CC BY
41
EXPERIMENTAL ARTICLES
УДК 557.161.2+612.017.1:616-097
doi: 10.15407/biotech8.03.045
СИНТЕЗ КОН’ЮГАТА 25-ГІДРОКСИВІТАМІНУ D3 З ГЕМОЦІАНІНОМ МОЛЮСКА ТА ОДЕРЖАННЯ
ІМУННИХ СИРОВАТОК
А. О. Мазанова
І. О. Шиманський
Д. М. Петухов Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна
Л. Б. Дробот НАН України, Київ
М. М. Великий
С. В. Комісаренко
E-mail: ann.mazanova@gmail.com
Отримано 30.04.2015
Метою роботи було отримання поліклональних антитіл, які розпізнають 25-гідроксивітамін D3, для їх подальшої характеристики і застосування в імунохімічних тест-системах визначення вмісту 25-гідроксивітаміну D3 у сироватці крові. Було використано методи хімічного синтезу імунокон’ю-гатів (модифікований карбодиімідний метод із застосуванням N'-етил-карбодиіміду), тонкошарової хроматографії та гель-фільтрації, а також непрямого імуноензимного аналізу ELISA. Описано етапи синтезу імунокон’югата 25-гідроксивітаміну D3 з гемоціаніном молюска KLH, який використовували для отримання імунних сироваток. У результаті імунізації мишей і кролів одержано антисиро-ватки, в яких визначали титри антитіл проти 25-гідроксивітаміну D3 методом імуноензимного аналізу. Було продемонстровано, що титр специфічних антитіл вищий у кролів порівняно з мишами. Отримані поліклональні антитіла можуть бути використані для створення імунохімічних тест-систем скринінгового визначення вмісту 25-гідроксивітаміну D3 у сироватці крові людини як маркера забезпеченості організму вітаміном D3.
Ключові слова: 25-гідроксивітамін D3, гаптени, імуноензимний аналіз, поліклональні антитіла.
На сьогодні дедалі більшої практичної ваги набуває удосконалення методів одержання моно- та поліклональних антитіл до різних антигенів, оскільки антитіла широко застосовують у проведенні наукових досліджень включно з імуноензимним аналізом (ELISA), імуноблотингом, конструюванням імуноліпосом, а також для діагностування й терапії різних захворювань. Оптимізація підходів до отримання, очищення та напрацю-вання у значних кількостях імуноглобулінів, специфічних до різноманітних антигенів, має важливе значення як для фундаментальних, так і для прикладних досліджень, зокрема для розроблення імунодіагностичних тест-систем для потреб медицини [1].
Імунохімічний аналіз має багато переваг порівняно з іншими видами аналізу, зокрема з методом радіоконкурентного зв’язування, високоефективної рідинної хроматографії, поєднаної з мас-спектрометрією тощо [2]. Він є відносно дешевим, а результати, які отри-
мують на основі проведення імунохімічної реакції, є специфічними, точними та репрезентативними. Проте головною перевагою методів, що ґрунтуються на імуноспецифіч-ній взаємодії між антигеном та антитілом і широко застосовуються в імунодіагностичних цілях, є відсутність етапу пробопідготов-ки зразка, в якому визначають вміст тієї чи іншої сполуки. Це дає змогу економити час, реагенти та запобігти втраті цільового антигену на кожному етапі очищення. Саме тому цей вид аналізу набув широкого застосування у харчовій промисловості, лабораторній діагностиці, наукових дослідженнях тощо. Наразі актуальним залишається пошук способів оптимізації шляхів отримання антитіл до різноманітних антигенів та розроблення тест-систем, в основі яких лежить імунохі-мічна взаємодія «антиген-антитіло».
За даними останніх епідеміологічних досліджень, проведених спеціалістами Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ) та
45
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
IOF (International Osteoporosis Fundation), ситуацію щодо недостатньої забезпеченості населення вітаміном D3 можна розглядати як пандемічну для більшості країн світу [3]. За оцінками Інституту медицини Національної академії США (2011 р.), дефіцит вітаміну D3 спостерігається у більш ніж 40% популяції американців усіх верств населення та сягає 80% у людей похилого віку, що зумовлює їхню схильність до розвитку численних захворювань, передусім остеопорозу. Ця патологія, на думку експертів ВООЗ, займає четверте місце в рейтингу основних медико-соціальних проблем сучасності. Згідно з даними ВООЗ, у найбільш розвинених країнах Європи, США, Японії сукупна кількість людей, які хворіють на остеопороз, досягає 75 млн. людей. Тільки в США остеопороз визначається у 30% жінок [4].
Враховуючи дослідження останніх років, вітамін D3 розглядають не тільки як сполуку, що впливає лише на мінеральний обмін і застосовується переважно для лікування порушень опорно-рухового апарату. Встановлено, що активні метаболіти вітаміну D3 регулюють проліферацію та диференціювання клітин, функціональну активність практично всіх органів і систем організму, а також синтез протеїнів, ліпідів, гормонів та інших фізіологічно активних сполук [5-7]. Активні метаболіти вітаміну D3 в організмі людини впливають практично на всі механізми неспецифічного захисту від інфекційних агентів та на систему імунної специфічної відповіді, визначаючи таким чином ефективність знешкодження інфекційних агентів і характер запальних і автоімунних процесів [8-10].
Біомаркером забезпеченості організму вітаміном D3 є вміст 250HD3 у сироватці крові, який у нормі становить 100-150 нмоль/л, а за розвитку вітамін D3-дефіцитних станів може знижуватись до рівня менше ніж 50 нмоль/л. Вміст 250HD3 нижче 75 нмоль/л характеризується як D-гіповітаміноз, нижче 50 нмоль/л — вітамінна недостатність і нижче 30 нмоль/л — глибокий дефіцит вітаміну D3 [3]. Отже, визначення рівня цього гід-роксильованого похідного згідно з висновками провідних спеціалістів є вкрай важливим як для характеристики стану забезпеченості організму вітаміном D3, так і для оптимізації призначення препаратів вітаміну D3.
Враховуючи наведені вище дані, розроблення тест-систем, які б давали змогу визначати рівень 250HD3 у біологічному матеріалі, є перспективним напрямом біомедичних досліджень. Однак проблемою створення таких тест-систем є саме етап отримання антитіл до
активної форми холекальциферолу, оскільки останній не є імуногенною сполукою з розміром молекули, недостатнім для того, аби бути розпізнаним імунною системою. Крім того, 250HD3 є сполукою, яка в нормі синтезується в організмі більшості тварин, зокрема й тих, які підлягають імунізації для продукування антитіл проти 250HD3, що створює додаткові перешкоди для отримання специфічних імуноглобулінів.
З метою вирішення цієї проблеми вже розроблено методи та методичні підходи, що дають змогу створювати імунокон’югати типу «гаптен-протеїновий носій». Імунізація ними лабораторних тварин уможливлює отримання поліклональних сироваток та гібридом, які продукують моноклональні антитіла, що в подальшому може бути використано для розроблення імунодіагностику-мів [11].
Отже, метою цієї роботи було синтезувати кон’югат похідного 250HD3, що містить активну карбоксильну групу, з протеїном-но-сієм гемоціаніном молюска (KLH) для одержання поліклональних антитіл, які розпізнають 250HD3, й порівняння титру цих антитіл у кролів та мишей, імунізованих синтезованим кон’югатом. Для реалізації поставленої мети було вирішено такі завдання: 1 — отримано похідні 250HD3 з активною карбоксильною групою; 2 — синтезовано кон’югат похідного 250HD3, що містить активну карбоксильну групу, з протеїнами-но-сіями — гемоціаніном молюска (KLH) та альбуміном курячого яйця (OVA); 3 — здійснено імунізацію кролів та мишей створеним кон’югатом 250HD3 з гемоціаніном; 4 — охарактеризовано одержані поліклональні антисироватки методом непрямого імуно-ензимного аналізу, визначено титр імуногло-булінів до 250HD3 та проведено порівняння ефективності вироблення специфічних іму-ноглобулінів у організмі мишей і кролів.
Матеріали і методи
Реагенти та обладнання Для синтезу кон’югатів використовували 25-гідроксивітамін D3 (Sigma, USA), абсолютний піридин (Sigma, USA), бурштиновий ангідрид (Sigma, USA), етилацетат (Sigma, USA), безводний сульфат натрію (Sigma, USA), безводний дихлорметан (Sigma, USA), Щ3-диметиламінопропіл)-№-етил-карбо-диімід (Sigma, USA), N-гідроксисукцинімід (Sigma, USA), гемоціанін (Sigma, USA) та альбумін курячого яйця (Sigma, USA).
46
Experimental articles
Імунізацію кролів і мишей проводили
3 використанням повного й неповного ад’ю-ванту Фрейнда (Sigma, USA).
Для здійснення ELISA-скринінгу сироваток піддослідних тварин застосовували вторинні антикролячі та антимишачі антитіла, які розпізнають цілу молекулу IgG (Sigma, USA). Як субстрат для пероксидази хрону використовували ортофенілендіамін (Sigma, USA). Високосорбційні 96-лункові планшети отримували від фірми Greiner Microlon. Спектрофотометричні вимірювання проводили на мікропланшетному ридері ER-500 (BioRad).
Синтез 25-гідроксивітамін-В3-3-гемісук-цинату
Для синтезу 25-гідроксивітамін-Б3-3-ге-місукцинату розчиняли наважку (10 мг, 25 мкмоль) 25-гідроксивітаміну D3 в абсолютному піридині (1 мл) і перемішували за кімнатної температури в темряві упродовж
4 днів за присутності бурштинового ангідриду (125 мг, 1,25 мкмоль). До реакційної суміші додавали етилацетат (10 мл) і в кожному випадку промивали двічі водою та 0,1 М соляною кислотою. Органічну фазу висушували,
використовуючи безводний сульфат натрію (1 г), фільтрували й видаляли розчинник під вакуумом. Залишкову тверду масу висушували під глибоким вакуумом. У результаті реакції отримували безбарвну тверду речовину (рис. 1).
Синтез 25-гідроксивітамін-В3-3-гемісук-цинат-N-гідроксисукцинімідного ефіру
На наступному етапі отриманий 25-гід-роксивітамін D3-3-гемісукцинат розчиняли в безводному дихлорометані (7 мл) і змішували з N-гідроксисукцинімідом (2,76 мг, 24 мкмоль) та Щ3-диметиламінопро-піл)-№-етил-карбодиімідом (EDC) (3,72 мг, 24 мкмоль). Суміш перемішували упродовж ночі під аргоном. Потім органічну фазу двічі промивали водою, висушували за допомогою безводного сульфату натрію та фільтрували. Розчинник видаляли під вакуумом і отриманий продукт висушували упродовж ночі під глибоким вакуумом. Таким чином отримували 25-гідроксивітамін D3-3-гемісук-цинат^-гідроксисукцинімідний ефір, який використовували для кон'югування без подальшого очищення (рис. 2).
Рис. 1. Синтез
25-гідроксивітамін-Б3-3-гемісукцинату
/4м
СІ н
+ /\ = с = мА^'|І -
25-гідроксивітамін Dз-3-гемісукцинат
дихлорметан N-гідроксисукцинімід
EDC
25-гідроксивітамін Dз-3-гемісукцинат-N-гідроксисукцинімідний ефір Рис. 2. Синтез 25-гідрокеивітамін-В:і-3-геміеукцинат-]Ч-гідрокеиеукцинімідного ефіру
47
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
Синтез 25-гідроксивітамін-В3-3-гемісук-цинату-KLH
Для синтезу кон’югата 25-гідроксиві-тамін-Dg з гемоціаніном або з альбуміном курячого яйця наважку протеїну (64 мг) розчиняли в 0,1 М K-фосфатному буфері, рН 8,0 (12,5 мл), та додавали N-гідроксисукцині-мідний ефір (6 мг) в DMSO (1,3 мл). Суміш перемішували упродовж ночі за кімнатної температури (рис. 3.).
Очищення кон’югатів
Одержані продукти очищували гель-філь-трацією на колонці Econo-Pac 10DG, об’ємом 0,01 л, врівноваженій в 0,1 М K-фосфатному буфері, рН 7,0. Колонку промивали K-фос-фатним буфером (рН 7,0), використовуючи об’єм буфера, що дорівнює двом об’ємам колонки. Отриманий кон’югат об’ємом 6,5 мл вносили до колонки, збираючи фракції в конічні пробірки об’ємом 1 мл кожна. Фракції, що містили кон’югований протеїн, детекту-вали за 256 нм [11].
Тонкошарова хроматографія продуктів омилення 25-гідроксивітамін-В3-3-гемісук-цинат-KLH/OVA
Принцип методу полягає в омилюванні препарату за допомогою спиртового розчину KOH, екстрагуванні 25OHD3 гексаном, аналізі екстракту тонкошаровою хроматографією в системі розчинників та ідентифікації в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм з наступним фарбуванням плям сумішшю FeCl3 у 50% H2SO4. Кількість 25OHD3 визначали за стандартом, вираховуючи площу піків.
Для омилювання в колбу вносили 0,2 мл (0,714 мг) розчину кон’югата, додавали 2 мл фосфатного буфера (рН 7,4), вносили 300 мг антиоксиданту (аскорбінової кислоти). Антиоксидант додавали до проби перед внесенням KOH. Далі вносили 10 мл 10 М розчину гідроксиду калію в метанолі. Омилювання проводили за кімнатної температури протягом 12 год без доступу світла.
Під час екстрагування для уникнення утворення емульсії до омилюваного розчину додавали дистильовану воду, щоб співвідношення спирту до води було 1:1. 25OHD3 екстрагували з охолодженої суміші гексаном. У ділильну воронку додавали 10 мл гексану та струшували упродовж 5 хв. Після розділення шарів гексановий шар відбирали. Екстрагування повторювали тричі. Гексанові фракції об’єднували, промивали дистильованою водою до нейтральної реакції промивної води, висушували над сульфатом натрію протягом 40 хв і фільтрували. Отримані екстракти упарювали на роторному випаровувачі за температури водяної бані 40 °С до сухого залишку, який потім розчиняли в 0,2 мл гексану.
Для проведення хроматографії на лінію старту пластини «Силуфол-254» розміром 15x15 см наносили 0,1 мл та 0,5 мл розчину проби (2 точки) і три точки стандартного розчину по 20, 10 та 5 мкг 25OHD3 в 0,1 мл. Пластинку висушували на повітрі протягом 3 хв. Потім її вміщували в камеру із сумішшю розчинників бензол:ацетон (93:7) та проводили хроматографію. Коли фронт розчинника доходив до кінця пластинки, її виймали й висушували протягом 20 хв. Позначали плями, що відповідали 25OHD3, проглядаючи пластину в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм, з наступним проявленням за допомогою розчину FeCl3 у 50% H2SO4. Кількість 25OHD3 визначали за стандартом, аналізуючи площу піків.
Імунізація мишей кон’югатом 25ОНБ3-гемісукцинат-KLH та отримання полікло-нальних сироваток
Для імунізації використовували білих мишей-самиць лінії Balb/c масою 18-20 г. Тварин утримували у стандартних клітках на стандартному раціоні віварію.
Серед фракцій отриманого кон’югата обирали ті, у яких співвідношення протеїну до 25OHD3 було найвищим. Під час першої іму-
25-гідроксивітамін Б3-3-гемісукцинат- 25-гідроксивітамін Dз-3-гемісукцинат-KLH
N-гідроксисукцинімідний ефір
Рис. 3. Синтез 25-гідроксивітамін-Б3-3-гемісукцинат-КЬН
48
Experimental articles
нізації синтезований кон’югат 25OHD3-KLH розводили у фосфатному буфері (рН 7,4) з розрахунку 100 мкг протеїну на 100 мкл PBS. До отриманого об’єму додавали повний ад’ювант Фрейнда (CFA) у співвідношенні 1:1. Мишей імунізували, вводячи у черевну порожнину 200 мкл отриманої стабільної емульсії. Наступні чотири імунізації проводили за описаною вище схемою, замінюючи CFA на неповний ад’ювант Фрейнда (IFA). Інтервал між імунізаціями становив 21 день. Через тиждень після останньої імунізації у мишей відбирали кров із хвоста й одержували сироватку. Для визначення титру іму-ноглобулінів до 25OHD3 проводили імуноен-зимний аналіз. Усі маніпуляції з тваринами здійснювали під легким ефірним наркозом згідно з правилами поводження з лабораторними тваринами.
Імунізація кролів кон’югатом 25ОНБ3-ге-місукцинат-KLH та одержання полікло-нальних сироваток
Для імунізації використовували двох дорослих кролів-самиць масою 3,5-4 кг, яких утримували за стандартних умов віварію.
Першу імунізацію здійснювали за такою схемою. Розрахований об’єм розчину кон’ю-гата, що містив 100-150 мкг антигену (за вмістом протеїну) доводили до 1000 мкл PBS (рН 7,4), додавали 1000 мкл CFA, після чого емульгували. Отриману емульсію вводили підшкірно вздовж хребта кроля, обираючи по 4 точки з кожного боку від хребта на відстані 1 см одна від одної. Другу імунізацію проводили через 8 тижнів, а третю — через 1 міс після другої. Далі відбирали кров із вуха кроля й отримували сироватку для подальшого визначення титру імуноглобулінів за допомогою імуноензимного аналізу. Усі маніпуляції проводили під легким ефірним наркозом згідно з правилами поводження з лабораторними тваринами.
Проведення непрямого імуноензимного аналізу ELISA для оцінювання титру антитіл до 25OHD3 у сироватці крові кролів та мишей
У полістиролові 96-лункові плоскодонні планшети вносили кон’югат 25OHD3-OVA, який попередньо розчиняли у фосфатному буфері (PBS, pH 7,4) з розрахунку 1 мкг/100 мкл та інкубували упродовж ночі за 4 °С. Після інкубування лунки планшета промивали тричі Твін-фосфатним буфером (PBST, PBS + 0,1% Tween20), додаючи до кожної лунки 200-300 мкл останнього. Далі лунки планшета відмивали за цією самою схемою після
кожного етапу інкубування. Вільні центри зв’язування блокували, додаючи в кожну лунку PBST з розрахунку 200 мкл на лунку й інкубували протягом 1 год за 37 °С. Робили серію розведень 1:100-1:1 000 000 для сироватки крові кролів та 1:100-1:1 600 для сироватки крові мишей. З метою контролю специфічності імунної відповіді паралельно проводили аналіз сироваток неімунізованих тварин.
Вносили по 100 мкл кожного розведення сироватки у дві паралельні лунки та інкубу-вали впродовж 1 год за 37 °С. Потім додавали відповідні вторинні антитіла (розведення 1:1 000, 0,1 мл на лунку) (Sigma, USA) та інкубували 1 год за 37 °С. Специфічне комплексоутворення «антиген-антитіло» визначали за допомогою кольорової реакції з використанням ортофенілендіаміну (OPD): 2 мг OPD розчиняли у 4 мл К-фосфатного буфера (pH 6,0) з подальшим додаванням 8 мкл Н2О2, вносячи по 100 мкл розчину субстрату в лунку. Реакцію зупиняли через 30 хв, додаючи 4н H2SO4 (50 мкл на лунку). Детектування сигналу проводили на ридері ER-500 (BioRad) за довжини хвилі 492 нм.
Результати та обговорення
На сьогодні антитіла широко застосовують для вирішення багатьох актуальних проблем біології та медицини. Ключовим етапом у процесі отримання антитіл до не-імуногенних сполук малого розміру є синтез кон’югата гаптену з імуногенним носієм [1215]. Синтезованим імуногенним кон’югатом здійснюють імунізацію тварин (зазвичай це кролі, миші, вівці, щури) для одержання сироватки або селезінки. З метою отримання поліклональних імуноглобулінів (PAbs) імунізують зазвичай великих тварин, таких як кролі, вівці. Поліклональні антитіла мають низку як переваг, так і недоліків. До переваг можна віднести відносну дешевизну їх одержання, зумовлену можливістю достатньо швидкого отримання значної кількості поліклональних антитіл порівняно з моно-клональними антитілами; здатність реагувати з різними епітопами однієї і тієї самої молекули. Серед недоліків PAbs можна виділити такі: вміст поліклональних антитіл до конкретного антигену може змінюватися від партії до партії отриманої антисироватки; поліклональні антитіла не можна використовувати у дослідженнях, метою яких є виявлення відмінностей та/або визначення вмісту споріднених молекул.
49
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
Вибір протеїну-носія для кон’югування з 25OHD3
Ключовою проблемою під час отримання антитіл до малих молекул є те, що останні є гаптенами, тобто молекулами, які не мають імуногенності й набувають її лише в комплексі з протеїном-носієм. Уперше гаптени було описано в 1945 р. у роботі Карла Ландштайнера. Протеїном-носієм слугує молекула, яка сама по собі може викликати імунну відповідь. Традиційно як носії використовують молекули великих протеїнів. Після того як в організмі тварини утворюються антитіла до пари гаптен-носій, гаптени можуть також зв’язуватися з антитілом, але самі гаптени не здатні ініціювати імунну відповідь. Іноді гаптени можуть навіть блокувати імунну відповідь на кон’югат гапте-ну з носієм; цей процес має назву «гаптенове інгібування». Причини відсутності імунної реакції можуть бути різними і включати складні імунологічні механізми, одним з яких може виступати відсутність або недостатність костимуляторних сигналів від антигену, що представлений клітинами ан-тигенпрезентувального ряду. Для правильного обрання носіїв слід враховувати такі їхні характеристики [15]:
1. Розмір. Протеїни, що мають розміри більші за 60 кДа, є кращими носіями, ніж менші молекули, оскільки вони містять більшу кількість функціональних груп (-NH2, -SH, -СООН і т. д.), придатних для процесу кон’югування з гаптеном. Зазвичай великий розмір дає змогу приєднувати до однієї моле-кули-носія значну кількість молекул гаптену.
2. Генетична віддаленість обраної для імунізації тварини. Як протеїн-носій використовують гемоціанін лімфи молюска (KLH), великий протеїн черевоногих, яким імунізують мишей, кролів, кіз, овець та ін. Іншими молекулами, широко застосовуваними як носії, є група протеїнів бактеріального походження: правцевий токсин (TT), очищений токсин туберкульозу (PPD) і дифтерійний анатоксин. Менш ефективними для ссавців є альбумін курячого яйця (OVA) і бичачий сироватковий альбумін (BSA), ймовірно, через толерантність організмів ссавців до цих висококонсервативних протеїнів.
Ще одним протеїном, який використовують як носій, є курячий у-глобулін (CGG). Протеїн є досить імуногенним для мишей, але його суттєвий недолік полягає в тому, що CGG містить важливий імунодомінантний епітоп, наявність якого сприяє виробленню антитіл, які перехресно реагують з імуногло-булінами людини.
Отже, властивості протеїну-носія можуть суттєво впливати на результати імунізації. Оскільки нашою метою було отримання великої кількості сироватки з якомога вищим титром імуноглобулінів до 250HD3, то насамперед ми провели порівняння імуногенних властивостей можливих протеїнів-носіїв, враховуючи вищенаведені характеристики. Як носій було обрано KLH, адже великі протеїни (> 600 кДа) мають притаманну самій молекулі ад’ювантну активність, що сприяє інтенсифікації імунної відповіді. Крім вищезазначеного, гемоціанін молюсків містить значну кількість доступних для кон’югу-вання груп і є генетично віддаленим від тварин, яких імунізують (кролі, миші). Також у структурі KLH містяться Т-клітинні епіто-пи, які можуть бути представлені молекулами МНС класу II різних видів тварин, що є вкрай важливим для розвитку повноцінної імунної відповіді.
Для подальшого проведення імуноензим-ного аналізу було синтезовано кон’югат 25-гідроксивітаміну D3 з OVA [16]. Хоча альбумін курячого яйця і має порівняно велику молекулярну масу (45 кДа, 385 а.к.з.), використання його як імуногенного протеїну-но-сія вважали недоцільним, оскільки OVA є менш еволюційно віддаленим від протеїнів кроля, ніж KLH [17]. Цей кон’югат було застосовано для тестування сироваток як покриття лунок планшета з метою запобігання крос-реактивності імуноглобулінів з протеї-ном-носієм (KLH).
Вибір способу кон’югування 25OHD3 з KLH/OVA
Наступним кроком було обрання шляху синтезу кон’югатів 25-гідроксивітаміну D3-KLH/OVA. На сьогодні відомо декілька методів кон’югування молекул-гаптенів із протеїнами носіями: модифікований карбо-диімідний метод з використанням EDC [18], глутаральдегідний метод [19], модифікований карбодиімідний метод активних ефірів [20, 21], модифікований формальдегідний метод [22], приєднання через полігліциновий лінкер(Gly4)[23]та ін.
Для нашого дослідження обрали модифікований карбодиімідний метод з використанням ^(3-диметиламінопропіл)-№-етил-кар-бодиіміду (EDC). Цю сполуку в хімічному синтезі використовують для активації карбоксильної групи [24] молекули, що бере участь у реакції, для подальшого утворення амідного зв’язку. Однією з переваг методу є можливість проводити реакцію у водних та спиртових розчинах. Це важливо у разі
50
Experimental articles
використання нерозчинних у воді гаптенів, до яких належить обраний нами цільовий антиген — 25ОНDз. EDC можна застосовувати як для водних розчинів, так і для роботи з органічними розчинниками, тимчасом як його аналог — дициклогексил-карбодиімід — лише для органічних. В основі дії карбоди-імідів лежить активація карбоксильної групи для прямої реакції з первинними амінами і подальшим утворенням амідного зв’язку. Оскільки жодна з частин карбодиіміду не стає в кінцевому підсумку частиною кон’ю-гата, ці сполуки називають «нульовими» крослінкерами (zero-length carboxyl-to-amine crosslinkers).
Для введення карбоксильної групи у третьому положенні 250HD3 було використано N-гідроксисукцинімід.
Спектрофотометричний аналіз одержаних кон’югатів 25OHD3-KLH/OVA
Для характеристики отриманих кон’югатів застосовували спектрофотометричний метод, який базується на вивченні спектрів поглинання молекул в ультрафіолетовій (200-400 нм), видимій (400-760 нм) та інфрачервоній (> 760 нм) ділянках світлового спектра [15, 22, 24, 25].
Було обрано спосіб детекції за наявністю саме карбоксильного похідного 25-гідроксиві-таміну D3 у складі кон’югата, оскільки його ультрафіолетова абсорбція ґрунтується на хімічній особливості стероїдів групи вітамінів D — наявності спряженої трієнової системи подвійних зв’язків та поглинанні в УФ-спектрі за 256 нм.
На рис. 4. показано криву елюції продуктів кон’югування 25-гідроксивітаміну D3 з гемоціаніном, що містить два піки. Перший пік відповідає синтезованому кон’югату, а другий — 25-гідроксивітамін D^-гемісук-цинат-^гідроксисукцинімідному ефіру, який не прореагував з протеїном-носієм.
Рис. 4. Крива елюції кон’югата 25OHD3 з гемоціаніном
Тут і далі наведено результати типового експерименту.
Отримані фракції, які відповідають кон’югату 25-гідроксивітамін D3 з KLH, об’єднували і додавали гліцерол (кінцева концентрація 20%). Було одержано пісча-но-сірий опалесціюючий розчин, який використовували для імунізації кролів та мишей.
Рис. 5 демонструє криву елюції продуктів кон’югування 25OHD3 з альбуміном курячого яйця (OVA). Чітко можна зафіксувати вихід з колонки також двох продуктів, що відображається у наявності двох піків на графіку. Це можна пояснити наявністю двох продуктів в аналізованій суміші.
Перший пік відповідає виходу цільового кон’югата 25OHD3-OVA, а другий — 25-гід-роксивітамін D3-3-гемісукцинат-N-гідрокси-сукцинімідному ефіру, який не прореагував з протеїном-носієм.
Фракції, які містили цільовий кон’ю-гат, об’єднували, додавали до них гліцерол з кінцевою концентрацією 20% та зберігали в холодильнику за -20 °С до подальшого використання.
Тонкошарова хроматографія продуктів омилення 25OHD3-гемісукцинат KLH/OVA
З метою оцінювання достовірності та ефективності синтезу було здійснено перевірку кількості залишків гаптену, включених у кон’югат. Для цього проводили розділення продуктів омилення кон’югата методом тонкошарової хроматографії. Розрахунок кількості 25-гідроксивітаміну D3 за площею плям на хроматографії показав, що у складі 238 мкг кон’югата з гемоціаніном міститься 3 мкг 25-гідроксивітаміну D3 (рис. 6, A). Молярне співвідношення стероїду до гемоціаніну становить приблизно 10/1. Для кон’югата з альбуміном курячого яйця розрахунок площі плям показав, що в складі 202 мкг кон’югата міститься 0,75 мкг 25-гідроксивітамі-ну D3 (рис. 6, Б). Молярне співвідношення
Рис. 5. Крива елюції кон’югата 25OHD3 з альбуміном курячого яйця
51
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
Рис. 6. Результати тонкошарової хроматографії продуктів омилення кон’югата 250HD3 з (А) гемоціаніном (25-гідроксивітамін D3-3-гемісукцинат-гемоціанін), (Б) овальбуміном (25-гідроксивітамін
D3-3-гемісукцинат-овальбумін):
А: 1 — 25ОНDз, що міститься в 238 мкг кон’югата; 2 — 25ОНDз, що міститься в 119 мкг кон’югата;
3 — 30 мкг 250HD3; 4 — 20 мкг 25OHD3; 5 — 10 мкг 250HD3;
Б: 1 — 250HD3, що міститься в 181 мкг кон’югата; 2 — 250HD3, що міститься в 202 мкг кон’югата; 3 — 2,5 мкг 250HD3; 4 — 5 мкг 250HD3; 5 — 10 мкг 250HD3
стероїду до овальбуміну також становить приблизно 10/1. Таким чином, для подальшої роботи нами було обрано фракції обох кон’югатів, де співвідношення протеїн-но-сій/гаптен було найбільшим.
Визначення титру імуноглобулінів до 250HD3 у сироватці крові кролів та мишей
Для характеристики рівня синтезу специфічних імуноглобулінів до 25ОНБ3 визначали титр антитіл. Як відомо, титр — це найбільше розведення сироватки крові, яке дає змогу детектувати сигнал за допомогою будь-якого серологічного методу. Для того щоб визначити титр антитіл до 25ОНБ3 ми застосовували метод непрямого імуноен-зимного аналізу. У лунки 96-лункового по-лістиролового планшета вносили кон’югат 250HD3-OVA, аби запобігти перехресному реагуванню імуноглобулінів сироватки з гемоціаніном, який є протеїном-носієм у синтезованому кон’югаті для імунізації.
Результати аналізу сироватки крові мишей подано на рис. 7. Вони чітко демонструють наявність імунної відповіді на введення кон’югата 250HD3-KLH та наявність антитіл до даного кон’югата в крові мишей. У трьох з п’яти імунізованих тварин імунна відповідь не була інтенсивною, і середній титр становив 1:400. Титр специфічних імуноглобулі-нів у сироватці двох інших тварин становив у середньому від 1:1 000 до 1:1 600. Таку різницю можна пояснити високою спорідненістю гаптену (250HD3) до організму миші та, як наслідок, слабким розвитком імунної відповіді на цю молекулу. Реакція імунної
системи мишей на протеїн-носій була значно вищою, ніж на 250HD3, що й очікувалось, оскільки гемоціанін є генетично віддаленою від організму молекулою обраних тварин (дані не наведено).
На рис. 8 подано дані аналізу титру антитіл до 250HD3 імунної сироватки кролів, що їх отримано методом непрямого імуноензим-ного аналізу ELISA. Hами продемонстровано, що в обох піддослідних тварин наявна реакція імунної системи на пару гаптен-но-сій. Для молекули-носія сигнал був вищий, ніж для молекули-гаптену, що пояснюється генетичною віддаленістю молекули KLH від організму кроля (дані не наведено).
Окрім того, можна стверджувати, що у крові обох піддослідних кролів були наявні антитіла до 25OHD3. ^ основі титрувальних кривих достовірно визначено титр імуногло-булінів сироватки крові кролів до 25OHD3, який становить від 1:1000 до 1:10000.
Порівнюючи отримані дані для тварин різного виду, виявили, що в сироватці крові кролів титр до 25OHD3 вищий, ніж у мишей. Таку різницю можна пояснити імунологічними відмінностями біологічних видів, до яких належать досліджувані тварини.
Окрім того, для кролів та мишей було застосовано різні схеми імунізації, що також істотно впливає на реакцію імунної системи. Як зазначено вище, CFA використовували лише для першої імунізації мишей. У подальшому його заміняли на IFA. Схема імунізації кролів передбачала повторне використання CFA для бустерних імунізацій, що, ймовірно, й зумовило більш істотну реакцію
52
Experimental articles
•Снр4(іТк1 ІфОІІ мнвісй 'Комір оль
Рис. 7. Узагальнювальна крива титрування сироватки мишей, імунізованих 250HD3-KLH, що її отримано методом ELISA в серії розведень:
1 — 1/100; 2 — 1/200; 3 — 1/400; 4 — 1/800; 5 — 1/1 600 Тут і далі: * — P < 0,05 порівняно з контролем
Рис. 8. Титр антитіл до 25ОНD3 у сироватці крові кролів, імунізованих 25ОНD3-KLH
у серії розведень:
1 — 1/100; 2 — 1/1 000; 3 — 1/10 000; 4 — 1/100 000; 5 — 1/1 000 000
імунної системи на пару гаптен-носій і, як наслідок, вищий титр імуноглобулінів до 25OHD3 у сироватці крові кролів.
Таким чином, нами було проаналізовано різні методи кон’югування гаптенів з протеї-нами-носіями, підібрано оптимальний носій для подальшої імунізації кролів та мишей, а також синтезовано кон’югати 25OHD3-KLH/OVA. Проведено імунізацію тварин
отриманим кон’югатом та визначено титр антитіл до 25OHD3 у сироватці крові тварин. Показано, що імунна система як сірих кролів, так і білих мишей лінії Balb/c реагує на кон’югат 25OHD3-KLH. Титр специфічних імуноглобулінів до 25OHD3 є вищим у кролів, що може бути наслідком застосування різних схем імунізації тварин.
REFERENCES
1. Cooper H. M., Paterson Y. Production of polyclonal antisera. Curr. Protoc. Cell Biol. 2001, 2 (2.4), 1-10. doi: 10.1002/0471142735. im0204s13.
2. Zegers N. D. Synthetic peptides for antibody production. Thesis Erasmus Universiteit Rotterdam. 1995, 248 p.
3. Dobnig H. A review of the health consequences of the vitamin D deficiency pandemic. J. Neurol. Sci. 2011, 311 (1-2), 15-18. doi: 10.1016/j.jns.2011.08.046.
4. Wacker M., Holick M. F. Vitamin D — effects on skeletal and extraskeletal health and the need for supplementation. Nutrients. 2013, 5 (1), 111-148. doi: 10.3390/nu5010111.
5. Wang Y, Zhu J., DeLuca H. F. Where is the vitamin D receptor? Arch. Biochem. Biophys. 2012, 523 (1), 123-133. doi: 10.1016/j. abb.2012.04.001.
6. Haussler M. R., Jurutka P. W, Mizwicki M., Norman A. W. Vitamin D receptor (VDR)-mediated actions of 1a, 25(OH)2vitamin
53
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 3, 2015
D3: genomic and non-genomic mechanisms. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2011, 25 (4), 543-559. doi: 10.1016/j. beem.2011.05.010.
7. Takeyama K., Kato S. The vitamin D3 1alpha-hydroxylase gene and its regulation by active vitamin D3. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011, 75 (2), 208-213.
8. White J. H. Regulation of intracrine production of 1,25-dihydroxyvitamin D and its role in innate immune defense against infection. Arch. Biochem. Biophys. 2012, 523 (1), 58-63. doi: 10.1016/j.abb.2011.11.006.
9. Guillot X., Semerano L, Saidenberg-Kerma-nach N., Falgarone G., Boissier M. C. Vitamin D and inflammation. Joint Bone Spine. 2010, 77 (6), 552-557. doi: 10.1016/j. jbspin.2010.09.018.
10. Ananthakrishnan A. N., Khalili H., Hi-guchi L. M, Bao Y., Korzenik J. R. Giovannuc-ci E. L., Richter J. M., Fuchs C. S., Chan A. T. Higher predicted vitamin D status is associated with reduced risk of Crohn’s disease. Gastroenterology. 2012, 142 (3), 482-489. doi: 10.1053/j.gastro.2011.11.040.
11. Huber E., Becker J., Kraus W., Kyriatsoulis A., Vogel R., Horn N., Antibodies against 25-hydroxyvitamin D. European Patent 1 931 711 B1, April 8, 2009.
12. Stokes A. N., Williams B. L., French S. S. An improved competitive inhibition enzymatic immunoassay method for tetrodotoxin quantification. Biol. Proced. Online. 2012, 14 (3), 1-5. doi: 10.1186/1480-9222-14-3.
13. Prakasha K. C., Raghavendra G. M., Horisa R., Chang Gowda D. Design, synthesis and antimicrobial screening of amino acid conjugated 2-amino 4-aryltiazole derivatives. Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 2011, 3 (3), 120-125.
14. Chun L., Xiaoping Y., GuangrongH., Hong W. Preparation and characterization of antigenic properties of gramicidin A- keyhole limpet hemocyanin and gramicidin A- ovalbumin conjugates. Afr. J. Biotechnol. 2009, 8 (24), 7051-7058.
15. Huisman H., Wynveen P., Setter P. W. Studies of the immune response and preparation of antibodies against a large panel of conjugates neurotransmitters and biogenic amines: specific polyclonal antibody response and tolerance. J. Neurochem. 2010, 112 (3), 829-841. doi: 10.1111/j.1471-4159.2009.06492.x.
16. Maleimidyl activated Protein Carriers Available at: http://www.interchim.fr/ ft/8/86695A.pdf (accessed 15 February 2013)
17. Hu K., Huang X., Jiang Y., Qiu J., Fang W., Yang X. Influence of hapten density on immunogenicity for anti-ciprofloxacin antibody production in mice. BioSci. Trends. 2012, 6 (2), 52-56.
18. Suarez A. M., Rodri'guez J. M., Hernandez P. E., Azcona-Olivera J. I. Generation of polyclonal antibodies against nisin: Immunization strategies and immunoassay development. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62 (6), 2117-2121.
19. Zhao C., Liu W., Ling H., Lu S., Zhang Y., Liu J., Xi R. Preparation of Anti-gatifloxacin Antibody and Development of an Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Gatifloxacin Residue in Milk. J. Agric. Food Chem. 2007, 55 (17), 6879-6884.
20. Hong J. Y., Kim J.-H., Choi M. J. Hapten synthesis and Influence of coating ligands on Enzyme-linked Immunoreaction of DDT. Bull. Korean Chem. Soc. 2002, 23 (10), 1413-1419.
21. Zhou Y., Li Y. S., Pan F. G., Liu Z. S., Wangc Z. Identification of tetrodotoxin antigens and a monoclonal antibody. Food Chem. 2009, V. 112, P. 582-586. doi:10.1016/j. foodchem.2008.06.022.
22. Pravetoni M., Naour M. L., Harmon T. M., Tucker A. M., Portoghese P. S., Pentel P. R. An oxycodone conjugate vaccine elicits drug-specific antibodies that reduce oxycodone distribution to brain and hot-Plate analgesia. J. Pharmacol. Exp.Tther. 2012, 341 (1), 225232. doi: 10.1124/jpet.111.189506.
23. Jiang Y., Huang X., Hu K., Yu W., Yang X., Lv L. Production and characterization of monoclonal antibodies against small hapten-ciprofloxacin. Afr. J. Biotechnol. 2011, 10 (65), 14342-14347. doi: 10.5897/ AJB11.1546.
24. Harlow E., Lane D. Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988,726 p.
25. Li Z., Song S., Xu L., Kuang H., Guo S., Xu C. Development of an Ultrasensitive Immunoassay for Detecting Tartrazine. Sensors. 2013, 13 (7), 8155-8169. doi: 10.3390/s130708155.
54
Experimental articles
СИНТЕЗ КОНЪЮГАТА 25-ГИДРОКСИВИТАМИНА D3 С ГЕМОЦИАНИНОМ МОЛЛЮСКА И ПОЛУЧЕНИЕ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК
А. А. Мазанова И. А. Шиманский Д. Н. Петухов Л. Б. Дробот
Н. Н. Великий С. В. Комисаренко
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: ann.mazanova@gmail.com
Целью работы было получение поликлональных антител, распознающих 25-гидро-ксивитамин D3, для их дальнейшей характеристики и использования в иммунохимических тест-системах определения содержания 25-гидроксивитамина D3 в сыворотке крови. Были применены методы химического синтеза иммуноконъюгатов (модифицированный карбодиимидний метод с использованием N'-этил-карбодиимида), тонкослойной хроматографии и гель-фильтрации, а также непрямого иммуноэнзимного анализа ELISA. Описаны этапы синтеза иммуноконъюгата 25-гидрокси-витамина D3 с гемоцианином моллюска KLH, который использовали для получения иммунных сывороток. В результате иммунизации мышей и кролей были получены антисыворотки, в которых определяли титры антител против 25-гидроксивитамина D3 методом имуноэнзим-ного анализа. Было продемонстрировано, что титр специфических антител выше у кролей по сравнению с мышами. Полученные поликлональные антитела могут быть использованы для создания иммунохимических тест-систем для скринингового определения содержания 25-гидроксивитамина D3 в сыворотке крови человека как маркера обеспеченности организма витамином D3.
Ключевые слова: 25-гидроксивитамин D3, гаптены, иммуноэнзимный анализ, поликлональные антитела.
SYNTHESIS OF 25-HYDROXYVITAMIN D3 CONJUGATE WITH KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN AND OBTAINING OF IMMUNE SERA
А. O. Mazanova
I. O. Shymanskyy
D. M. Petukhov
L. B. Drobot
M. M. Veliky
S. V. Komisarenko
Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: ann.mazanova@gmail.com
The study was aimed at obtaining polyclonal antibodies that recognize 25-Hydroxyvitamin D3, for their further specifications and applications in immunochemical test systems of 25-Hydroxyvitamin D3, determination in blood serum. We used the methods of chemical synthesis of immunoconjugates (modified carbodiimide method using N'-ethyl carbodiimide), thin layer chromatography, gel filtration and indirect immunoenzyme analysis ELISA. The work describes the stages of the synthesis of 25-Hydroxyvitamin D3, immunoconjugate with keyhole limpet hemocyanin (KLH), which was used for receiving immune sera. As a result of mouse and rabbit immunization antisera were obtained and antibody titers against 25-Hydroxyvitamin D3, were tested by immunoenzyme assay. It was demonstrated that the titer of specific antibodies was higher in rabbits compared with mice. The resulting polyclonal antibodies can be used for the development of immunochemical test systems for screening studies of 25-Hydroxyvitamin D3, content in human blood serum as a marker of vitamin D3 availability.
Key words: 25-Hydroxyvitamin D3, haptens, immunoenzyme analysis, polyclonal antibodies.
55
