CC BY
31
нии в 10 раз, причем наиболее активным оказался образец ЖД на штамме ТА98 со значениями ХуХ, 13,9 {СМ+) и 15,3 (СМ-), тогда как ВД-Д показала значение Хр/Х,, 6 (СМ+) и 8 (СМ-). Полученные данные свидетельствуют о том, что по отношению к тест-штамму ТА98 коптильная жидкость имела мутагенную активность средней силы, а пищевая добавка ВД-Д — слабой. Оба исследованных препарата проявили меньшее генотокси-ческое действие на штамме ТА100. При разведении в 15 раз мутагенная активность падает до уровня спонтанного фона мутирования. Результаты химического анализа органического экстракта, полученного из коптильной жидкости, показали присутствие БП в количестве 212,1 мкг/кг и БА — 160,5 мкг/кг. Это говорит о том, что коптильные среды также могут быть источником загрязнения копченых колбас.
Заключение
Таким образом, в нашем исследовании рассмотрены вопросы определения суммарной мутагенной активности образцов копченых колбас и некоторых пищевых добавок, а также произведена идентификация мутагенных соединений в рассмотренных образцах. Это является крайне важным в свете эпидемиологических данных об увеличивающемся количестве случаев раковых заболеваний легких, желудка, печени и кишечника, которые связывают с содержанием токсических соединений в окружающей среде, в частности в пищевых продуктах и воде. Поскольку человек в течение всей жизни употребляет продукты питания, вполне естественно, что именно посредством этого пути он испытывает хроническое токсическое влияние посторонних веществ в малых дозах, которые, как известно, являются более опасными из-за трудно прогнозируемого влияния на организм человека. Поэтому контроль за содержанием мутагенных соединений в продуктах питания бесспорно необходим, особенно с использованием сравнительно простых генетиче-
ских скрининговых методов по определению суммарной мутагенной активности продуктов питания без многостадийных химических анализов для выявления отдельных соединений. Обеспокоенность вызывает тотальное загрязнение всех исследованных образцов копченых колбас, которые проявляют мутагенные эффекты слабой и средней силы, что свидетельствует о потенциальной опасности употребления копченой продукции как таковой, и необходимости постоянного контроля при ее производстве с усовершенствованием технологических процессов.
Литература
1. Берлин А. Я. Техника лабораторной работы в органической химии. — М., 1952.
2. Древаль О. Ю., Павленко О. О. // МеханГзм регулювання економгки. - 2009. - № 2. — С. 19-23.
3. Дугой А. М., Журков В. С., Абилев С. К. // Цитол. и генетика. - 1990. - Т. 24. - С. 41-45.
4. Мезенова О. Я., Ким И. Н. Технология, экология и оценка качества копченых продуктов. — СПб., 2009
5. Соколовский В. В., Журков В. С., Рахманин Ю. А., Дуган А. М. Методические указания по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды. — М., 1990.
6. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella: Метод, указания / Фонштейн Л. М., Калинина Л. М., Полухина Г. Н. и др. — М., 1977.
7. Ткачова Д. Л., Дуган О. М. // Проблеми екологгчно! та ме-дичнок генетики V КлГнГчно) гмунологй: 36. наук, праць. Ки(в; Луганськ, 2009. - Вип. 9 (96). - С. 49-61.
8. Ткачова Д. Л., Дуган О. М. // Bich. Укр. товариства гене-тиктв та селекшонергв. — 2009. — Т. 7, № 2. — С. 249-256.
9. Хмельницкий Р. А. Хромато-масс-спектрометрия (методы аналитической химии). — М., 1984.
10. Nollei L. М. Handbook of food analysis. — New York, 2004.
Поступила 15.03.11
Отдаленные последствия генотоксического действия факторов окружающей и производственной среды
СЛ. Ф. КУРИЛО, 2011 УДК 614.7:616-013.1
Л. Ф. Курило
СИСТЕМА ТЕСТИРОВАНИЯ ФАКТОРОВ, ПОВРЕЖДАЮЩИХ ЖЕНСКИЕ И МУЖСКИЕ ГАМЕТЫ И ГОНАДЫ
Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Обсуждаются современные возможности тестирования гамето- и гонадотоксического эффекта различных повреждающих факторов, в том числе на основании результатов серий экспериментов (in vivo и in vitro) и клинических наблюдений автора с коллегами, разработки системы количественных критериев оценки эффекта. Приведены полученные автором данные о хронологии и динамике оо- и сперматогенеза у че,7овека.
Ключевые слова: тестирование, гаметотоксический эффект, яички, гонадотоксический эффект, мутации, ооге-нез, сперматогенез, яичники
L. F. Kurilo. - TESTING SYSTEM FOR FACTORS DAMAGING FEMALE AND MALE GAMETES AND GONADS
The paper discusses ¡he current possibilities of testing the gameto- and gonadotoxic effects of various damaging factors, including those based on the results of a series of in vivo and in vitro experiments and clinical obsen'ations by the author el al. It gives the authors' data on the chronological evaluation of and trends in human oogenesis and spermatogenesis.
Key words: testing, gametotoxic effect, testes, gonadotoxic effect, mutations, oogenesis, spermatogenesis, ovaries
Повышение уровня загрязнения среды обитания человека, бесконтрольное употребление лекарственных средств, биологических добавок и т. д. приводит к нарушению состояния здоровья, повышению риска поражения половых клеток. Очевидна необходимость разработки системы проведения тестирования факторов, повреждающих именно гонады и гаметы, так как через них эти воздействия могут отразиться на здоровье поколений |1-6, 8-13, 16, 18-24, 26, 27, 29—39, 48). Половая система как никакая другая система организма играет ключевую роль не только в осуществлении генетической непрерывности поколений, но и в обеспечении через гаметы репродуктивного здоровья потомства. Вопрос сбережения генетического ресурса страны — охраны половых клеток родителей — и через эти мероприятия вопрос сбережения репродуктивного здоровья поколений назрел и требует безотлагательного решения на государственном уровне. Правительством РФ принята концепция: демографической политики до 2015 г., в которой планируется решение проблемы воспроизводства населения РФ. Воздействия физических, химических или биологических факторов могут проявиться в виде мутагенного, гонадотропного, гаметотропного, эмбриотропного или канцерогенного эффектов [1 — 14, 16, 18— 20, 22, 23, 26, 27. 29-30, 34, 37, 39, 41-46). Действие таких факторов нарушает развитие организма, гонад и гамет, репродуктивную систему [9, 14, 18, 37, 43]. Облучение обоих родителей приводит к угнетению сперматогенеза у потомков трех поколений [20].
Методы тестирования гонадо- и гаметотропного эффекта повреждающих факторов и критерии их оценки
Методы оценки нарушений репродуктивной системы включают эпидемиологические, анатомические, гистологические, цитологические, цитогенетические и молекулярно-генетиче-ские исследования [1-4, 16, 17, 21, 24, 27, 29, 32-36, 47, 48]. В области промышленной гигиены созданы унифицированные методические указания по выявлению повреждающих воздействий. Разработаны рекомендации постадийного изучения формирования и функционирования и нарушения репродуктивной системы [4, 5, 21]. Критерии и методы оценки повреждающих воздействий многообразны [1—4, 11, 12, 21].
Научной группой по методологии оценки безопасности химических соединений (SGOMSEC), работающей под руководством Научного комитета по проблемам окружающей среды (SCOPE) и Международной программы по химической безопасности (IPCS), составлена таблица методов выявления повреждающего эффекта химических соединений на функцию репродуктивной системы млекопитающих [47].
Прежде всего внимание специалистов привлекают интегральные методы выявления нарушений репродукции у животных. К ним относят мультигенерационные исследования. Их проведение гарантирует получение сведений широкого спектра о репродуктивной функции: о гонадах, эстральном цикле, половом поведении, зачатии, имплантации, абортах, родоразре-шении, постнатальной выживаемости, лактации, материнском поведении, о периоде от рождения до отнятия от кормления материнским молоком, аномалиях эмбрио- и фетогенеза. Проводят анатомо-морфологический анализ репродуктивных органов. Данные собирают у одной генерации или более (оптимально — от трех), от одного помета на генерацию или более [21, 32, 47]. При такой схеме анализа действия химических соединений остаются в стороне процессы оплодотворения, эмбриогенеза, полового созревания. Необходимо подчеркнуть, что для таких важных периодов гаметогенеза, как дофолликулярный оогенез и сперматогенез до этапа спермиогенеза, не разработана система их тестирования, хотя эти процессы ключевые и наиболее чувствительны к повреждающим воздействиям [9, 14, 16. 18, 47]. Оставалось неясным, насколько информативны существующие методы анализа гамет (без анализа их состава по стадиям их дифференцировки на разных этапах онтогенеза) в норме и при различных воздействиях.
Одним из подходов является тест для определения индекса оплодотворения. При использовании теста на селективную эм-бриотоксичность выявляют врожденные пороки развития (ВПР), аборты, резорбцию эмбрионов и плодов, недостаточность их развития, соотношение полов в помете, раннюю или позднюю эмбриональную смертность.
Куршо Л. Ф. — д-р биол. наук, проф., зав. лаб. генетики нарушений репродукции ([email protected], ге-рго1аЬ@уапс!ех. ги)
Эпидемиологические исследования проводят тогда, когда популяции человека оказываются в контакте с потенциальным токсическим фактором. Эпидемиологические и клинические исследования охватывают все этапы репродуктивного процесса [47]. Эпидемиологические исследования выполняют на трех уровнях: 1) по имеющимся доступным источникам; 2) полномасштабное, с применением имеющихся в арсенале эпидемиологов методов; 3) долговременный анализ популяции. Помимо чисто эпидемиологических методов и критериев используют биологические индикаторы типа анализа хромосомных аберраций или регистрации показателей аномалий спермы (по результатам спермиологического анализа) (ВОЗ, 2010) [7, 8, 17, 29, 38, 471.
Разрабатывают подходы к выявлению нарушений гонадо- и гаметогенеза, овуляции; миграции гоноцитов или пролиферацию гониев, формирование пула примордиальных и/или растущих фолликулов, 1 -е и 2-е деления мейоза, разные стадии спермиогенеза. Прямыми методами анализа токсичности для гамет и гонад являются методы определения количества и состава мужских гамет на гистопрепаратах гонад. В клинических исследованиях для человека это возможно при семиологичсском анализе (информативность ограничена лишь анализом сперматозоидов) и на биоптатах яичка, получение которых может привести к развитию аутоиммунного процесса. Поэтому медицинские показания для получения биоптата яичка распространены лишь для случаев азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени. Получение биоптата яичника у человека для выяснения состояния резерва фолликулов обоснованно не допускается [18, 30, 34], поскольку резерв примордиальных фолликулов не восстанавливается [14, 18]. Для косвенной оценки состояния фолликулов яичников определяют уровень гормонов в сыворотке крови. Наличие полостных фолликулов выявляют посредством ультразвукового исследования (УЗИ), но разрешающая способность УЗИ не позволяет выявлять примордиальные фолликулы (резерв половых клеток) и первичные. О прохождении овуляции или ее отсутствии судят косвенно: по циклическим изменениям в цервикальной слизи и морфологии эндометрия, цитологии его желез и стромы; определяют уровень эстрогенов и прогестерона в моче или крови; анализируют температурные кривые; возможно использование ультразвуковой диагностики, лапароскопии и гистероскопии [47, 48].
Практически не разработаны методы выявления нарушения транспорта гамет, оплодотворения и имплантации [47]. Повреждающие эффекты факторов на постимплантационные процессы вплоть до рождения анализируют эпидемиологическими подходами. Сюда же относят критерии определения массы тела новорожденных и наличия у них ВПР и множественных ВПР (МВПР). В последние годы обобщают накапливающиеся данные по эхографии, трансабдоминальному мониторингу, амнио-центезу, рентгеноанализу [47].
Повреждающий эффект химических веществ в период рождение — лактация можно установить по факту контаминации грудного молока исследуемыми соединениями. Наиболее адекватными для оценки повреждающего фактора остаются эксперименты in vivo [26]. Для тестирования фактора, нарушающего генеративную функцию (в случае поражения гамет и гонад) и/или репродуктивную систему, используют экспериментальных животных и проводят анализы на двух—трех генерациях [6, 7, 16, 20, 26, 32, 47, 48]. Токсический эффект, выявленный на гаме-тогенезе грызунов, может обладать таким же действием и на гаметы приматов [30, 34]. Этот анализ возможен и на модели культуры гонад in vitro от материала медицинского прерывания беременности или на секционном материале, что поднимает этические и технические проблемы [14].
Нарушение этапов оогенеза, фолликулогенеза/овуляции изучают, начиная с половозрелого периода, по определенным маркерам клеток гранулезы, определяют массу и/или объем яичника в ответ на введение гонадотропинов. Альтернативными подходами являются анализ уровня эстрогенов, ФСГ и Л Г в сыворотке крови, массы матки, морфология эндометрия и др. Нарушение овуляции определяют методом сбора и подсчета количества овулировавших ооцитов у животных [47]. Атрезию фолликулов выявляют путем подсчета атретических фолликулов на серийных срезах яичников [14], что невозможно для человека. Для оценки эффекта на транспорт гамет, оплодотворение и имплантацию используют метод выявления доминантных мутаций на мышах [3].
Процесс имплантации анализируют: in vivo путем подсчета мест имплантации, определением промежутка времени между спариванием и имплантацией и степенью развития эмбриона; in vitro — по количеству клеток у каждого полученного эмбрио-
Схема гаметогенеза человека и млекопитающих животных (Курило Л.Ф., 1989)
1
с.
0
с
>s
2
1 о о
В, §
а §
X
со
Первичные половые клетки ¡гоноциты) -обособление в эпибласте, миграция в зачатки гонад, морфогенез гонад (во внутриутробный период)
Оогенез:
оогонии —» митоз
Сперматогенез:
сперматогонии типа А1, А2, A3, А4, промежуточные, В —► митоз
со
X
•5
■о
s
■з
"о
0
01 X
Е
Si
га •о
s
§
Первичные ооциты в 1-й профазе мейоза Первичные сперматоциты в 1-й профазе мейоза
Прелептотена —► лептотена —► зиготена —*■ пахитена —► диплотена
формирование примордиального фолликула вокруг ооцитов в диплотене
Диктиотена, фолликулогенез • (рост и созревание ооцита и фолликула, стадия кариосферы в ооците)
_I_
Диакинез в 1 -й профазе мейоза
Диакинез в 1 -й профазе мейоза
Метафаза I деления
созревания Вторичные ооциты
Метафаза II деления
созревания (при оплодотворении яйцеклетки)
Метафаза I деления созревания Вторичные сперматоциты
Метафаза II деления созревания
Сперматиды
Сперматозоиды
на относительно времени после экстракорпорального оплодотворения, степени дифферениировки эмбриона [47]. Для исследования воздействия на постимплантационный период — рождение перспективно проведение культивирования in vitro эмбрионов мыши или крысы.
Таким образом, рекомендуемые SGOMSEC 1 [47| методики достаточно полно отражают степень разработанности тестирования химических соединений, поражающих репродуктивную и генеративную функцию. Из критериев оценки, с помощью которых выявляют овариотропное действие повреждающего фактора на яичниках постнатального онтогенеза, рекомендовано определять размер или площадь яичников и характеристику состава фолликулов разного типа развития. В постнатальный период в яичниках млекопитающих ооциты 1 (первичные) находятся в диплотене (или вдиктиотене) 1-й профазы мейоза и заключены в разные типы фолликулов. Подавляющее большинство ооцитов I заключено в примордиальные фолликулы. Из пула последних в начале каждого цикла несколько приморди-альных фолликулов вступают в рост и созревание, становятся первичными и вторичными полостными, переходят в созревающие, из которых овулирует ооцит после первого деления мейоза (с выделением 1 полярного тельца). Анализ действия повреждающего фактора на гонаду в целом и на фолликулярный аппарат яичника сводится к количественному изучению состава фолликулов на разных стадиях их роста и созревания у половозрелых животных (с учетом фазы цикла) и на состояние пула примордиальных фолликулов, степень их дегенерации у неполовозрелых животных [14, 30]. Рекомендуют проводить подсчет
количества примордиальных фолликулов на серийно порезанных яичниках по всей поверхности каждого десятого среза. Затем подсчитанное количество умножают на 10 и получают общее количество примордиальных фолликулов на яичник. Многослойные бесполостные и полостные фолликулы, атретические и желтые тела подсчитывают на каждом пятом срезе и их количество умножают на 5. Планиметрическим методом определяют площадь соединительной ткани, что является показателем физиологически нормального или раннего старения органа, истощения резерва фолликулов [21, 24, 26, 42].
Степень нарушения морфологии и функционирования семенников (яичек для человека) в токсикологических исследованиях оценивают на собаках, крысах, приматах: определяют размер и массу гонад; проводят анализ спермы, биохимическое исследование уровня ферментов и гормонов в эякуляте [18, 38]. Гистологическое изучение семенников является одним из информативных [21, 26. 38, 41 ,42]. В литературе подчеркивают, что семенник и эпидидимис должны быть среди первых органов и тканей, требующих проверки при токсикологическом анализе [21, 41, 42]. Многие исследователи подчеркивают важную роль количественного анализа яичек, классификацию семенных трубочек по стадиям сперматогенеза, пролиферативной активности и атрофии половых клеток, взаимосвязи последних с клетками Сертоли, характеристики клеточных контактов, конъюгации хромосом в мейозе, двигательного комплекса сперматозоидов (аксонемы), акросомы и состояния хроматина (электронно-микро-скопические исследования), характеристики стадий сперматогенеза и причин остановки этого многостадийного и длительного процесса [2, 5, 12, 17,21,38,41].
Публикации результатов серий наших количественных исследований хронологии и динамики оо- и сперматогенеза во внутриутробный и постнатальный периоды у человека и некоторых видов животных, анализа повреждающего оогенез и сперматогенез воздействия химических, физических и биологических факторов на животных; разработка системы проведения тестирования и использования количественных критериев постадийной оценки (относительно хронологии гаметогенеза) гаметотоксического эффекта заполнили имевшийся в литературе пробел относительно возможностей выявления поражения различными факторами конкретных стадий развития гамет и гонад (см. схему, табл. 1—4) [5, 9, 14-18, 28].
Закономерности гаметогенеза
Развитие женских и мужских половых клеток у человека и млекопитающих животных протекает по универсальной схеме (см. схему): гоноциты — первичные половые клетки (ППК) формируются вне гонад и мигрируют из области эпибласта в энтодерму желточного мешка и затем в зачатки гонад. В гонадах эмбриона гоноциты преобразуются в гонии (оо- и сперматогонии, соответственно полу), которые путем многократных мито-тических делений формируют определенный резерв гамет [9, 14, 18].
Оогенез у млекопитающих. В яичниках человека и некоторых видов млекопитающих важные события оогенеза — конъюгация (в зиготене) и кроссинговер (в пахитене), формирование резерва ооцитов и заключение их (в диплотене) в примордиальные фолликулы — развиваются внутриутробно: после митотических делений оогонии переходят в ооциты 1, которые проходят стадии 1-й профазы мейоза: прелептотену, лептотену, зиготену, па-хитену, диплотену, диктиотену. Нами впервые определены (на большом количестве эмбрионов и плодов разных сроков развития человека и коровы) хронология и количественные соотно-
о
п п
■О
s
5
О
5
а
X
о
Таблица 1
Соотношение оогоннев н ооцитов I на разных стадиях 1-й профазы мейоза во внутриутробный период развития человека [14]
Возраст эмбрионов/плодов, нед Количество исследованных эмбрионов/плодов Количество, % Количество ооцитов 1 на разных стадиях профазы 1 мейоза, %
оогониев ооцитов I прелептотена лептотена зиготена пахитена диплотена диктиотена
6-7 15 92,8 ± 1,6 7.2 ± 1,2 7,2 ± 1,2
7,5-8 5 91,4 ± 1,5 8,6 ± 1.4 8,6 ± 1,4
8,5-10 12 84,7 ± 2,3 15,3 ± 2,4 15,3 ± 2,4
10,5-11 6 60,5 ± 7,4 39,5 + 6,4 39,0 ± 7,5
11,5-13 5 49,7 ± 4,2 50,3 ± 4.0 45,8 ± 8,6
14-17 6 29,8 ± 4,4 70,2 ± 4,1 31,4 ± 2,4
19-22 16 24,7 + 2.9 75,3 ± 3,3 28,5 ± 2,9
23-26 16 14,6 ± 1,6 85,4 ± 2,1 29,2 + 2,4
27-33 9 12,2 ± 3,5 87,8 ± 3,3 16,9 ± 4,0
35-40 7 8,2 ± 2,4 91,8 ± 1,9 3,9 ± 1,4
_ _ _ _
0,3 ± 0,2 0,1 ± 0,06 — — —
0,8 ± 0,06 2,3 ± 1,1 1,3 ± 0,8 0,09 ± 0,04 —
1,0 ± 0,2 18,9 ± 2,0 16,3 ± 2,7 2,4 ± 1,0 0,1 ± 0,03
1,7 ± 0,3 14,8 ± 1,9 18,5 ± 1,9 11,3 ± 2,0 0,6 ± 0,2
1,4 ± 0,2 17,7 ± 2,1 18,3 ± 2,0 16,4 ± 2,1 2,3 ± 0,4
0,5 ± 0,3 7,2 ± 1,2 10,0 ± 2,0 39,5 ± 4,2 13,5 ± 3,1
0,3 ± 0,18 5,0 ± 1,8 5,1 ± 1,8 62,5 ± 5,4 14,5 ± 4,2
шения оогониев и ооцитов 1 на каждой указанной выше стадии 1-й профазы мейоза на последовательных сроках внутриутробного развития (см. табл. 1), расширена информация по хронологии оогенеза у мыши и крысы. Нами установлено, что только на стадии диплотены ооциты 1 заключаются в примордиальные фолликулы, что начинается у плодов человека с 12 нед развития (см. табл. 2) [9, 14]. До момента перехода всех ооцитов в дип-лотену в яичниках плода популяция гамет на каждом сроке внутриутробного периода состоит из определенного количества гамет на нескольких соседних стадиях развития (у плодов человека). Прогрессия оогенеза есть функция времени и локализации половых клеток в корковом веществе яичника эмбриона и плода. Т. е. у разных видов млекопитающих состав женских гамет по стадиям их развития меняется по мере прохождения через сроки внутриутробного периода, отчасти этим объясняется различный гаметотоксический эффект, зависимый и от хронологии его действия относительно онтогенеза. Поэтому знание хронологии и динамики перехода женских половых клеток из одной стадии 1-й профазы мейоза в последующую и информация о количестве и составе ооцитов на определенных стадиях их развития в разные сроки внутриутробного периода онтогенеза для каждого вида позволяют планировать экспериментальные воздействия на определенные стадии гаметогенеза в определенный срок внутриутробного периода и оценивать его по конкретным последующим стадиям или в любом ином варианте в зависимости от поставленных задач исследования (см. табл. 1, 2). К 4-му месяцу у плода человека формируется пул половых клеток (2—4 млн), который далее в репродуктивный период женщины не пополняется, а расходуется. При нормально протекающей беременности у плода женского пола к рождению большинство ооцитов (в диплотене) заключено в примордиальные фолликулы (см. табл. 2). Далее развитие ооцитов и фолликулов (через первичные, вторичные полостные, созревающие, преовуляторные и зрелые) продолжается в половозрелом организме путем циклического вступления 10—15 фолликулов в рост и циклической овуляции созревших ооцитов [14, 18] до истощения резерва фолликулов, до наступления менопаузы.
Сперматогенез. Популяция мужских гамет начинает формироваться в плодный период [18, 28]. Полный цикл своего раз-
вития от стволового сперматогония до сперматозоида мужские гаметы проходят в половозрелом организме. Сперматогонии Б переходят в сперматоциты 1, проходят через 6 стадий 1-й профазы мейоза, вступают в метафазу 1, анафазу 1 и телофазу 1 мейоза с формированием сперматоцитов 2. Последние проходят метафазу 2, анафазу 2 и телофазу 2 мейоза и из одного сперма-тоцита 1 формируются 4 сперматиды, претерпевающие затем спермиогенез. Действие физических, химических и биологических факторов на гаметы и гонады могут оказывать как мутагенное действие, так и тератогенное, канцерогенное и цитоток-сическое. Это свидетельствует о необходимости разработки и использования методов и критериев оценки гонадо- и гамето-токсического эффекта факторов.
Проведенные нами исследования хронологии и динамики оогенеза и сперматогенеза на разных сроках внутриутробного развития человека и некоторых видов животных, количества и состава фолликулов в яичниках разных возрастных групп девочек и женщин (секционный материал) (см. табл. 3), сравнительные количественные исследования динамики фоллккулогенеза, а также эксперименты с повреждающими воздействиями свидетельствуют о возможности выявления гаметотоксических свойств факторов путем количественного анализа: пролиферации оогониев и сперматогониев, соотношения оогониев и ооцитов 1 на каждой стадии 1-й профазы мейоза (индекс оогониев, их пролиферации, индекс ооцитов в прелептотене, лептотене, зиготене, пахитене, диплотене, диктиотене, в метафазе 1, анафазе 1, телофазе 1, в метафазе 2, анафазе 2, телофазе 2), индекса сперматид, ооцитов в фолликулах на каждой стадии фоллику-логенеза, уровня дегенерации гамет в процессе их дифференци-ровки [14]. Для сравнения полученных количественных данных определены индексы контроля. Информация об отработке и использовании такого количественного метода тестирования га-метотоксического эффекта на последовательных стадиях развития гамет в литературе отсутствует [8, 21, 47, 48].
Для получения референсных значений по составу незрелых половых клеток (НПК) в эякуляте здоровых мужчин с нормальным кариотипом и спермограммой были использованы образцы эякулята 23 доноров спермы (см. табл. 4). Эти разработки по-
Таблица 2
Динамика формирования примордиальных фолликулов человека, их переход на следующие стадии развития [14]
Возраст эмбрионов/ плодов, нед
Количество исследованных эмбрионов/плодов
Ооциты в диплотене, не окруженные фолликулярными клетками
Примордиальные фолликулы
Первичные фолликулы
Вторичные фолликулы
6-7 15 — — — —
7,5-8 5 — — — —
8,5-10 12 — — — —
10,5-11 6 — — — —
11,5-13 5 48,4 ± 9,1 51,6 ± 9,1 — —
14-17 6 14,0 ± 2,8 84,7 ± 0,8 1,3 ± 0,9 —
19-22 16 2,4 ± 0,44 89,4 ± 0,9 8,2 ± 0,8 —
23-26 16 1,2 ± 0,29 72,6 ± 1,2 26,2 ± 1,2 0,21 ± 0,12
27-33 9 1,8 ± 0,32 68,0 ± 1,1 29,7 ± 1,1 0,46 ±0,15
35-40 7 1,0 ±0,29 69,0 ± 1,3 29,4 ± 1,3 0,49 ± 0,2
Таблица 3
Характеристика состава фолликулов в яичниках девочек и женщин разных возрастных групп (Курило Л. Ф., Схиртладзе 3. Ш., 1985)
Количество примор- Количество первич- Количество вторич- Количество зрелых фолликулов Количество атретиче-
Группа диальных фолликулов ных фолликулов в 1 ных полостных фол- ских, желтых и белых
в 1 поле зрения поле зрения ликулов тел
1-я — от 6 нед до 6 лет (л = 4) 20—60
2-я — от 9 до 13 лет (л = 7) 40
3-я — от 18 до 35 лет (л = 35) 5
4-я — от 36 до 55 лет (л = 22) 2
Единичные
0 0
10—11 на яичник Единичные
0 0
Единичные
0 0
Единичные
зволили провести серии исследований по тестированию гамето-и гонадотоксических факторов (см. табл. 4).
Кратко рассмотрим некоторые из большого количества исследований, свидетельствующих о нарушении развития женских и мужских гамет и гонад в целом при различных режимах действия факторов.
Ионизирующая радиация. Исследование состояния сперматогенеза, в том числе анализ состава по стадиям НПК из эякулята у 27 ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС позволило нам выявить блок сперматогенеза перед пахитеной профазы 1 мейоза, нарушение процесса конъюгации хромосом, снижение количества и подвижности сперматозоидов, повышение количества патологических форм спермиев (см. табл. 4) [18].
Установлено, что выживаемость ооцитов плодов крыс после облучения самок (от 13-х до 19-х суток беременности) зависит от дозы, длительности воздействия и возраста плода. На крысах показано, что пролонгированный генетический эффект облучения родителей проявляется не только в виде доминантных летальных мутаций, но и задержкой развития, генетической нестабильностью потомства [6, 7). Выявлено, что облучение крыс (обоих родителей в дозе 2—4 Гр) отражается на трех поколениях через нарушение внутриутробного или постнатального развития. Половозрелые самцы обоих облученных родителей были в более выраженной степени носителями пострадиационных наследственных нарушений, чем женское потомство [20]. Изучали влияние однократного общего облучения (в дозе 0,5 Гр) самцов крыс на сперматогенез их потомства при спаривании самцов-отцов через 2 нед после облучения, т. е. в оплодотворении участвовали сперматозоиды, произошедшие от облученных сперматид. У крыс П были снижены количество сперматозоидов в эякуляте, индекс сперматогенеза, повышено число извитых семенных канальцев (ИСК) с нарушением спермиогенеза, слущиванием половых клеток в просвет ИСК [17, 18].
Цитостатические соединения. Среди половозрелого потомства, которое было обработано мисульбаном (на 12—15-е сутки
внутриутробного развития у плодов крыс происходит активная пролиферация оогониев), ни одна самка не забеременела, в яичниках таких крыс лишь иногда встречались желтые тела. Введение ТиоТЭФ на 12-е сутки беременности самкам мышей, когда в яичниках плодов основное количество гамет представлено оогониями, у 19-суточных плодов женского пола снижено количество ооцитов, увеличено количество дегенерирующих ооцитов, замедлена прогрессия их развития [14].
Гормоны. Инъекции в последние 3 дня беременности крысам тестостеронпропионата, эстрогенов индуцируют у женского потомства либо отсутствие желтых тел, либо воспалительную реакцию органов женской половой системы, в том числе и яичников. У мужского потомства развивается атрофия семенников. Сообщено о повышенной частоте развития аденокарциномы влагалища у молодых женщин, матери которых во время беременности ими получали диэтилстилыбэстрол [37). В ряде исследований подтвержден трансплацентарный эффект диэтилстиль-бэстрола на развитие плодов женского пола у человека и у животных. Нарушения выражались в ановуляторных кровотечениях и бесплодии у потомства матерей, принимавших этот препарат во время беременности этим, обследуемым затем, женским потомством. Пренатальный контакт мышей с диэтилстильбэст-ролом приводил к зависимому от дозы снижению плодовитости, а также к уменьшению общего количества и размера пометов, помимо проявления канцерогенного эффекта развитию структурных аномалий яйцеводов, матки и влагалища (тератогенный эффект), снижению количества яйцеклеток (гаметото- и гона-дотоксический эффект) [18, 37, 43].
Алкоголь и никотин. Злоупотребление алкоголем у мужчин приводит к прогрессирующей аплазии половых клеток, атрофии семявыносящих канальцев. При алкоголизме у женщин повышается частота бесплодия, нарушений эмбрио- и фетогенеза и перинатальной смертности детей [14, 18]. При введении алкоголя самкам крыс на 8—14-е сутки беременности у плодов женского пола возрастало количество ооцитов, дегенерирующих в пахитене. Алкогольная интоксикация в антенатальном периоде
Таблица 4
Характеристика состава незрелых половых клеток из эякулята мужчин — НПКЭ (доля в процентах от количества подсчитанных клеток) [19]
Группа пациентов
Количество анализированных НПКЭ на 1 пациента
Количественные данные по составу незрелых половых клеток различных стадий развития в эякуляте обследованных пациентов
сперматоциты в профазе мейоза
прелпахитена
диплотена
сперматоциты в метафазс 1-го и 2-го мейоза
сперматоциты и вторичные сперматиды
неразошед-шиеся в М1 и М2 и сперматиды
неидентифи-цируемые НПКЭ
Контроль (л = 23) 345,53 ± 24,07 Ликвидаторы аварии на Черно-
0,66 ± 0,16 0,45 ±0,10 1,11 ± 0,26 0,04 ± 0,02 91,99 ± 0,89 22,98 ± 2,65 5,85 ± 0,85
быльской АЭС (п = 27) С хроническим простатитом (л = 14) С гонореей
(л = 10) С варикоцеле
(л = 13) Носители хромосомных аберраций (л = 10)
331,07 ±21,35 1,18 ±0,42* 0,10 ± 0,03* 1,58 ± 0,37 0,01 ± 0,01 87,06 ± 1,93* 22,60 ± 3,65 5,72 ± 0,99
258,57 ± 42,09 307,80 ± 47,76 232,38 ± 29,31
283,56 ± 26,29 Примечание. * — р < 0,05.
0,93 ± 0,42 0,55 ± 0,27* 1,28 ± 0,39 0,10 ± 0,07 88,35 ± 2,83 24,70 ± 4,38 8,22 ± 2,19
0,19 ±0,11* 0,20 ±0,11 1,24 ± 0,48 0,61 ± 0,42* 85,44 ± 4,84* 29,56 ± 6,74 13,67 ± 5,66
0,41 ±0,14* 0,28 ± 0,25 1,47 ± 1,30 0,21 ± 0,16 91,59 ± 3,15 24,86 ± 4,30 6,66 ± 2,10
0,71 ± 0,26 0,49 ± 0,20 1,67 ± 0,45 0,06 ± 0,04 89,23 ± 2,51 25,78 ± 4,14 4,22 ± 0,78
оказывает отдаленное действие на спермиогенез половозрелого потомства, снижая количество сперматид 7-го этапа развития и увеличивая количество сперматоцитов с патологией делений мейоза [14, 18). Никотин, вводимый беременным крысам, лает пролонгированный эффект, снижая у мужского потомства количество сперматид и повышая количество сперматоцитов в ана- и телофазе 1-го и 2-го мейоза с отставанием хромосом и формированием мостов [14, 18].
Антибиотики. Нарушается процесс конъюгации хромосом в зиготене у мышей после перорального введения им в течение 10 дней антибиотиков: тетрациклина, макролида или фторхи-нолона [2, 12]. Введенный беременным мышам дважды в терапевтической дозе окситетрациклин (ОТЦ) у женского потомства F1 снижает количество овулируюших ооцитов [9, 14]. Нами установлено, что в яичниках 14-суточных плодов (после введения ОТЦ самкам на 12-е и 13-е сутки беременности) увеличивается количество дегенерирующих и патологических форм делящихся оогониев. У 18-суточных плодов этой серии экспериментов выявлено снижение количества половых клеток в целом, а также уменьшение количества ооцитов в диплотене и диктио-тене 1-й профазы мейозз. У 18-суточных плодов 2-й серии экспериментов также обнаружено уменьшение количества половых клеток и количества ооцитов в диктиотене. Одновременно возрастало количество дегенерирующих ооцитов в пахитене и диплотене. Результаты количественного анализа фолликулообра-зования вокруг ооцита в диплотене [14] свидетельствовали о его замедлении. В яичниках половозрелых мышей (после антенатального действия ОТЦ на 12-е и 13-е сутки беременности) снижалось количество примордиальных фолликулов и количество овулируюших ооцитов, увеличивалось количество дегенерирующих ооцитов и фолликулов. Эти результаты свидетельствуют о том, что антенатальное введение ОТЦ не только частично блокирует оогенез в яичниках плодов, но и оказывает пролонгированное действие, нарушая нормальное развитие половых клеток и фолликулов у половозрелого потомства [9, 14], снижая резерв половых клеток в яичнике, который у человека и млекопитающих животных создается во внутриутробный период и далее только расходуется.
В экспериментах in vivo нередко ставится под сомнение вопрос о непосредственном действии на исследуемую систему организма повреждающего фактора. Параллельно экспериментам на мышах с ОТЦ in vivo мы проводили эксперименты in vitro при кратковременном воздействии ОТЦ в органной культуре эмбриональных яичников в период пролиферативной активности оогониев у мышей |9, 14]. Как в экспериментах in vivo, так и в экспериментах in vitro введение ОТЦ индуцировало увеличение индекса (числа) патологических и дегенерирующих митозов оогониев. Это свидетельствует о том, что созданные условия культивирования гонад можно рассматривать как достаточно физиологические для кратковременной (по крайней мере) персистенции их в культуре in vitro и рекомендовать с использованными нами критериями оценки гаметогенеза для соответствующих экспериментов.
Влияние биологических факторов на сперматогенез
Исследования на данную тему крайне немногочисленны. В серии работ, выполненных в нашей лаборатории в сотрудничестве с другими коллективами, получены четкие доказательства блокирования сперматогенеза у лиц с инфекциями, передаваемыми половым путем. Необходимо подчеркнуть, что в наших работах, одних из первых в мире, прослежена внутригаметная инфекция — наличие вируса простого герпеса в сперматозоидах (при отсутствии инфекции генитальной), и установлена корреляция между такой инфекцией в сперматозоидах мужчин и большей частотой невынашивания беременности у их половых партнерш [5, 18].
Таким образом, оценка токсичности повреждающего гаметы и гонады фактора сводится по большинству критериев к определению функциональной (генеративной) способности половой железы в целом. В настоящее время в исследовательских коллективах цитологический анализ непосредственно мужских половых клеток на каждой стадии их развития носит скорее дополнительный характер. Результаты многолетнего и многопланового цикла наших исследований позволили выявить стадии нарушения сперматогенеза при облучении, действии ряда соединений. изучаемых с помощью количественных методов [5,9, 14, 17, 18].
Результаты ультраструктурных исследований состояния си-наптонемного комплекса мейотических хромосом сперматоцитов I на стадии пахитены, в том числе после воздействий на жи-
вотных различными факторами, свидетельствуют о высокой информативности данного метода и при анализе патозооспермии, и при тестировании мутагенного эффекта. Разрабатызаемый количественный метод электронно-микроскопического исследования состояния ультраструктур мужских гамет в ряде клинических случаев позволяет установить генетическую причину патозооспермии, в экспериментах — вычленить мишени поражения ультраструктур гамет после воздействий [2, 5, 12, 18].
Накапливаются данные об отдаленном эффекте антенатального воздействия на гаметы и генеративную функцию гонад, на половозрелое потомство у человека и млекопитающих животных после действия повреждающего фактора на родителей [6— 8, 20, 44].
J1 итература
1. Баранов В. С., Айламазян Э. К. // Журн. акуш. и жен. бол.
- 2007. - Т 56, вып. 1. - С. 3-10.
2. Богданов Ю. Ф., Коломиец О. Л. Синаптонемный комплекс
- индикатор динамики мейоза и изменчивости хромосом.
- М., 2007.
3. Бочков Н. П., Чеботарев А. Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. — М., 1989.
4. Бочков Н. П., Пузырев В. П., Смирнихина Г. А. Клиническая генетика: Учебник. — М., 2011.
5. Брагина Е. Е., Бочарова Е. Н., Абдумаликов Р. М. и др. // Андрол. и генитальная хир. — 2003. — № 3-4. — С. 31—34.
6. Воробцова И. Е. Влияние облучения родителей на физиологическую полноценность и риск канцерогенеза у потомства первого поколения организмов разных видов: Авто-реф. дис. ... д-ра биол. наук. — Л., 1988.
7. Воробьева М. В. Исследование радиочувствительности хромосом детей облученных родителей: Автореф. дис. .. канд. биол. наук. - СПб., 1995.
8. Дурнев А. Д., Середенин С. Б. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий). — М., 1999.
9. Игнатьева Е. Л., Курило Л. Ф. Ц Онтогенез. - 1984. — Т. 15, № 2. - С. 206-211.
10. Ижевский П. В. // Мед. генетика. - 2007. — Т. 6, № 5 (59).
- С. 39-42.
11. Ижевский П. В. Ц Мед. генетика, 2007. — Т. 6. № 11 (65).
- С. 24-28.
12. Коломиец О. Л., Абудуев Н. К., Мазурова Т. Ф. и др. // Генетика. - 2001. - Т. 37, № 2. - С. 197-206.
13. Кругликовская Т. Ф. Морфологическая характеристика сперматогенного эпителия при воздействии фосфина на организм крыс: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Ал-маты, 2001.
14. Курило Л. Ф. Морфо-функциональные характеристики оогенеза млекопитающих и человека: Дис.... д-ра биол. наук. - М.. 1985
15. Курило Л. Ф., Шаронин В. О., Ворсанова С. Г. // Пробл. ре-прод. - 1998. - Т. 4, № 6. - С. 50-55.
16. Курило Л. Ф., Евдокимов В. В., Ерасова В. И., Шилейко Л. В. II Пробл. репрод. - 2000. - Т. 6, № 1. - С. 35-38.
17. Курило Л. Ф., Макарова Н. П., Шилейко Л. В. Ц Андрол. и генитальная хир. — 2005. — № 4. — С. 8—17.
18. Курило Л. Ф. // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А. В. Масленникова. — Новосибирск, 2008. - Вып. 12. - С. 42-63.
19. Луцкий Д. Л., Николаев A.A., Гончарова Л. А., Ушакова М. В. Ц Пробл. репрод. - 2000. - Т. 6, № 4. - С. 36-40.
20. Нефедов И. Ю. Наследственные последствия облучения обоих родителей (Экспериментальное исследование на крысах линии Вистар): Автореф. дис.... д-ра биол. наук. — Обнинск, 1998.
21. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов / Антонович Е. А., Каган Ю. С., Спыну Е. И. и др. — Киев, 1988.
22. Никитин А. И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека. Ответственность перед будущими поколениями. — СПб., 2005.
23. Охрана репродуктивного здоровья мальчиков и юношей-подростков: Информационное письмо / Тарусин Д. И., Румянцев А. Г., Гаврилова Л. В. и др. — М., 1999.
24. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств / Под ред. Р. У. Хабриева. 2-е изд. — М., 2005.
25. Савельева И. С. Репродуктивное здоровье и репродуктивное поведение современной молодежи: перспективы и пути оптимизации: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — М., 2004.
26. Саноцкий И. В., Фоменко В. Н. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. — М., 1979.
27. Рахманин Ю. А., Сычева Л. П. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях. — М., 2007.
28. Хилькевич Л. В., Курило Л. Ф. // Онтогенез. — 1992. — Т. 23. № 5. - С. 506-510.
29. Чеботарь Н. А. // Генетика. - 1980. - Т. 16, № 7. -С. 1220-1227.
30. Baker Т. G., Neal Р. // The ovary / Eds S. Zuckerman, В. I. Weir. - New York, 1977. - Vol. 1. — P. 1-58.
31. Chandley А. С. // Trends Genet. - 1988. - Vol. 16, № 4. -P. 105-109.
32. Collios T. F. X. Ц Handbook of Teratology: Research Procedures and Data Analysis / Eds J. G. Wilson, F. C. Fraser. — New York, London, 1978. - Vol. 4. - P. 191-219.
33. Dixon R. L. // Methods for assessing the effects of chemicals on reproductive functions / Eds V. B. Vouk, P. J. Sheehan. — Chichester, 1983. - P. 149-162.
34. Dobson R. £., Koehler C. G., Felton J. ct al. // Developmental toxicology of energy-related pollutants / Eds D. D. Mahlum et al. - 1978. - P. 15-26.
35. Donahue R. P. // Methods for detections of environmental agents that produce congenitale defects / Eds Т. H. Shepard et al. — Amsterdam; Oxford, 1975. — P. 125—139.
36. Du Frain R. J., Littlefield G., Wilmer J. L. // Mutat. Res. -1981. - Vol. 85, N 3. - P. 147-160.
37. Herbst A. L., Hubby M. M„ Blough R. R. et al. // J. Rcprod. Med. - 1980. - Vol. 24. - P. 62-70.
38. Heywood R„ James R. W. // Environ. Hlth Perspect. — 1978.
- Vol. 24. - P. 73-80.
39. Iguchi T„ Takasugi N. // Endocrinol. Jpn. - 1981. — Vol. 28.
- P. 207-213.
40. Kurilo L. F. U Hum. Genet. - 1981. - Vol. 57, N 1. - P. 86-92.
41. Lee 1. P., Russell L. L. // Male fertility and its regulation / Eds T. Lobl et al. - Boston, 1985. - P. 203-223.
42. Marks T. A. // Male fertility and its regulation / Eds T. Lobl et al. - Boston. 1985. - P. 245-267.
43. McLachlan J. A., Newbold R. R., Shah H. C. et al. // Fertil. Steril. - 1982. - Vol. 38. - P. 364-371.
44. Meyer M. B„ Onascia G. A. // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1977.
- Vol. 128. - P. 494-502.
45. Steelman J. M. // Toxicology. - 1979. — Vol. 4. - P. 36-43.
46. Tuschmann-Duplessis H. // Eval. Toxicol. Data Prot. Publ. Hlth Proc. Int. Colloq., Luxembourg, 1976. — Oxford, 1977. — P. 81-95.
47. Vouk V. B., Sheehan P. J. Methods for assessing the effects of chemicals on reproductive functions. — Chichester et al., 1983.
48. Wright P. L. U Environ. Hlth Perspect. - 1978. - Vol. 24. -P. 39-43.
riociynmia 07.05.11
О П. В. ИЖЕВСКИЙ, 2011 УДК 613.6:616-007-053.1
П. В. Ижевский
МОНИТОРИНГ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ РАЗВИТИЯ В УЧРЕЖДЕНИЯХ ФМБА РОССИИ
ФГУ Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна ФМБА России, Москва
Цель работы — определить частоту новых случаев врожденных пороков развития среди населения, проживающего на территориях, курируемых ФМБА России. В ФМБА России действует регистр ВПР, соответствующий рекомендациям EUROCAT, Clearinghouse, РАМН. Регистр ВПР работает в соответствии с приказами МЗ РФ (№ 268 от 10.09. ¡998) и ФМБА России. В течение 2000—2005 гг. проведен сбор сведений о частоте новых случаев ВПР с одномоментным сбором данных об условиях труда родителей детей с ВПР. Созданный регистр ВПР является составной частью социально-гигиенического мониторинга населения, проживающего вблизи объектов с особо опасными условиями труда, курируемых ФМБА России.
Ключевые слова: врожденные пороки развития, мониторинг
Р. К Izhevsky. - MONITORING OF CONGENITAL MALFORMATIONS AT THE INSTITUTIONS OF THE FEDERAL BIOMEDICAL AGENCY OF RUSSIA
The purpose of the study was to estimate the incidence of new cases of congenital malformations (CM) in the population living in the areas supervised by the Federal Biomedical Agency (FBMA) of Russia. The latter has a CM register that is conformity with the recommendations of the EUROCA T, Clearinghouse, and Russian Academy of Medical Sciences. The CM register operates in accordance with the orders of the Ministry of Health of the Russian Federation (No. 268 dated September 10, 1998) and the FBMA of Russia. In 2000-2005, data on the incidence of new cases of CM were gathered by simultaneously collecting those on the working conditions of the parents of children with CM. The created CM register is a component of sociohygienic monitoring of the population residing in the vicinity of the objects with particularly dangerous working conditions, which are supervised by the FBMA of Russia. Key words: congenital malformations monitoring
Социально-гигиенический мониторинг (СГМ) — приоритетное направление работ по обеспечению безопасности труда и жизни населения. Составной частью СГМ является мониторинг частоты врожденных пороков развития (ВПР). Необходимость ведения мониторинга ВПР обусловлена ростом удельного веса патологии в структуре причин младенческой смертности, детской заболеваемости и инвалидности, увеличением числа случаев ВПР в России и мире. Ежегодная частота ВПР в раз-
Ижевский П. В — канд. мед. наук, доц., вед. науч. сотр. лаб. разработки методов и технологий лучевой терапии ([email protected])
личных странах мира составляет от 20 до 60 на 1000 рожденных [3, 5]. Необходимость постоянной медико-со-циальной помощи инвалидам с детства, включая коррекцию дефектов, требует значительных экономических затрат. Не менее значимы и морально-психологические аспекты воздействия факта рождения ребенка с ВПР на семью и рабочий коллектив [6].
Для снижения частот ВПР требуется разработка региональных программ по их первичной профилактике. Повышенное внимание должно уделяться выявлению и устранению влияния мутагенных факторов на здоровье работников и населения, проживающего вблизи от предприятий с особо опасными условиями труда. Случаи ВПР рассматриваются как отдаленное последствие мута-
