CC BY
45
УДК 616.151.514-074
СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ПРИ ИСТИННОЙ ПОЛИЦИТЕМИИ И ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ
Н. А. Костко, Г. М. Костин Минский консультационно-диагностический центр
При хроническом миелолейкозе и истинной полицитемии нарушения гемостаза выявлены на тех стадиях, где непосредственно участвует тромбоцитарный компонент, а именно на заключительном этапе формирования кровяного сгустка и на уровне первичного клеточного гемостаза. Скрининговые тесты вторичного гемостаза, отражающие работу только плазменных факторов, были практически сохранены в границах нормы (кроме АЧТВ). Гипокоагуля-ция 1 фазы, возможно, связана с наличием патологических антикоагулянтов. Таким образом, исходя из полученных данных, можно предположить, что в основе патогенеза тромбозов и геморрагий при данных заболеваниях в патологических сдвигах гемостаза тромбоцитарный компонент играет существенную роль. Дефектность тромбоцитов, в свою очередь, является следствием происхождения их из неопластического клона мегакариоцитов.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, истинная полицитемия, гемостаз, тромбоцит, функция
THE SYSTEM OF HEMOSTASIS FOR POLICYTHEMIA AND CHRONIC MYELOLEUKOSIS
N. А. Kostko, G. М. Kostin Minsk Consultative Diagnostic Center
It has been discovered that for chronic myeloleukosis and policythemia changes of a hemo-stasis are typical at those stage where directly participates platelet component, namely at the final stage of a blood clot formation and at a level of a platelet hemostasis. We demonstrate: on the background of normal or increased platelets level, saved based secondary hemostasis tests, the combination of hyperfibrinolysis, decrease in a clot volume, its density and a general hemostatic parameter results in functionally defective blood clot formation, which, in its turn, testifies about hemorrhagic risk.
Key words: chronic myeloleukosis, policythemia, hemostasis, platelet, function
Одной из причин, угрожающих жизни пациентов с хроническими миелопролифе-ративными заболеваниями, являются осложнения, наблюдаемые со стороны системы гемостаза: инфаркты органов, язвенно-некротические проявления гангрены конечностей, внутренние кровотечения, ДВС-синд-ром и т. д. [1, 2].
Хронический миелолейкоз и истинная полицитемия (синонимы: эритремия, болезнь Вакеза) являются наиболее распространенными миелопролиферативными заболеваниями. Заболеваемость приблизительно одинакова при обеих нозологиях и составляет 1,0-1,5 на 100 000 человек в год [1, 2, 5].
В настоящее время ощущается недостаток адекватных методов, пригодных
для отбора больных ХМПЗ по группам риска развития тромбозов и кровоточивости. Недостаточно разработаны и вопросы тактики лечения и профилактики осложнений в системе гемостаза при данных патологиях. Существующие литературные данные зачастую противоречивы, так как основываются на результатах ограниченного количества методов без учета их информативности [5]. В связи с этим необходимо разработать алгоритм доступных методов для лабораторного мониторинга гемостаза при ХМПЗ для своевременного предупреждения возможных осложнений, а также быстрой и грамотной коррекции уже возникших нарушений.
Материалы и методы исследований
На базе клинико-диагностической лаборатории Минского консультационно-диагностического центра (МКДЦ) проведено исследование системы гемостаза у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) — п = 50 и истинной полицитемией (ИП) — п = 53. Все обследованные пациенты находятся на диспансерном учете в МКДЦ. Контрольную группу (п = 30) составили здоровые доноры обоего пола, сопоставимые по возрасту.
Взятую путем пункции периферической вены венозную кровь стабилизировали 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.
Экспериментальная часть включала исследование плазменного и тромбоцитарно-го гемостаза.
На первом этапе каждому пациенту проводили оценку плазменного гемостаза с помощью основных скрининговых тестов на каждую фазу свертывания крови:
1 фаза: активированное частичное тром-бопластиновое время (АЧТВ);
2 фаза: протромбиновое время (международное нормализованное отношение — МНО);
3 фаза: тромбиновое время (ТВ) и концентрация фибриногена (Фиб);
4 (посткоагуляционная) фаза: ретракция кровяного сгустка, спонтанный фибри-нолиз, объем (V) и плотность сгустка (Б), показатель гемостатической полноценности сгустка (Т).
Хронометрические показатели регистрировали на фотооптическом четырехка-нальном гемокоагулометре СТ — 2410 фир-
мы «Солар» (Беларусь) с использованием реагентов производства фирмы «Ренам» (Россия). Оценку свойств кровяного сгустка выполнили с использованием метода «Одновременного определения времени свертывания крови, ретракции, спонтанного фибрино-лиза и гемостатических свойств кровяного сгустка» (по Е. П. Иванову) [3].
Исследование первичного тромбоци-тарного гемостаза включало: подсчет количества тромбоцитов, оценку агрегацион-ных свойств тромбоцитов.
Подсчет количества тромбоцитов (Тр) венозной крови осуществляли с помощью гематологического анализатора «System 9000» фирмы «Serono diagnostics». Агрегацион-ную активность пластинок оценивали фотометрическим методом с использованием турбидиметрического агрегометра тромбоцитов АР-2110 фирмы «Солар» (Беларусь). Агрегатометрия выполнена со следующими индукторами: раствором натриевой соли АДФ в 4 концентрациях: 0.5; 1.5; 2.5; 5,0х10-6 М/л, гидрохлоридом адреналина (АДР) в конечной концентрации 5,0х10-6 М/л и раствором коллагена (КОЛ) 2,0 мг/мл.
Данные обработаны с использованием статистической программы Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение
Тромбоцитоз характерен для всех хронических миелопролиферативных заболеваний, однако случаи с нормальным уровнем тромбоцитов также нередки. Для исследования в каждой нозологии были отобраны больные с нормальным (150,0-450,0x10%) и повышенным (>450,0х109 /л) уровнями тромбоцитов (табл. 1).
Таблица 1
Количество тромбоцитов в исследованных группах при хроническом миелолейкозе и истинной полицитемии, X ± 8Х
Параметр Исследованные группы
контроль, n = 30 ХМЛ, n = 50 ИП, n = 53
Тр, 1х109/л 310 ± 9,8 728,4 ± 81,1 (150-2771) 538,2 ± 26,1 (153-1016)
Оценка плазменного гемостаза.
Для характеристики коагуляционного гемостаза в обеих когортах пациентов с хроническим миелолейкозом и истинной поли-цитемией были выполнены базисные тесты,
принятые в Республике Беларусь, а именно: АЧТВ, МНО, ТВ и количество фибриногена. Предварительно определение аналогичного спектра коагулологических параметров было проведено у группы доноров (рис. 1).
Рис. 1. Показатели исследования плазменного гемостаза у здоровых лиц, больных с хроническим миелолейкозом и истинной полицитемией
Для АЧТВ и тромбинового времени в качестве сравниваемой величины использовались относительные единицы (значение времени исследуемой плазмы пациента к значению контроля — Я), что позволило избежать влияния различий в сериях реагентов.
Нами выявлено статистически значимое удлинение АЧТВ-теста как в группе с ХМЛ (1,14±0,03), так и с ИП (1,18±0,03) по сравнению с контролем (0,97±0,01). Гипо-коагуляцию 1 фазы мы связываем с появлением в крови патологических вторичных антикоагулянтов, образующихся за счет распада большого количества неопластических клеток. Для подтверждения этой гипотезы нами была проведена корреляция между содержанием лейкоцитов в крови пациентов и значением АЧТВ-индекса. В результате выявлена положительная умеренная корреляционная связь только у больных с ИП: г = 0,52 с уровнем значимости р = 0,03, при ХМЛ: г < 0,3 (р > 0,05).
2 фаза свертывания крови, характеризующая внешний путь образования про-тромбиназы, была абсолютно сохранена в обеих нозологиях. Значения показателя МНО, ее главного критерия, при ХМЛ (1,1±0,01)
и ИП (1,1±0,01) находились в пределах нормы (0,9 < МНО < 1,2).
Тесты, относящиеся к 3 фазе — превращения фибриногена в фибрин, также не показали отклонения от нормы. Индекс ТВ составил при ХМЛ (1,05 ± 0,02), ИП (1,1 ± 0,01) по сравнению с донорами (1,0 ± 0,01). Уровень фибриногена в плазме был равен 2,95 ± 0,13 (ХМЛ), 2,45 ± 0,01 (ИП), а в группе здоровых людей он оказался 2,79 ± 0,08.
Необходимо отметить, что не только скорость образования (т. е. вышеперечисленные тесты), но и качество кровяного сгустка — плотность (Б), объем (V), способность к ретракции, а также возможность его лизиса фибринолизином — во многом определяют полноценность остановки кровотечения.
Ретракция тромба имеет большое значение на этапе формирования кровяного сгустка как ткани, временно замещающей дефект и обеспечивающей гемостаз. Так, этот показатель был сохранен у больных с ХМЛ (64,3 ± 2,56) при контроле (66,9± 0,83). При ИП наблюдается статистически значимое р < 0.05 снижение ретрактильной функции сгустка (62,58 ± 1,.82) (рис. 2).
Рис. 2. Показатели исследования гематокрита, ретракции и фибринолиза у здоровых лиц, больных с хроническим миелолейкозом и истинной олицитемией
Тромбоциты (6 тромбоцитарный фактор — тромбостенин) принимают активное участие в ретракции тромба. Исходя из того, что при ХМПЗ встречаются как тром-боцитозы, так и случаи с нормальным
уровнем пластинок, мы провели корреляцию между содержанием тромбоцитов и показателем ретракции. Однако связь ни в одной из рассматриваемых нозологиях не была выявлена (табл. 2).
Таблица 2
Показатели коэффициентов корреляции между количеством тромбоцитов / ретракцией и количеством тромбоцитов / фибринолизом при хроническом миелолейкозе
и истинной полицитемии
Коэффициенты корреляции Исследуемые группы
ХМЛ ИП
г Тр/ретракция 0,003 0,072
г Тр/фибринолиз 0,206 0,028
У большинства обследованных больных, независимо от их нозологической принадлежности, обнаружен общий характер дисфункции фибринолитической системы, а именно ее активация (рис. 2). При этом между значениями спонтанного фибринолиза при ХМЛ (23,23 ± 2,17) и ИП (24,41 ± 2,14) нет статистических различий (р > 0,05). Показатели фибринолиза доноров составили 12,7 ± 0,39. Ключевую роль в активации фибринолиза играют тромбоциты (8 тром-боцитарный фактор — Р8). Следовательно, гиперфибринолиз может являться результатом высвобождения больших количеств Р8 при активации пластинок. Это, в свою очередь, может привести к геморрагиче-
ским диатезам. Нами был изучен корреляционный анализ между количеством пластинок и показателем спонтанного фибри-нолиза. Связи установлено не было, что позволяет сделать вывод: содержание тромбоцитов не является определяющим для оценки степени нарушения фибринолитической активности плазмы в рассматриваемых но-зологиях хронических лейкозов.
Степень надежности образовавшегося сгустка также оценивают с помощью показателей гемостатических свойств сгустка (V, Б и Т) (рис. 3). Эти параметры указывают на гемостатический дефект даже тогда, когда другие тесты коагулограммы изменены мало или неопределенно [3, 4].
Рис. 3. Показатели исследования структурных свойств сгустка у здоровых лиц, больных с хроническим миелолейкозом и истинной полицитемией
Среди всех обследованных показатель гематокрита составил: при ХМЛ — 34,42 ± 1,09, ИП — 49,98 ± 0,81, контроль — 42 ± 0,64. В обеих исследуемых группах отмечается значимое снижение плотности сгу-
стка (Б) — показателя соотношения в тромбе форменных элементов и сыворотки (ХМЛ — 0,54 ± 0,03, ИП — 0,88 ± 0,03, при норме — 1,93 ± 0,06, р < 0,05). Имеющееся уменьшение плотности сгустка, а следовательно,
преобладание в последнем количества жидкой фазы (сыворотки) над количеством плотной фазы (форменных элементов) приводит к образованию рыхлого тромба.
На фоне сохраненной ретрактильности у большинства обследованных пациентов образуются сгустки, меньшие по объему, чем у здоровых людей (ХМЛ — 0,49 ± 0,01, ИП — 0,55 ± 0,01, контроль — 0,57 ± 0,01, р < 0,05).
И как следствие снижения плотности и объема образовавшегося тромба, показатель общей гемостатической полноценности (Т) среди всей обследованной когорты резко угнетен (ХМЛ — 0,26 ± 0,01, ИП — 0,48 ± 0,02, контроль составил 1,12 ± 0,02).
Оценка полученных данных позволила сделать вывод: несмотря на нормальный или повышенный уровень тромбоцитов и относительно нормальные показатели скрининговых тестов вторичного гемостаза, сочетание ги-перфибринолиза, снижения объема сгустка, его плотности и общего гемостатического показателя приводит к формированию функционально неполноценного сгустка (тромба), свидетельствует о геморрагическом риске.
Оценка тромбоцитарного гемостаза
Исследования агрегации тромбоцитов с основными скрининговыми индуктора-
ми (адреналином, АДФ и коллагеном) были выполнены у обследуемых как с тром-боцитозом, так и с нормальным уровнем тромбоцитов. При выполнении агрегато-метрии количество тромбоцитов было приведено к стандартному значению — 200-250 тыс/мкл (при тромбоцитозе для предотвращения спонтанной агрегации выполнено разведение).
При рассмотренных формах хронических миелопролиферативных заболеваний (ХМЛ и ИП) выявлены разнонаправленные изменения функции тромбоцитов: как снижение, вплоть до полного угнетения, так и (реже) усиление агрегационной активности пластинок при стимуляции адреналином и разными концентрациями ADP. Мы полагаем, что невысокий процент выявляемости гиперагрегации тромбоцитов может быть следствием, как минимум, двух причин:
1) диссеминированной внутрисосуди-стой агрегации (ДВА-синдром); в результате in vitro исследуются уже неполноценные, «пустые» тромбоциты;
2) особенностью исследуемой выборки с более выраженным геморрагическим риском.
Таблица 3
Показатели агрегационной активности тромбоцитов в исследованных группах при хроническом миелолейкозе и истинной полицитемии, X ± Sx
Индуктор Исследуемые группы
контроль, n = 30 ХМЛ, n = 50 ИП, n = 53
АДР 5,0х10"6 81,2 ± 1,9 27,67 ± 5,07 27,46 ± 7,06
АДФ1,5х10"6 65,3 ± 1,4 18,98 ± 3,29 16,23 ± 5,37
АДФ2,5х10-6 75,8 ± 1,7 32,66 ± 3,85 27,38 ± 5,68
АФД5,0х10-6 80,5 ± 1,5 29,7 ± 8,21 35,34 ± 5,81
КОЛ 2,0мг/мл 68,8 ± 1,3 59,86 ± 7,12 55,65 ± 5,92
В целом среди всех обследованных адреналин-агрегация была нарушена в 89 ± 2,5% случаев в виде угнетения ответа. При этом чаще встречались следующие дефекты агрегационного ответа (рис. 4):
I тип: полное угнетение ответа (54 ± 4%) при воздействии адреналином может быть следствием: дефицита адреналиновых рецепторов; дефекта поверхностной клеточной мембраны, в результате которого нарушается взаимодействие агониста с кле-
точным рецептором; снижения количества и/или качественного несовершенства плотных гранул, обеспечивающих реакцию высвобождения первого порядка.
II тип: первичная гипоагрегация с замедлением реакции высвобождения (8 ± 2%). Этот особый тип агрегации, по нашим наблюдениям, характерен именно для пациентов с ХМПЗ. Судя по литературе, действие адреналина на клетку не зависит от образования тромбоксана А2 и от реакции
высвобождения, а непосредственно связан с модуляцией тромбоцитарных мембран при взаимодействии с а-рецепторами. Через цепь сложных превращений это приводит к изменению проницаемости мембраны к Са2+ (основному, наряду с фактором Виллебранда, плазменному кофактору адгезивно — агрегационной функции тромбоцитов). Таким образом, дефект клеточной мембраны вызывает угнетение первичного ответа и задержку трансдукции
сигнала к секреторным гранулам, то есть задержку реакции высвобождения.
III тип: ответ неполный, одноволно-вый, с угнетенной реакцией высвобождения (22 ± 3,3%). Угнетение реакции высвобождения второго порядка может быть следствием: повреждения тромбоцитов в периферическом сосудистом русле при их обратимой агрегации; первичного внутреннего пластиночного дефекта (дефицитом а-гранул).
N — нормальная контрольная кривая; I, II, III — типы агрегационных кривых
Рис. 4. Основные типы агрегационных кривых при хронических миелопролиферативных заболеваниях в ответ на адреналин 5,0 х 10-6 М/л
Учитывая тот факт, что степень агрегации тромбоцитов и выход продуктов реакции высвобождения зависят от концентрации АОР, этот агонист использовался нами в различных концентрациях: от минимальной — 0,5 х 10-6 М/л; средней — 1,5; высокой - 2,5; и, наконец, максимальной - 5,0 х 10-6 МУл. Эмпирически нами было выявлено, что средняя концентрация АОР 1,5 х 10-6 М/л является наиболее информативной при оценке степени дисфункции тромбоцитов, т.к. обычно при этой концентрации кривая имеет две волны, с помощью которых можно оценивать и первичный, и вторичный ответы.
Результаты проведенных агрегационных исследований с АОР 1,5 х 10-6 М/л — индуктором показывают нарушения в 92 ±
2,2% случаев всех обследованных лиц с ХМПЗ, также в виде угнетения (рис. 5).
I тип: полное угнетение агрегатограм-мы (35 ± 3,9%) при воздействии АОР (также, как и с адреналином) может быть следствием нарушения взаимодействия индуктора с клеточными гликопротеидами как на начальном этапе связывания с рецепторами, так и на любой другой стадии сложной цепи прохождения сигнала внутрь клетки.
II тип: ответ неполный, обратимый (43 ± 4%). Так как 1,5 х 10-6 М/л АОР — агрегация должна носить двухфазный характер, то обратимость агрегационной кривой показывает на то, что образующиеся агрегаты рыхлые, непрочные, легко разрушаются и недостаточно фиксируются.
N — нормальная контрольная кривая, I, II, III — типы агрегационных кривых
Рис. 5. Основные типы агрегационных кривых при хронических миелопролиферативных заболеваниях в ответ на АОР 1,5 х 10-6 М/л
Похоже, что на этом этапе останавливается дальнейшая активация тромбоцитов вследствие одного или сочетания нескольких дефектов, рассмотренных выше. В итоге — нестабильные клеточные агрегаты распадаются.
III тип: ответ неполный, угнетение второй волны (14 ± 2,8%). По механизму схож с III типом адреналин-агрегации. Возможно, еще одной причиной этого нарушения может быть дефект «каскадного механизма» активации тромбоцитов.
Коллаген-агрегация была сохранена во всех рассмотренных нозологиях. Коллаген — один из мощнейших внешних факторов активации тромбоцитов. Этот агонист отражает синтез тромбоксана А2 и тромбоцитарную секрецию, что дает право предположить о сохранении реакции высвобождения при ХМЛ и ИП.
Таким образом, обнаруженные нами дефекты в тромбоцитарном гемостазе чаще всего проявляются в виде разной степени угнетения ответа. Необходимо отметить, что нами не было выявлено связи между степенью нарушения клеточного гемостаза и количеством участвующих в нем тромбоцитов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Клиническая онкогематология / под ред. Волковой М.А. — М., 2001.
2. Руководство по гематологии / В 3 т. / Под ред. А. И. Воробьева. —М., 2002. — Т. 1.
3. Иванов, Е. П. Руководство по гемостазиоло-гии / Е. П. Иванов. — Мн. : Беларусь, 1991.
4. Цвирко, Д. Г. Дисфункция фибринолиза как компонент системной реакции гемостаза при лейкозах: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Мн., 1990. — 26 с.
5. Degos, L. Malignant Haematology / L. Degos, D. Linch, B. Lowenberg. — London, 1999.
Поступила 3.11.2006
