ввода пробы.
Интерпретация результатов
Анализ полученных масс-хро-матограмм проводили в режиме автоматической интерпретации с помощью ПО AMDIS 2.66 [7] с подключенными библиотеками масс-спектров NIST08 [8,9], PMW [10], Wiley [11].
Для расчета газохроматогра-фических индексов удерживания были использованы н-алканы С -С44 (Supelco, кат № 500631). Индексы удерживания определяли в автоматическом режиме с помощью ПО AMDIS.
Результаты и обсуждение. Подготовка пробы к хромато-графическому анализу - важнейший этап скринингового исследования биологических образцов [12]. Он включает выделение целевой аналитической фракции, если необходимо, концентрирование, отделение белка [13-15], разрушение конъюгатов и/или дериватизацию аналитов и их метаболитов.
Отсутствие априорных сведений о природе определяемых веществ ограничивает возможности проведения селективной пробо-подготовки. Именно по этой причине классические методики, используемые для изолирования токсичных веществ и их метаболитов из биоматериала в химико-токсикологическом анализе (ХТА), не применимы в расширенном токсикологическом скрининге (general unknown). При проведении скрининга важно не потерять биомаркеры токсичных соединений на стадии пробоподготовки. Возможные потери могут быть обусловлены как неизвлечением этих веществ в исследуемую аналитическую фракцию, так и их разрушением под действием высоких температур или агрессивных сред. В ХТА преобладает практика разрушения конъюгатов путем быстрого кислотного гидролиза. Щелочной гидролиз проходит в более мягких условиях, однако только конъюгаты, содержащие сложноэфирные группы, могут быть гидролизованы в щелочной среде. При выборе метода гидролиза необходимо учитывать вероятность образования артефактов [16], кроме того, некоторые ксенобиотики разрушаются при кислотном гидролизе [17]. Исходя из этого для определения ксенобиотиков в биологических образцах заведомо неизвестного состава мы рекомендуем использовать энзиматический гидролиз с помощью Р-глюкуронидазы [18,19], выполняемый в мягких условиях.
Важнейшим этапом [20] скрининга биологических проб является изолирование целевых соединений, так как ме-
Автоматическая интерпретация данных в ПО AMDIS 2.66
тодом газовой хроматографии невозможен прямой анализ водных образцов. Наиболее распространенным методом выделения ксенобиотиков из водной фазы в органическую является жидкость-жидкостная экстракция [21-24]. Альтернативным методом является твердофазная экстракция (SPE) [25-27]. Автор классических работ в области расширенного токсикологического скрининга H. Maurer [28] отмечает, что SPE предпочтительна, если необходимо селективно извлечь целевые соединения из относительно гомогенных образцов, таких как сыворотка крови или моча в фармакокинетических исследованиях или при обнаружении известных аналитов. Универсальные жидкость-жидкостные процедуры предпочтительны для расширенного токсикологического скрининга, так как при этом соединения с разными физико-химическими свойствами должны быть выделены из гетерогенных матриц.
Используемый для жидкость-жидкостной экстракции растворитель должен извлекать максимальное количество ксенобиотиков из биообразца. Есть сообщения об использовании различных растворителей: диэтилового эфира, ацетонитрила, этилацетата, хлороформа и дихлормета-на в качестве экстрагентов (см. например, [29-31]), и даже 1-хлорбутана. Преимуществом использования хлорбутана является его меньшая по сравнению с водой плотность, и, следовательно, органический слой при экстракции оказывается верхним.
Большинство известных процедур скрининга покрывает только основные и нейтральные соединения, которые преобладают в ряду наиболее значимых токсикантов. Тем не менее, многие классы соединений кислотной природы, таких как кардиоваскулярные препараты, диуретики, кума-риновые антикоагулянты, барбитураты или нестероидные противовоспалительные препараты, метаболиты отравляющих веществ, образующиеся по гидролитическому пути, также должны обнаруживаться в рамках скрининговой процедуры. То же можно сказать и о летучих органических соединениях, которые теряются при концентрировании экстрактов или перекрываются на хроматограммах пиком растворителя Включение парофазного анализа биологических образцов методом твердофазной микроэкстракции в общую процедуру скрининга является отличительной особенностью нашего подхода.
Анализ паровой фазы в режиме твердофазной микроэкстракции позволяет проводить идентификацию токсикологически актуальных легколетучих соединений, (алкоголь, суррогаты алкоголя, технические жидкости). Основными преимуществами парофазного анализа являются: простота, малое время анализа, высокая чувствительность (в режиме твердофазной микроэкстракции), высокая точность, возможность автоматизации и отсутствие растворителей в аналитической процедуре, что позволяет минимизировать вторичное загрязнение пробы [32,33]. Анализ сконцентрированной паровой фазы является хорошей альтернативой прямому газохроматографическому анализу экстрактов (без дериватизации), поскольку, в отличие от последнего, не приводит к значительному загрязнению хроматографи-ческой системы.
В ходе скрининга мы использовали идентичные подходы
при анализе летучих и нелетучих органических соединений, что позволяет более надежно проводить идентификацию и систематизировать полученные результаты.
Экстракцию компонентов основной природы можно провести за счет добавления к биологическому образцу гидроксида натрия до pH 9-10. Подкисление образца раствором HCl позволяет извлекать соединения кислотного характера. Нейтральные соединения извлекаются в обоих случаях. В работе [22] предложено для сокращения времени анализа объединять кислые и щелочные экстракты, что подтверждается и нашим опытом.
Значительным преимуществом ГХ-МС является высокая воспроизводимость масс-спектров. Хорошие совпадения могут быть получены между спектрами, зарегистрированными на разных приборах в разных лабораториях и даже в составе разных образцов [34]. В библиотеке в NIST 08 содержится 200 000 спектров для 191 436 уникальных соединений [35]. Существуют библиотеки и большего объема. При составлении библиотек масс-спектров авторы собирали всю доступную информацию о соединениях, поэтому в общедоступных базах данных целевые соединения или их метаболиты приведены в виде различных производных, в связи с чем необходимо проводить дериватизацию образцов различными видами дериватизирующих агентов. Оптимальным, по нашему мнению, является перечень из пяти агентов (см. экспериментальную часть): N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамида (МСТФА), йодистого метила (CH3I), ^метил^-бис-трифторацетамида (МБТ-ФА), МТБСТФА и уксусного ангидрида.
Анализ полученных масс-хроматограмм проводится в режиме автоматической интерпретации с помощью ПО AM-DIS 2.66 с подключенными библиотеками масс-спектров NIST, PMW, Wiley. Режим идентификации и деконволюции выбран таким образом, чтобы почти всегда в отчете содержались ложно-положительные ответы, которые далее следует проверять «вручную». Это позволяет утверждать, что процедура позволяет минимизировать вероятность ложно-отрицательных ответов идентификации при содержании вещества в пробе выше предела обнаружения. Ручная проверка любого спектрального совпадения все равно необходима, несмотря на наличие автоматизированных систем библиотечного поиска и деконволюции [36, 37]. Следующим этапом является подтверждение идентификационной гипотезы анализом стандартного образца соединения или, если образец сравнения недоступен, требуется собрать дополнительные доказательства (identification points).
Таким образом, нами предложен метод, позволяющий проводить поиск летучих и нелетучих ксенобиотиков с различной полярностью и кислотно-основными свойствами в биологических образцах, учитывающий особенности методов автоматической идентификации и обращения к библиотекам масс-спектров большого объема.
Апробация метода
В качестве экспериментальной модели для апробации метода определения токсичных соединений в крови и моче, включающего рекомендации по подготовке к анализу, ГХ-МС анализу и интерпретации данных, использованы пробы мочи и крови пациентов токсикологической реанимации
Таблица
Результаты токсиколого-аналитического скрининга образцов биологических жидкостей пациентов
НИИ им. Джанелидзе
Номер Предполагаемая причина отравления Ксенобиотики, выявленные в биологических образцах
1 Отравление неустановленной смесью лекарств Этиловый спирт. Обнаружен методом Ж^РМЕ.
2 Отравление феназепамом Дифенилгидрамин (димедрол, ^№диметил-2-(дифенилметокси)-этиламин). Идентифицирован в нашвной форме, т.к. не вступает в реакции дериватизации. Толуол. Обнаружен в крови методом Ж^РМЕ, в моче пациента обнаружен его метаболит, п-крезол, идентифицирован в виде ТМС-эфира). При обнаружении в значительных количествах свидетельствует об отравлении техническими жидкостями.
3 Отравление анаприлином и донормилом Донормил (доксиламин, 2-[0Ь-(диметиламино)-этокси]-(Х-метилбензил]-пиридин). Идентифицирован в нативной форме, т.к. не вступает в реакции дериватизации. Фенобарбитал (5-Этил-5-фенил-2,4,6(1Н,3Н,5Н)-пиримидинтрион). Идентифицирован в виде ТМС-эфиров, ТБДМС-эфиров и диметиловых эфиров.
4 Отравление донормилом Ксенобиотиков не обнаружено
5 Нет данных Этиловый спирт. Обнаружен методом Ш^РМЕ. Амфетамин. Обнаружен в виде ТМС-эфира, трифторацетильного и ацетильного производного.
6 Отравление феназепамом Этиловый спирт. Обнаружен методом Ш^РМЕ.
7 Отравление гамма-оксибутиратом натрия (ГОМК) Диэтилтиокарбаминовой кислоты метиловый эфир (метил-ДТК) - активный метаболит дисульфирама, используемого в препаратах типа «Эспераль».
8 Отравление феназепамом Феназепам. Седативное средство. Обнаружен в нативном виде наряду с тремя его метаболитами: оксазепамом, темазепамом и нордазепамом.
9 Нет данных Корвалол (валидол и т.п.). Обнаружены фенобарбитал (см. п 3) и этиловый эфир 2-бромизовалериановой кислоты в количествах значительно превышающих терапевтические.
10 Отравление аминазином Аминазин (хлорпромазин, 2-хлор-10-[3-диметиламинопропил]фенотиазин). Нейролептик. Идентифицирован в нативной форме, т.к. не вступает в реакции дериватизации.
11 Отравление опиатами Карбпромал (адалин, №аминокарбонил)-2-бром-2-этилбутанамид. Снотворное средство. Обнаружен в виде ТМС- и ТБДМС-производных.
НИИ скорой помощи им. Джанелидзе. Пробы были отобраны медперсоналом отделения и доставлены в лабораторию аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ».
Результаты токсиколого-аналитического скрининга приведены в таблице. Наряду с результатами скрининга указаны предполагаемые причины отравления, выявленные в основном по результатам опроса пациентов.
Из таблицы 1 следует, что данные химико-токсикологического анализа, проведенного методом ГХ-МС, существенно дополняют и корректируют априорные сведения о причинах отравления. В рамках ГХ-МС скрининга весь объем итоговой информации мог бы быть получен и в отсутствие априорных сведений о причинах отравления, что свидетельствует об эффективности примененного методического подхода.
Заключение. Таким образом, показано, что разработанная методика подготовки проб, ГХ-МС анализа и автоматической идентификации позволяет проводить диагностику отравлений летучими и нелетучими органическими соединениями, включая лекарственные и наркотические вещества, а также проводить параллельное установление факта алкогольной интоксикации. Предложенный метод общего скрининга позволяет в рамках одной стандартной методики проводить определение соединений, относящихся к различным классам.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ/REFERENCES:
1. MaurerH.H. Position of chromatographic techniques in screening for detection of drugs or poisons in clinical and forensic toxicology and/or doping control // Clin. Chem. Lab. Med. 2004; V 42; 11: 1310-1324.
2. Maurer H.H. Hyphenated mass spectrometric techniques - indispensable tools in clinical and forensic toxicology and in doping control // J. Mass Spectrom. 2006; V. 41; 11: 1399-1413.
3. Maurer H.H., Pfleger K., Weber A.A. Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim, 2007.
4. Tracqui A., Kintz P., Mangin P. Systematic toxicological analysis using HPLC/DAD // J. Forensic Sci. 1995; V40; 2: 254-262.
5. Koppel C., Tenczer J. Scope and Limitations of a General Unknown Screening by Gas Chromatography-Mass Spectrometry in Acute Poisoning // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995; Vol. 6; 11: 995-1003.
6. А.И. Уколов, Г.В. Каракашев, Е.С. Уколова, Е.И. Савельева А.С. Радилов Систематический токсиколого-аналитический скрининг биологических образцов методом хроматомасс-спектрометрии. Примеры обнаружения диазепама, трамадола и прозерина // Масс-спектрометрия. 2013; Т. 10; 2: 120-129./ Ukolov AI., Karakashev G.V., Ukolova E.S., Savelieva E.I., Radilov AS Systematic toxicological screening of biological samples with GC-MS and HPLC-MS. Examples of deteimination of diazepam, tramadol and prozerine // Mass-spektrometriya. 2013; Vol. 10; 2: 120-129.
7. Stein S.E. An integrated method for spectrum extraction and compound identification from gas chromatography/ mass spectrometry data // J. Am. Soc. Mass Spec. 1999; 10: 770-781.
8. NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library [Электронный ресурс]. Software/Data Version (NIST 05, NIST 08) (CD-ROM).
9. NIST ChemistryWebBook [Электронный ресурс]. URL: http://webbook.nist.gov/ (accessed January 2012).
10. Maurer H., Pfleger K., Weber A. Mass-spectral library of drugs, poisons, pesticides, pollutants and their metabolites. 2007. CD-ROM.
11. Wiley RegistryTM of Mass-Spectral Data, 7th edition. CD-ROM.
12. Maurer H. H. Systematic toxicological analysis procedures for acidic drugs and/or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/or doping control // J. Chromatogr. B. 1999; 733: 3-25.
13. Kees F., Jehnich D., Grobecker H. Simultaneous determination of acetylsalicylic acid and salicylic acid in human plasma by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 1996; 677: 172-177.
14. Lillsunde P., Michelson L., Forsstrom T, Korte T. SchultzE, Ariniemi K et al Comprehensive drug screening in blood for detecting abused drugs or drugs potentially hazardous for traffic safety // Forensic Sci. Int. 1996; V 77; 3: 191-210.
15. Maurer H.H., in: Pfleger K., Maurer H.H., Weber A (Eds.) Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites,VCH,Weinheim, 1992; 3.
16. Maurer H.H., in: Pfleger K., Maurer H.H., Weber A (Eds.) Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, VCH, Weinheim, 1992; 3.
17. Hirai T, Matsumoto S., Kishi I. Simultaneous analysis of several non-steroidal anti-inflammatory drugs in human urine by high-performance liquid chromatography with normal solid-phase extraction // J. Chromatogr. B. 1997; V 692; 2: 375-388.
18. Spahn L.H., Benet L.Z. Acyl glucuronides revisited: is the glucuronidation process a toxification as well as a detoxification mechanism? // Drug Metab. Rev. 1992; V 24; 1: 5^7.
19. Toennes S.WH, Maurer H.H., in: Ferrara S.D. (Ed.), Proceeding of the XXXVth TIAFT Annual Meeting, Padova August 1997, Cleup Editrice, Padova, 1997, p. 227. S.WH. Toennes, H.H. Maurer, Clin.Chem. (1999) submitted.
20. Liquid Chromatography Applications. 2013. Ch. 10. Forensic Toxicology. P. 249-293.
21. Felgate D. Toxicology: initial testing. In: Wiley encyclopedia of forensic science.London: John Wiley & Sons, Ltd.; 2009.
22. Drummer O.H. Chromatographic screening techniques in systematic toxicological analysis // J. Chromatogr B. 1999; V. 733; 1-2: 27^5.
23. TraquiA Sample preparations for HPLC screening // J. Forensic Sci. 1994; 50: 254-262.
24. KovesE.M., Wells J. Evaluation of a photodiode array / HPLC-based system for the detection and quantitation of basic drugs in postmortem blood // J. Forensic Sci. 1992; Vol. 37; 1: 42-60.
25. Lai C.K., Lee T, Au KM, Chan A.YW Uniform solid-phase extraction procedure for toxicological drug screening in serum and urine by HPLC with photodiode-array detection // Clin Chem. 1997; Vol. 43; 2: 312-325.
26. Zhang Y, Xie W.P., Chen C.H., Lin L. Rapid screening for 61 central nervous system drugs in plasma using weak cation exchange solid-phase extraction and high performance liquid chromatography with diode array detection // African J Pharm. 2011; Vol. 5; 6: 706-720.
27. AlabdallaM.A. HPLC-DAD for analysis of different classes of drugs in plasma // J Clin Forensic Med. 2005; Vol. 12; 6: 310-315.
28. Maurer H.H. Systematic toxicological analysis of drugs and their metabolites by gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. 1992; V 580; 1-2: 3-4.
29. Pragst F, Herzler M., ErxlebenB.T. Systematic toxicological analysis by highperformance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) // Clin Chem Lab Med. 2004; Vol. 42; 11: 1325-1340.
30. Elliott S.P., Hale K.A Applications of an HPLC-DAD drug-screening system based on retention indices and UV spectra // J Anal Toxicol. 1998; Vol. 22; 4: 279-289.
31. Bogusz M., Erkens M Reversed-phase high-performance liquid chromatographic database of retention indices
and UV spectra of toxicologically relevant substances and its interlaboratory use // J Chromatogr A. 1994; 674: 97-126.
32. Koziowska K, PolkowskaI., Przyjazny A, Namiesnik J. Analytical Procedures Used in Examining Human Urine Samples // Pol. J. Environ. Stud. 2003; Vol. 12; 5: 503-521.
33. Jakubowska N, Henkelmann B., Schramm KW., Namiesnik J. Optimization of a Novel Procedure for Determination of VOCs in Water and Human Urine Samples Based on SBSE Coupled with TD-GC-HRMS // J. Chromatogr. Sci. 2009; 47: 689-693.
34. Maurer H.H. Hyphenated mass spectrometric techniques-indispensable tools in clinical and forensic toxicology and in doping control // J Mass Spectrom. 2006; 4: 1399-1413.
35. NIST Scientific and Technical Databases, NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (NIST 08) http://www.nist. gov/srd/ nist1.htm.
36. Stein S.E., Heller D.N. On the risk of false positive identification using multiple ion monitoring in qualitative mass spectromehy: large scale intercomparisons with a comprehensive mass spectral library // J Am Soc Mass Spec. 2006; 17: 823-885.
37. Aebi B., Berhnard W Advances in the use of mass spectral libraries for forensic toxicology // J Anal Toxicol. 2002; 26: 149-156.
A.I. Ukolov, E.S. Ukolova, E.I. Savelieva, A.S. Radilov
Systematic Toxicological Analytical Screening of Biomedical Samples by Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Validation by Identification of Toxic Organic Compounds
Federal State Unitary Enterprise «Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology», Federal Medical Biological Agency of Russia, g/p Kuzmolovsky, Vsevolozhsk District, Leningrad Region, Russian Federation
Examples of optimization are considered of a new approach to toxicological analytical screening of biological fluids in patients with various symptoms of acute intoxication. The procedure used includes head-space solid-phase micro extraction of vapor components over blood and urine samples and extracts of the samples treated with derivatizing agents, analyzed by chromatography-mass spectrometry (GCMS) and automated interpretation of resulting mass chromatograms. The developed approach features a combination of head-space analysis of volatile compounds and analysis of derivatized extracts. The use of different derivatizing agents favors a more reliable identification of volatile compounds without using reference compounds. The key advantage of the proposed screening procedure is that it combines high throughput due to automated processing and interpretation of GCMS data and reliability due to reduced probability of both first- and second-type mistakes.
Key words: biomedical samples, derivatization, GCMS, solid-phase extraction, toxicological screening.
Материал поступил в редакцию 26.12.2013 г
