CC BY
133
УДК 616-006-018-091.818:577.15
СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА УЧАСТВУЕТ В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Степовая Е.А., Закирова Е.В., Наумова А.И., Веснина О.Н., Шахристова Е.В., Орлов Д.С., Якушина В.Д., Новицкий В.В.
Организация, г. Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск РЕЗЮМЕ
Цель исследования - выявить роль компонентов системы глутатиона в реализации рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.
Оценку реализации апоптоза проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием FITS-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества TNF R1- и Fas-презентирующих клеток; активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона осуществляли спектрофотометрическим методом.
Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Jurkat: интактные и инкубированные в присутствии селективного ингибитора ключевого фермента синтеза глутатиона - бутио-нин-сульфоксимина.
Исследование показало, что система глутатиона играет важную регуляторную роль в активации рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.
Компоненты системы глутатиона являются мишенями для активации программированной гибели при опухолевом росте.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: опухолевые клетки линии Jurkat, апоптоз, TNF, Fas, система глутатиона.
Введение
Идентификация молекулярных механизмов регуляции апоптоза является актуальным направлением фундаментальных исследований. Известно, что патогенез опухолевого роста сопровождается не только дизрегуляцией апоптоза, но и формированием окислительного стресса в клетках [1, 2]. Активные формы кислорода могут рассматриваться не только с позиции повреждающих агентов, но и как регуляторные молекулы. Регуляция передачи сигнала в клетках связана с изменениями редокс-состояния тиоловых групп в белках и глутатиона. Транспорт электронов по боковым цепям функциональных —СН2—SH-групп консервативных остатков цистеина белков обусловливает их ре-докс-чувствительность [3]. Число установленных ре-докс-чувствительных путей передачи сигнала в клетках постоянно возрастает. Исследования последних лет
ED Носарева Ольга Леонидовна, тел. 8-923-411-19-51; e-mail: olnosareva@yandex.ru
связаны с выяснением роли глутатиона в экспрессии генов, активации факторов транскрипции, внутриклеточной сигнализации, регуляции активности ферментов, апоптоза и других процессах [4, 5]. Так, повышение внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона ингибирует экспрессию субъединиц с-Боб и _[ип транскрипционного фактора АР-1, участвующего в апоптозе и клеточной пролиферации [6]. Одновременно глутатион участвует в работе глутатион-зависимых ферментов, которым принадлежит ведущая роль не только в обеспечении антиоксидантных процессов, но и в регуляции структуры и функций биологических мембран, обеспечивая адекватное срабатывание рецепторного аппарата клетки. Восстановленный глутатион предотвращает окисление 8Н-групп или восстанавливает 8—8-связи, индуцированные окислительным стрессом, инактивирует свободные радикалы [7].
Цель исследования — выяснить роль компонентов системы глутатиона в реализации рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток линии |игка1.
Материал и методы
В работе использовались клетки линии Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека), полученные из Института цитологии РАН (Россия, г. Санкт-Петербург).
Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat проводили суспензионным методом в полной питательной среде (90% RPMI-1640 (Вектор-Бест, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США), 0,3 мг/мл L-глутамина (Вектор-Бест, Россия), 2 ммоль Hepes (Flow, Великобритания) и 100 мкг/мл гентамицина). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,5%-го раствора трипанового синего (ДИАЭМ, Германия). Для постановки эксперимента использовались культуры клеток, содержащие не более 5% погибших клеток. Для выявления участия глутатиона в реализации рецепторного пути программированной гибели опухолевые клетки инкубировали в течение 18 ч при 37 °С и в 5%-й атмосфере С02 в присутствии бутионин-сульфоксимина (BSO) (Sigma, США) - ингибитора ключевого фермента синтеза тио-ла у-глутамил-цистеинсинтетазы в конечной концентрации 1 ммодь [8]. После инкубации клетки трижды отмывали 0,01 моль натрий-фосфатным буфером (рН = 7,4) и использовали для определения процента TNF R1-, Fas-позитивных, апоптотически измененных клеток либо ресуспендировали в буфере с добавлением 1% тритона Х-100, выдерживали на льду и готовили лизат с сохранением стандартной концентрации клеток для определения активности каспазы-3. Для определения содержания компонентов системы глутатиона лизат опухолевых клеток депротеинировали с 5%-м раствором сульфосалициловой кислоты [9]. Далее оценивали содержание восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG) методом ферментативной рециркуляции и блокирования SH-групп GSH винилпирилидином (Walko, Япония). Для расчета концентрации глутатиона строили калибровочный график, используя раствор GSH и GSSG (Sigma, США) с концентрациями от 3 до 100 мкмоль [10]. Результаты представляли в нмоль/мг белка. Дополнительно рассчитывали величину соотношения GSH/GSSG как показатель редокс-статуса клетки.
Концентрацию белка в пробах определяли методом М.М. Бредфорда [11], используя калибровочный график, построенный на основе стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина с концентрациями от 1 до 10 мкг на 100 мл.
Оценку апоптоза опухолевых клеток проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидия иодида (BD, Нидерланды) согласно инструкции фирмы-про-
изводителя. Метод основан на специфическом связывании FITC-меченного аннексина V с фосфатидилсе-рином и способности пропидия иодида (PI) интерко-лировать с молекулой ДНК. Подсчет количества FITC+/Pr- и Р1ТС+/Р1+-меченных клеток осуществляли к общему числу изучаемых клеток и выражали в процентах.
Оценку количества TNF R1- и Fas-презентирующих опухолевых клеток проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител к человеческому антигену CD120 и CD95 (R&D Systems, США) согласно инструкции фирмы-производителя.
Активность каспазы-3 определяли спектрофлюо-риметрическим методом по способности избирательного гидролиза синтетического тетрапептидного флюоригенного субстрата N-acetyl-(Asp-Glu-Val-Asp)-7-amino-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC) (Sigma, США) с образованием AMC, который флюоресцировал в диапазоне длин волн 430—460 нм (максимум возбуждения флюоресценции при длине волны 380 нм). Активность каспазы-3 выражали в пикомолях освобождаемого амино-4-метилкумарина в минуту на 1 мг белка в пробе [12, 13].
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы SPSS 13.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна— Уитни. Данные представлены в виде медианы Me, верхнего и нижнего квартилей {Qi~Qi)- Наличие связи между показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Добавление в среду инкубирования опухолевых клеток BSO вызывало быстрое истощение пула GSH и сопровождалось статистически значимым снижением его концентрации в 5,1 раз (р< 0,05). Однако концентрация дисульфида глутатиона имела сопоставимые значения по сравнению с интактными опухолевыми клетками (рисунок). GSH существует в клетке в равновесии с глута-тионом дисульфидом (GSSG), а отношение концентраций GSH/GSSG служит показателем редокс-состояния клетки [7, 14]. В интактных опухолевых клетках величина соотношения GSH/GSSG имела значения, равные 13,1 (11,4-14,2), а при добавлении ингибитора синтеза тиола de novo достигался сдвиг отношения GSH/GSSG в сторону возрастания дисульфида и показатель был равен значениям 3,3 (2,5-4,1) (таблица). Известно, что GSSG
является более реакционно-способной молекулой по сравнению с С8Н и способен вступать в тиол-дисульфидный обмен с активными 8Н-группами белков с образованием смешанного дисульфидного комплекса или может окислять эндогенные 8Н-группы с образованием дисульфидов [7]. Поэтому увеличение концентрации 0880, сопряженное с истощением пула 08Н, способно вызывать глутатионилирование редокс-чувствительных белков с ферментативной и рецептор-ной функцией, в каталитическом домене которых имеются функционально важные остатки цистеина.
з, о
2, 5 2, О 1, 5 1, О О, 5 О, О -О, 5
f
^Н Восстановленный глутатион Hill Окисленный глутатион
Медиана _ - 25%-75% Min-max
4
пШт
Jurkat Jurkat+BSO
Уровень восстановленного и окисленного глутатиона (нмоль/мг белка) в интактных опухолевых клетках линии Jurkat и при действии селективного ингибитора синтеза глутатиона — бутионин-сульфоксимина (BSO); * — уровень статистической значимости различий по сравнению с интактными опухолевыми клетками линии Jurkat при р < 0,05
Проведение оценки количества апоптотически измененных клеток линии Jurkat в условиях их культивирования со специфическим ингибитором синтеза глутатиона BSO показало статистически значимое увеличение процента аннексин-положительных клеток в 8,8 раза (р < 0,05) по сравнению с интактной культурой (таблица). Повышенный уровень восстановленной формы глутатиона подавляет программированную клеточную гибель, так как данный тиол регулирует ре-докс-гомеостаз опухолевой клетки и активность многих транскрипционных факторов, способствующих выживанию опухолевых клеток [6, 15].
Для оценки молекулярных механизмов рецепторной регуляции апоптоза опухолевых клеток в условиях действия блокатора синтеза глутатиона были оценены TNF Rl, FAS и каспаза-3. Было показано, что добавление BSO в конечной концентрации 1 ммоль увеличивало в 5,8 раза (р< 0,05) и в 18,4 раза (р< 0,05) количество клеток, презентирующих на своей поверхности TNF Rl и Fas, по сравнению с интактными клетками (таблица).
Содержание аннексии-, TNF Rl-, Fas-положительных клеток, активность каспазы-3 и величина соотношения восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону в интактных опухолевых клетках линии Jurkat и при действии селективного ингибитора синтеза глутатиона - бутионин-сульфоксимина (BSO), Ме (Qi-Qj)
Jurkat Jurkat + BSO
Количество аннексин-положительных клеток, % 5,2 (4,0-5,6) 45,9 (37,5-67,1) р< 0,05
Количество ТКР-Ю-положительных клеток, % 9,5 (7,3-14,2) 55,4 (52,7-70,0) р< 0,05
Количество Рая-положительных клеток, % 4,3 (2,1-8,9) 78,9 (77,5-87,2)р< 0,05
Каспаза 3, пмоль/(мин • мг белка) 36,6 (22.7-43,9) 134,2 (129,5-140,2) р< 0,05
Восстановленный глутатион/окисленный глутатион 13,1 (11,4-14,2) 3,3 (2,5-4,1) р< 0,05
Примечание, р — уровень статистической значимости различий по сравнению с интактными опухолевыми клетками линии Jurkat.
Увеличение количества TNF Rl- и FAS-презентирую-щих клеток, вероятно, связано со снижением редокс-потенциала опухолевых клеток линии Jurkat в присутствии BSO. Это подтверждает наличие отрицательной корреляционной связи между величиной соотношения GSH/GSSG и количеством TNF Rl- (г = -0,5, р < 0,05) и FAS-презентирующих клеток {г =-0,5, р < 0,05) при добавлении ингибитора синтеза тиола de novo. Реализация TNF Rl- и FAS-опосредованного пути апоптоза включает в себя активацию киназ. Кроме этого, активированные рецепторы связываются с белками, имеющими домены SH2, распознающими фосфо-тирозин-содержащие последовательности активированного рецептора. Можно предположить, что преобладание GSSG могло повлечь глутатионилирование остатков цистеина в белках, обеспечивающих сигнальную трансдукцию. Рядом авторов была показана способность GSSG оказывать рецепторопосредованное влияние на внутриклеточные процессы [16, 17].
Блокирование синтеза глутатиона de novo в опухолевой клетке проявлялось активацией эффекторной каспазы-3. Так, в присутствии BSO в опухолевых клетках происходило статистически значимое увеличение активности фермента в 3,7 раза {р < 0,05), по сравнению с интактными клетками (таблица). Известно, что при вовлечении клетки в TNF Rl- и FAS-onocpe-дованный путь апоптоза происходит прямая активация каспазы-3 посредством каспазы-8 [18]. Исходя из полученных данных, можно заключить, что компоненты системы глутатиона влияют на активацию эффекторной каспазы-3. В связи с этим можно предположить, что соотношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону регулирует рецепторный путь реализации апоптоза не только через АР-1, NFk-B,
Вс1-2, р53 [6, 14, 15], но и напрямую, ингибируя превращение прокаспазы-8 в активную форму, субстратом которой является каспаза-3.
Заключение
Действие селективного ингибитора ключевого фермента синтеза тиола у-глутамил-цистеинсинтетазы способствует проведению «смертельных» сигналов внутрь клетки с повышением активности эффекторных каспаз, что неизбежно приводит к увеличению числа клеток, вступивших в апоптоз. В связи с этим, с практической точки зрения, возможность влияния на про-тивоапоптотическую роль восстановленного глутатиона в опухолевых клетках с помощью блокирования его синтеза de novo представляет большой интерес для разработки новых подходов для таргетной терапии онкологических заболеваний.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Совета при Президенте Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ (соглашение № НШ-4184.2014.7); в рамках Федеральной целевой программы <<Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 гг. >> (соглашения N° 8302 и 8487).
Литература
Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Аанкин В.З. Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: APTA, 2008. 284 с.
2.Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Часовских Н.Ю., Кайго-родова Е.В., Старикова Е.Г., Стариков Ю.В. Роль ре-докс-зависимых сигнальных систем в регуляции апоптоза при окислительном стрессе // Цитология. 2009. Т. 51, № 4. С. 329-334.
3. Курилова A.C., Крутецкая З.И., Лебедев O.E., Антонов В.Г. Влияние окисленного глутатиона и его фармакологического аналога препарата глутоксим на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах // Цитология. 2008. Т. 50, № 5. С. 452-461.
4.Asian M., Canutan D. Modulation of redox pathways in neutrophils from sickle cell disease patients // Exp. Hema-
tol. 2008. V. 36 (11). P. 1535-1544.
5.Desideri E., Filomeni G., Ciriolo M.R. Glutathione participates in the modulation of starvation-induced autophagy in carcinoma cells // Autophagy. 2012. V. 8 (12). P. 17691781.
(¡.Октябрьский O.H., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72. Вып. 2. С. 158-174.
7.Кулинский В.И., Колесниченко А.С. Глутатион ядра клетки и его функции // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. Вып. 6. С. 657-662.
8. Laragione Т., Gianazza Е., Tonelli R., Bigini P., Mennini Т., Casoni F., Massignan Т., Bonetto V., Ghezzi P. Regulation of redox-sensitive exofacial protein thiols in CHO cells // Biol. Chem. 2006. V. 387 (10-11). P. 1371-1376.
9.Арутюнян А.В., Дубинина E.E., Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиокси-дантной защиты организма. СПб., 2000. 103 с.
10.Kojima S., Nakayama К., Ishida Н. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth // J. Radiat. Res. 2004. V. 45, № 1. P. 33-39.
11 .Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analyt. Biochem. 1976. V. 7, № 1, 2. P. 248-254.
12. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem. J. 1997. V. 326. P. 1-16.
13.Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death // Cell Death and Differentiation. 1999. V. 6. P. 1028-1042.
14. Зенков H.K., Меныцикова Е.Б., Ткачев B.O. Некоторые принципы и механизмы редокс-регуляции // Кислород и антиоксиданты. 2009. Вып. 1. С. 3-64.
15.Raza Н., John A., Howarth F.C. Alterations in glutathione redox metabolism, oxidative stress, and mitochondrial function in the left ventricle of elderly zucker diabetic Fatty rat heart // Int. J. Mol. Sci. 2012. V. 13 (12). P. 16241-16254.
16. Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Disulfide relays and phosphorylative cascades: partners in redox-mediated signaling pathways // Cell Death Differ. 2005. V. 12 (12). P. 1555-1563.
17. Бурова Е.Б., Василенко К.П., Антонов В.Г., Никольский H.H. Трансактивация рецептора эпидермального фактора роста окисленным глутатионом и его фармакологическим аналогом Глутоксим в клетках А431 // Докл. РАН. 2005. Т. 404 (1). С. 122-124.
18.Беленичев И.Ф., Черний В.И., Колесник Ю.М. и др. Рациональная нейропротекция. Донецк: Издатель Заславский А.Ю., 2009. 262 с.
Поступила в редакцию 05.05.2014 г.
Утверждена к печати 09.10.2014 г.
Рязанцева Н.В. — д-р мед. наук, зав. кафедрой молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики СибГМУ (Томск).
Носарева О.Л. (ЕЗ) — канд. мед. наук, кафедра биохимии и молекулярной медицины СибГМУ (г. Томск).
Степовая Е.А. — д-р мед. наук, профессор, СибГМУ (г. Томск).
Закирова Е.В., СибГМУ (г. Томск).
Наумова А.И., СибГМУ (г. Томск).
Веснина О.Н., СибГМУ (г. Томск).
Шахристова Е.В. — канд. мед. наук, СибГМУ (г. Томск).
Орлов Д.С., СибГМУ (г. Томск). Якушина В.Д., СибГМУ (г. Томск).
Новицкий В.В. — д-р мед. наук, профессор, академик РАН, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ (г. Томск). ED Носарева Ольга Леонидовна, тел. 8-923-411-19-51; e-mail: olnosareva@yandex.ru
THE GLUTATHIONE SYSTEM IS INVOLVED IN REGULATION OF TUMOR CELLS APOPTOSIS
Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Stepovaya Ye.A., Zakirova Ye.V., Naumova A.I., Vesnina O.N., Shakhristova Ye.V., Orlov D.S., Yakushina V.D., Novitsky V.V.
Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation
ABSTRACT
The research objective is to determine the role of the gluthatione system components in realization of the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.
Apoptosis realization using FITC-labeled annexin V and propidium iodide as well as the amount of TNF Rl- and Fas-presenting cells has been evaluated by flow cytofluorometry; activity caspase-3 registered a spektroflyuorimetrichesky method. The concentration of reduced and oxidated gluthatione has been determined by spectrophotometry.
The material for the research was intact Jukart tumor cells and the ones incubated in the presence of a selective inhibitor of the key gluthatione synthesis enzyme - buthionine-sulfoximine.
The research has shown that the gluthatione system plays an important regulatory role in activation of the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.
The gluthatione system components are targets for activation of programmed cell death in tumor growth.
KEY WORDS: Jukart tumor cells, apoptosis, TNF, Fas, gluthatione system.
Bulletin of Siberian Medicine, 2014, vol. 13, no. 5, pp. 73-78
References
1. Men'shhikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z. Bondar' I.A., Trufakin V.A. Oxidizing stress: Pathological states and diseases. Novosibirsk, ARTA Publ., 2008. 284 p.
2. Ryazantseva N.V., Novicky V.V., Chasovskikh N.Yu., Ka-jgorodova Ye.V., Starikova Ye.G., Starikov Yu.V. Role of redoks-dependent alarm systems in regulation of apoptosis at an oxidizing stress. Tsitologiya — Cytology, 2009, vol. 51, no. 4, pp. 329-334 (in Russian).
3.Kurilova L.S., Kruteckaja Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G. Influence of the oxidized glutathione and its pharmacological analog of a preparation glutoksy on intracellular concentration of Ca2 in macrophages. Tsitologiya - Cytology, 2008, vol. 50, no. 5, pp. 452-461 (in Russian).
4. Asian M., Canatan D. Modulation of redox pathways in neutrophils from sickle cell disease patients. Exp. Hematol., 2008, vol. 36 (11), pp. 1535-1544.
5.Desideri E., Filomeni G., Ciriolo M.R. Glutathione participates in the modulation of starvation-induced autophagy in carcinoma cells. Autophagy, 2012, vol. 8 (12), pp. 17691781.
6. Oktjabr'sky O.N., Smirnova G.V. Redoks-regulyation cellular functions Biokhimiya - Biochemistry, 2007, vol. 72, vyp. 2, pp. 158-174 (in Russian).
7. Kulinsky V.I., Kolesnichenko L.S. Glutation of a kernel of a cage and its function. Biomeditsinskaya khimiya - Biochemistry, 2010, vol. 56, vyp. 6, pp. 657-662 (in Russian).
8. Laragione T., Gianazza E., Tonelli R., Bigini P., Mennini T., Casoni F., Massignan T., Bonetto V., Ghezzi P. Regulation of redox-sensitive exofacial protein thiols in CHO cells. BiolChem., 2006, vol. 387 (10-11), pp. 1371-1376.
9. Arutyunyan A.V., Dubinina E.E., Zyibina N.N. Methods of an assessment of free radical oxidation and antioxidant protection of an organism. St. Petersburg, 2000. 103 p. (in Russian).
10. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth. /. Radiat. Res., 2004, vol. 45, no. 1, pp. 33-39.
11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem., 1976, vol. 7, no. 1-2, pp. 248-254.
12. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Bio-chern. /., 1997, vol. 326, pp. 1-16.
13. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death and Differentiation, 1999, vol. 6, pp. 1028-1042.
14. Zenkov N.K., Men'shhikova E.B., Tkachev V.O. Some principles and mechanisms of redoks-regulation. Kislorod i antioksi-danty - Oxygen and antioxidants, 2009, vol. 1, pp. 3-64 (in Russian).
15. Raza H., John A., Howarth F.C. Alterations in glutathione redox metabolism, oxidative stress, and mitochondrial function in the left ventricle of elderly zucker diabetic Fatty rat heart. Int. J. Mol. Sci., 2012, vol. 13 (12), pp. 16241-16254.
16. Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Disulfide relays and phosphorylative cascades: partners in redox-mediated signaling pathways. Cell Death Differ., 2005, vol. 12 (12), pp. 1555-1563.
17. Burova E.B., Vasilenko K.P., Antonov V.G., Nikol'sky N.N. Transaktivation of a receptor of an epidermalny factor of growth by the oxidized glutathione and its pharmacological analog Glutoksy A431 in cages. Dokl. Russian Academy of Sciences, 2005, vol. 404 (1), pp. 122-124. (in Russian).
18. Belenichev I.F., Cherniy V.I., Kolesnik Yu.M. et al. Rational neuropatronage. Donetsk, Izdatel Zaslavskiy A.Yu. Publ., 2009. 262 p. (in Russian).
Ryazantseva N.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Nosareva O.L. (H), Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Stepovaya Ye.A., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Zakirova Ye.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Naumova A.I., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Vesnina O.N., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Shakhristova Ye.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Orlov D.S., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Yakushina V.D., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Novitsky V.V. Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
! Nosareva O.L., Ph. +7-923-411-19-51; e-mail: olnosareva@yandex.ru
