CC BY
45
УДК 579.66:663.18
М. Д. Шустов*, Ю. С. Галеева, И. А. Шевченко, А. С. Дерунец, А. В. Белодед
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская пл., д.9 * e-mail: shustoffmax@yandex.ru
СИНТЕЗ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ КЛЕТКАМИ LACTOBACILLUS PARACASEI, ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ В КАЛЬЦИЙ-АЛЬГИНАТНОМ ГЕЛЕ
Клетки Lactobacillus paracasei, иммобилизованные в гранулах кальций-альгинатного геля, использовались в качестве биокатализатора для сбраживания растворов глюкозы в молочную кислоту. Было обнаружено, что данный способ иммобилизации не снижает бродильной активности клеток, а кальций-альгинатный гель не создает значительных диффузионных преград для субстрата и продуктов метаболизма клеток. Также было установлено, что в растворах с высокой концентрацией молочной кислоты (свыше 63 г/л) гранулы кальций-альгинатного геля разрушаются менее чем за сутки использования.
Ключевые слова: молочная кислота, Lactobacillus paracasei, иммобилизованные клетки микроорганизмов, кальций-альгинатный гель.
Молочная кислота широко используется в различных отраслях народного хозяйства, в первую очередь, в пищевой промышленности. Последнее время интерес к молочной кислоте обусловлен возможностью получения из неё полилактида -полимера, являющегося основой биодеградируемого пластика, что дает возможность применять его в медицине, а также в качестве материала для изготовления одноразовой посуды и упаковки, не наносящей вред окружающей среде [1].
В настоящее время существуют технологии получения молочной кислоты, как на основе химического синтеза, так и при помощи ферментации различного сырья молочнокислыми микроорганизмами. Причем последние способы получают предпочтение из-за роста стоимости углеводородного сырья для химического синтеза и экологически неблагоприятных аспектов
крупнотоннажных химических производств. Также следует отметить тот факт, что биотехнологические способы получения молочной кислоты в большинстве случаев позволяют получать определенный оптический изомер (либо L(+), либо D(-)), тогда как при химическом синтезе неизбежно образование рацемической смеси (DL), что не позволяет достичь достаточно высоких прочностных характеристик полилактида [2]. Применение в биотехнологиях иммобилизованных клеток микроорганизмов обладает значительными преимуществами, такими как существенное упрощение операций по отделению продукта, многократное использование иммобилизованного биокатализатора при непрерывном
культивировании, возможность повышения концентрации биомассы в единице рабочего объема реактора, а также увеличение устойчивости биомассы к инактивирующим внешним воздействиям и даже снижение риска контаминации посторонней микрофлорой [3].
Целью данной работы являлось получение иммобилизованных в кальций-альгинатном геле клеток Lactobacillus paracasei, изучение динамики сбраживания глюкозы свободными и иммобилизованными клетками, исследование стабильности полученного кальций-альгинатного геля в присутствии высоких концентраций молочной кислоты.
Для иммобилизации использовалась отмытая от культуральной жидкости суспензия клеток, полученная путем выделения биомассы из 24-ех часовой культуры L. paracasei, выращенной на среде MRS. Клетки смешивали с раствором альгината натрия и прокапывали в раствор хлорида кальция таким образом, чтобы диаметр образующихся сферических гранул кальций-альгинатного геля с включенными в них клетками не превышал 2-3 мм [4]. После формирования гранулы выдерживались в растворе хлорида кальция в течение 60 минут при температуре 37 оС для улучшения их прочностных характеристик. Затем полученные гранулы были перенесены в свежеприготовленную питательную среду состава (г/л): глюкоза - 100, дрожжевой экстракт - 7,5, K2HPO4 - 2, MgSO4*7^O - 0,1, MnSO4*4H2O - 0,05. Для сравнения с иммобилизованными клетками использовалось равное количество свободных клеток L. paracasei, также отмытых от старой культуральной жидкости и помещенных в свежую питательную среду. И свободные, и иммобилизованные клетки инкубировались в термостате при 37 оС в течение как минимум 30 часов. В растворах периодически определялись концентрации глюкозы и молочной кислоты, рН. Результаты исследования представлены на рис. 1, 2.
Брожение в обоих случаях начиналось сразу же после внесения свежей питательной среды с максимальной скоростью, какая-либо заметная лаг-фаза отсутствовала. Это свидетельствует о высокой активности клеток и позволяет сказать, что данный
способ иммобилизации не снижает ее, клеткам не требуется адаптации к полимерному и ионному окружению, питательной среде. Из рис. 1, 2 видно, что кривые потребления субстрата и накопления продукта для свободных и иммобилизованных клеток практически совпадают, следовательно, иммобилизация клеток L. рагаеа8е1 в кальций-альгинатном геле не приводит к каким-либо ощутимым диффузионным затруднениям для доступа питательных веществ к клеткам и выведения метаболитов из гранул геля.
Брожение завершалось при накоплении в среде молочной кислоты свыше 13-13,5 г/л, что сопровождалось снижением рН до 3,3 (для иммобилизованной культуры) и 4,0 (для свободных клеток). При этом было замечено, что иммобилизованные клетки дольше проявляли активность и сбраживали глюкозу при падении рН среды, что позволяет говорить о некотором защитном эффекте геля.
14 ж
102
■ 100
■ 96
■ 86
Концентрация молочной кислоты
•Концентрация глюкозы
Рис. 1. Брожение, осуществляемое клетками L. рагасаэе^ иммобилизованными в кальций-альгинатном геле
Концентрация молочной кислоты
* Концентрация глюкозы
Рис. 2. Брожение, осуществляемое свободными клетками L. Рагаса8е1
Для проверки стабильности гранул кальций-альгинатного геля в присутствии высоких концентраций молочной кислоты к
иммобилизованным клеткам вносили
концентрированные раствора лактата аммония с таким расчетом, что конечная концентрация по молочной кислоте составляла от 10,1 до 113,5 г/л. Результаты эксперимента приведены в табл. 1.
Постепенное разрушение геля происходило в результате ионно-обменных процессов: в области высоких концентраций молочной кислоты ионы кальция вымываются из полимерной матрицы
альгината и связываются лактат-анионами в малорастворимую соль, вследствие чего твердая структура геля разрушается.
Таким образом, иммобилизация клеток L. paracasei в кальций-альгинатном геле не приводит к снижению активности биомассы и диффузионным затруднениям, но применение такого иммобилизованного биокатализатора ограничено в условиях высоких концентраций молочной кислоты.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (Ю проекта: RFMEFI57714X0037).
Таблица 1. Разрушение гранул кальций-альгинатного геля в присутствии лактата аммония
Концентрация молочной кислоты, г/л 10,1 29,9 63,1 94,6 113,5
Время разрушения гранул Стабильны более 5 суток Стабильны более 5 суток 24 часа 60 мин. 30 мин.
Шустов Максим Дмитриевич, студент 2 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Галеева Юлия Сергеевна, студентка 2 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Шевченко Ирина Александровна, студентка 3 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Дерунец Алиса Сергеевна, аспирантка кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Белодед Андрей Васильевич, к.б.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Литература
1. Datta R. et al. Technological and economic potential of poly (lactic acid) and lactic acid derivatives //FEMS
Microbiology Reviews. - 1995. - Т. 16. - №. 2-3. - С. 221-231.
2. Wee Y. J. et al. Batch and repeated batch production of L (+)-lactic acid by Enterococcus faecalis RKY1 using
wood hydrolyzate and corn steep liquor //Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2006. - Т. 33.
- №. 6. - С. 431-435.
3. Синицын А. П. и др. Иммобилизованные клетки микроорганизмов //М.: Издательство МГУ.-1994.-288 с. - 1994.
- C. 10-11.
4. Idris A., Suzana W. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid
production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii //Process Biochemistry. - 2006. - Т. 41.
- №. 5. - С. 1117-1123. "
ShustovMaxim Dmitrievich*, Galeeva Julia Sergeevna, Derunets Alisa Sergeevna, Shevchenko Irina Alexandrovna, Andrey Vasilyevich Beloded
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia * e-mail: shustoffmax@yandex.ru
SYNTHESIS OF LACTIC ACID WITH CELLS OF LACTOBACILLUS PARACASEI IMMOBILIZED IN CALCIUM ALGINATE GEL
Abstract
Lactobacillus paracasei cells immobilized in calcium alginate gel granules were used as the biocatalyst for glucose solutions fermentation to lactic acid. It was stated, that this way of immobilization does not reduce fermentation activity of the cells and calcium alginate gel does not make significant diffusive barriers for substrate and the products of cells metabolism. It was also stated that in the solutions with high lactic acid concentrations (over 63 g/l) the granules of calcium alginate gel destruct in less than 24 hours of use.
Key words: lactic acid, Lactobacillus paracasei, immobilized cells of microorganisms, calcium alginate gel.
