CC BY
61
Больбит Н.М.1, Дуфлот В.Р.2, Дубова Е.А.3, Гайворонский А.В.4, Лобанова Е. И.5,
Алтынникова Т.В.6 ©
1Кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник, 2доктор химических наук, профессор, главный технолог - зам. директора филиала по научной работе, 3кандидат химических наук, заведующий лабораторией, 4младший научный сотрудник, 5,6инженер, филиал ФГУП «Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я. Карпова», г. Обнинск
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРБЕЛКОВЫХ КОНЬЮГАТОВ, МЕЧЕНЫХ ИЗОТОПАМИ РАДИОАКТИВНОГО ЙОДА
Аннотация
Работа посвящена созданию термочувствительного йодсодержащего радиофармацевтического препарата с радиохимической чистотой 95-98 %, матрицей которого служит полимер-белковый конъюгат - продукт привитой сополимеризации N-изопропилакриламида и глобулярного белка - бычьего сывороточного альбумина. К белковым молекулам ковалентно присоединены атомы радиоактивного 131I. Водный раствор радиофармпрепарата, введенный туморально, обладает способностью совершать фазовый переход вблизи температуры человеческого тела, благодаря чему препарат превращается в компактный локальный облучатель, разрушающий опухоль. Показано, что образующиеся в процессе мечения тройные поли-^изопропилакриамида-131Г-гидратные комплексы консервируются в препарате на стадии колоночного фракционирования, и тем самым сильно занижают радиохимическую чистоту. После введения радиофармпрепарата в организм комплексы, распадаясь, становятся источником радиоактивного загрязнения, Установлено, что успешное удаление радиоактивных йодидов и превосходная радиохимическая чистота достигаются за счет деградации комплексов под действием растворенных в элюенте добавок, преимущественно неорганических солей, обладающих коэффициентом дестабилизации g= - > 30 граддм3/моль, где Tjt - температура фазового перехода в растворе, содержащем стимулирующую добавку соли с концентрацией Cs.
Ключевые слова: радиофармпрепарат, радиохимическая чистота, термочувствительный полимер, радиоактивные изотопы, фазовый переход
Keywords: radiopharmaceutical, radiochemical purity, thermally responsive polymer, radioactive isotopes, phase transition
Введение
Поиск новых способов локализации радионуклидов в окрестности опухоли наиболее перспективен на путях использования так называемых «умных», или восприимчивых полимеров [1,505]. «Умные» водорастворимые полимеры способны обратимо реагировать на незначительные изменения свойств среды, причем реакция системы выражается в образовании новой фазы в гомогенном до этого растворе. Водные растворы термочувствительных полимеров, таких как поли-Ы-винилкапролактам (ПВКЛ), поли-N-изопропилакриламид (ПНИПА) вблизи физиологических температур претерпевают фазовый золь - гель переход, сопровождающийся коллапсом полимера. Если в состав цепи полимера-носителя ковалентно ввести радионуклиды, компактный гель может стать локальным источником облучения и разрушения опухоли. На этом направлении нам известны несколько патентных и исследовательских работ [2,1; 3,1; 4,1; 5,689]. В патентах [2,1; 3,1] содержится описание носителя радиоизотопов в виде статистического сополимера, линейные цепи которого состоят из чередующихся последовательностей звеньев термочувствительного ПНИПА и гидрофильной полиакриловой кислоты. В качестве терапевтического агента
© Больбит Н.М., Дуфлот В.Р., Дубова Е.А., Гайворонский А.В., Лобанова Е. И., Алтынникова Т.В., 2013 г.
используются соли радиоактивного изотопа 90Т Коллоидные частицы солей субмикронного размера благодаря большой удельной поверхности и ионно-координационным связям со звеньями акриловой кислоты формируют узлы пространственной полимерной сетки. Недостаток этой разработки состоит в том, что заряженные гидрофильные звенья акриловой кислоты смещают нижнюю критическую температуру фазового расслоения (Та), присущую гомополимеру ПНИПА Тд = 32.6°С, в окрестность физиологических температур. Как показали эксперименты на животных, при незначительном удалении системы от бинодали за счет не совсем благоприятного соотношения температуры тела и Тд наблюдается неполное удерживание воды в геле и, в результате, распространение радионуклида по всему организму.
Со столь невыгодного направления развития событий можно свернуть, если ионно-координационные связи между полимерным носителем и радионуклидом заменить на ковалентные. В работе [5,689] методом радикальной прививочной полимеризации в водной среде был синтезирован термо- и рН-чувствительный полимер-белковый конъюгат К-изопропилакриламида (НИПА) и глобулярного белка казеина с массовой долей белка в образце ~ 30 %. Как показывает анализ экспериментальных данных, синтезированный образец не годится для создания радиофармпрепарата (РФП): излишне высокое содержание заряженных глобул казеина не способствует самоколлапсированию полимер-протеинового сополимера в сыворотке крови. Как следует из схемы 2 цитируемой работы [5,696], при температуре человеческого тела формирование плотных гелевых агрегатов из растворов графт-сополимера наиболее эффективно происходит в диапазоне 3.5 < рН < 5.5, что значительно меньше физиологических значений рН ~ 7.0-7.4.
В работе [6,423] прекурсор термочувствительного РФП был изготовлен в результате многостадийного органического синтеза. На первом этапе было синтезировано азо-соединение, несущее реакционные группы, которое послужило инициатором радикальной полимеризации НИПА. Выделенный полимер затем модифицировали путем аминолиза реакционных групп инициатора, находящихся в концевых фрагментах цепи, с помощью Lтирозинамида. Модифицированный ПНИПА подвергали радиоактивному мечению в водном растворе №1251 и окислителя хлорамина. Отделение высокомолекулярных фракций от низкомолекулярных реагентов смеси проводили на хроматографической колонке, заполненной сефадексом, с использованием воды в качестве элюента - подвижной фазы. Было изучено влияние времени реакции, рН среды, температуры и концентрации полимера на эффективность мечения. Указанные факторы мало изменяют выход мечения в пределах 50-80 %. Цитированная работа, впрочем, как и предыдущие, страдает отсутствием данных о радиохимической чистоте (РХЧ) разрабатываемых РФП. РХЧ равна отношению активности радионуклида, содержащейся в основном веществе препарата, к общей активности радионуклида в этом препарате, выраженному в процентах. РХЧ является главным показателем качества РФП, определяющим терапевтическую эффективность [7,296]. Часто, особенно в результате химического или биохимического синтеза, многокомпонентный препарат загрязняется радиохимическими примесями.
Мы столкнулись с проблемой радиоактивного загрязнения при ковалентном радиоактивном мечении изотопом 1311 бычьего сывороточного альбумина (БСА) - компонента самоколлапсирующих полимер-белковых конъюгатов (СПБК) с целью создания РФП для брахитерапии солидных опухолей. Введенная в окрестность опухоли капля водного раствора термочувствительного СПБК, несущего атомы 1311, по достижении температуры человеческого тела самопроизвольно превращается в компактный гель, предотвращая распространение радиоактивности по организму, и становится источником локального терапевтического облучения. Однако уникальные эффекты самоколлапсирования термочувствительных полимеров становится затруднительно использовать в производстве РФП из-за того, что наиболее распространенные из них ПВКЛ и ПНИПА в водных системах являются «мягкими» комплексообразователями для неорганических анионов с константой устойчивости от 1 до 104 дм3/моль [8,144]. Когда радиоактивное мечение осуществляется с применением растворов радиоактивных солей йода, например №1311, основная масса анионов йода окисляется до катионов и присоединяется к реакционным группам, инкорпорированным в термочувствительные макромолекулы. Наряду с этим позитивным процессом в
реакционной среде благодаря значительной концентрации амидных групп протекает негативный процесс - анион йода включается в систему водородных связей между мостиковыми молекулами воды и несущими отрицательный заряд карбонильными группами мономерных звеньев. Без принятия специальных мер, радиоактивные йодиды консервируются в препарате и после введения РФП в организм перманентно выделяются и наносят вред окружающим органам. Решению проблемы разрыва фатального сопутствия реакций доминантного ковалентного йодного мечения и минорного формирования «мягких» физических комплексов йодидов, связанных с полимерной цепью, и посвящена настоящая публикация.
Экспериментальная часть
Синтез и выделение полимера. Радикальную сополимеризацию НИПА с БСА осуществляли ампульным методом. Начальная концентрация НИПА в водной среде с рН = 2.6 от опыта к опыту оставалась неизменной - 0.18 моль/дм3, концентрацию третбутилгидропероксида (ТБГП) варьировали в пределах 40-100 ммоль/дм3, концентрацию БСА - 0.5-5 мг/дм3. Первоначально содержимое ампул продували аргоном в течение 45 мин, отпаивали и помещали в термостат при 80°С. В процессе синтеза часть свободных радикалов, образующихся в результате термического распада молекул ТБГП, инициируют гомополимеризацию НИПА. Другая часть вместе с боковыми аминогруппами аминокислотных остатков БСА (аспаргина, аргинина, глутамина) участвует в создании окислительно-восстановительных пар, генерирующих катион-радикалы*№Н3, которые служат узлами привитых к белку цепей ПНИПА (схема 1 работы [5,692]). Доступность аминокислотных остатков повышается благодаря денатурации белка в растворе при повышенных температурах или за счет ионизации молекулы в кислой среде [9,1589]. Из продукта полимерного синтеза удаляли не вступивший в реакцию белок. Опасность, исходящая от несвязанных глобул БСА, состоит в том, что после термотропного перехода в организме они способны под воздействием кровотока приобрести достаточную трансляционную подвижность, покинуть окрестность опухоли и разнести часть радиоактивности по отделам организма. Разделение двух частей белка достигается селективным осаждением с помощью сульфата аммония. При этом графт-сополимер высаливается с образованием осадка одновременно с гомополимером ПНИПА. Из данных таблицы 1 следует, что при наличии в растворе ПНИПА коэффициент линейной
зависимости у = dТft/dCs составляет 42 граддм3/моль 3 град/мас. %. Водный раствор
нативного БСА в присутствии сульфата аммония остается прозрачным при 25 °С вплоть до С8 10 мас. %, а денатурированного - до С 7 %. Таким образом добавление в реакционную смесь (КН4^04 в количестве 3 мас. % высаливает смесь гомополимера ПНИПА с графт-сополимером, а непрореагировавший БСА остается в надосадочной жидкости. После отфильтровывания выделенный полимер подвергали диализу до полного удаления сульфата аммония, затем выпаривали воду в роторном испарителе, растворяли сухой остаток в смеси диоксана с 15 об. % воды и переосаждали диэтиловым эфиром.
Таблица 1
Влияние химических реагентов на стабильность ПНИПА-гидратных комплексов
№ Добавка Коэффициент дестабилизации у = - дТп16.С5, град-дм3/моль
1 Хлористый натрий 14
2 Хлористый аммоний 10
3 Углекислый калий 32
4 Сульфат натрия 55
5 Сульфат аммония 42
6 Монозамещенный фосфат калия 32
7 Двузамещенный фосфат натрия 43
8 Фосфатный буфер рН 7.4 39
9 Мочевина 1.5
10 Азотнокислый калий 6
11 Азотнокислый натрий 7
12 Гидроокись натрия 24
Методы определения свойств СПБК. Содержание БСА в СПБК оценивали методом УФ-спектроскопии. На рисунке 1 приведен спектр оптического поглощения водного раствора одного из образцов СПБК.
200 250 300 350 А. нм
Рис. 1 - Спектр оптического поглощения в УФ-области водного раствора сополимера СПБК-1
Полоса поглощения БСА в воде имеет максимум при 1т 280 нм с коэффициентом экстинкции 6.7 ± 0.2 (мас. %)-1 [9,1588] и вызвана поглощением ароматических групп белка. В спектре сополимера эта полоса находится на ниспадающей ветви интенсивной полосы поглощения амидных групп ПНИПА.
Из спектров поглощения можно оценить концентрацию БСА в суммарном образце а0б, которая в зависимости от условий синтеза изменялась от 0.5 до 10 мас. % (таблица 2).
Таблица 2
Влияние условий синтеза на состав и молекулярные характеристики СПБК
Индекс образца [ТБГП]0, ммоль/ дм3 [БСА]0, мг/дм3 t, час %' м, дл/г S0, ед. Сведберга D0107, см2/с <M>10-5 а0б, мас. %
СПБК-1 100 1.0 7 83 0.32 0.5 2.8 0.34** 9.0
СПБК-2 40 0.1 12 55 0.61 1.07 1.52 1.2**; 1 25*** 0.5
СПБК-3 40 0.4 4.5 70 1.0 1.6 1.21 2.5** 2 8*** 1.6
* отношение массы ПНИПА в суммарном образце к начальной массе НИПА; ** Msd; *** Мл
Методом измерения зависимостей оптической плотности растворов, вызванной светорассеянием в видимой области (1 500 нм), от температуры на спектрофотометре Agilent 8453 UV-vision в отсутствие и при наличии дестабилизирующих добавок были определены температура фазового перехода ПНИПА 32.9°С и коэффициенты линейной зависимости g
= dTf/dCs для ряда химических соединений в области концентраций 0-1 моль/дм3 (таблица 1, рисунки 2-3). Относительная погрешность измерения g была на уровне 5 %.
Се, моль/дм3
Рис. 2 - Зависимости температуры фазового перехода от концентрации добавки в растворе ПНИПА: а -
КС^ (1), К1 (2)
С5, моль/дм3
Рис. 3 - Зависимости температуры фазового перехода от концентрации добавки в растворе ПНИПА:
(1), КН2РО4 (2), Na2SO4 (3)
Плохая растворимость протеинсодержащих сополимеров в органических растворителях накладывает ограничения на выбор методов изучения молекулярных характеристик СПБК. В случае образцов с небольшим содержанием белкового компонента допустимо применение уравнения Марка-Куна-Хаувинка, связывающего характеристическую вязкость ПНИПА по измерениям в водном 0.5 М растворе LiNO3 при 20°С и его средневязкостную молекулярную массу: = 4.7 10"4М^061 [10,2929]. Когда аб > 3 мас. %, то рассчитывали среднегидродинамическую молекулярную массу MsD по данным скоростной седиментации и диффузии, полученным с помощью аналитической ультрацентрифуги МОМ 3180: MsD = SoRT/Do(1 - V2p), где - Бо, Бо - экстраполированные к нулевой концентрации значения коэффициентов седиментации и диффузии соответственно, V2 - удельный парциальный объем полимера в воде, р - плотность воды, R - универсальная газовая постоянная, Т - температура [11,424]. Отметим, что седиментационные диаграммы изученных образцов СПБК были унимодальными. В настоящей работе получены образцы сополимеров со средними молекулярными массами <М> = 104-106, свойства некоторых из них приведены в таблице 2.
Сведения о строении и составе полимерных прекурсоров удалось извлечь с помощью кислотного гидролиза белковой компоненты. Напомним, что конечный продукт синтеза содержит гомополимер ПНИПА и графт-сополимер ПНИПА^-БСА. В предварительных экспериментах методом титрования установлено, что во время гидролиза в 6 моль/дм3 соляной кислоте при 97°С в течение 16 ч происходило полное расщепление полипептидных цепей БСА, при этом в ПНИПА имело место карбоксилирование только 1-2 мас. % боковых амидных групп. Таким образом, в результате полной деградации полипептидного скелета БСА ансамбль макромолекул ПНИПА состоит из двух частей - цепей гомополимера и ветвей, отщепленных от графт-сополимера ПНИПА^-БСА. Дополнительные сведения о молекулярной массе и массовой доле гомополимерной составляющей дает возможность получить контрольный синтез ПНИПА в идентичных условиях, но в отсутствие БСА.
Имеющихся данных достаточно, чтобы охарактеризовать композиционный образец. Проиллюстрируем схему расчета на примере СПБК-1. Исходные данные: Msd = 3.4-104, [п]о = 0.32 дл/г, а0б = 0.09; из соотношения конверсий контрольного (50 %) и суммарного (83 %) образцов оценивали массовую долю гомополимера q ~ 0.6; [п]гомо = 0.25 дл/г - для контрольного аналога; [п]гидр = 0.265 дл/г - для ПНИПА-ветвей, отщепленных в результате гидролиза белка. Как известно [11,142], характеристические вязкости полимерных компонентов складываются с их массовыми долями согласно уравнению: [п]о = q^roi^ + (1 -q)'[n]^x, где [п]графт - характеристическая вязкость графт-сополимера ПНИПА^-БСА. Похожее аддитивное уравнение можно записать для гидролизованного образца: [п]гидр = q^n]^ + (1 - qO^nL, где q1 = q/(1 - а0б), [п]в - характеристическая вязкость отщепленных ветвей. Связь между содержанием белка в суммарном образце и графт-сополимере ПНИПА-g-БСА не требует пояснений: а0б = (1 - q^a1^. Зная литературное значение Мбса = 6.8104 [8,185] и используя приведенные соотношения, находим следующие величины: [п]графт = 0.425 дл/г, абграфт = 0.23; [п]в = 0.29 дл/г, длина одной ветви M% = 3.7-104, среднее число ветвей, приходящихся на одну молекулу БСА, тв 6. Таким образом, макромолекула ПНИПА^-БСА имеет звездообразную форму, в центре которой находится денатурированная, но все еще компактная глобула БСА, с которой химически связаны несколько (шесть) статистических клубков ПНИПА.
Упругие свойства водных растворов термочувствительных образцов после термотропного перехода определяли методом одностороннего сжатия. В цилиндрическую ячейку из нержавеющей стали диаметром 20 мм, снабженную термостатирующей рубашкой, заливали 7 см3 исследуемого раствора, помещали на платформу разрывной машины Zwick, нагревали до 37°С и выдерживали 20 мин. Стержень из ПТФЭ диаметром 15 мм закрепляли в подвижном зажиме и осуществляли погружение в содержимое ячейки со скоростью 50 мм/мин. На графике испытаний отображалась кривая сила - перемещение (рисунок 4).
Эффективный модуль сжатия Ec определяли из наклона деформационной кривой на линейном начальном участке при L > L*, где L - текущее значение перемещения, L* - значение L, при котором реакция на сжатие становится больше нуля при контакте с плотной сердцевиной.
Рис. 4 - Кривая пенетрации поршня (сила F - перемещение Ц) в растворе СПБК-2 в фосфатном буфере рН
= 7 (Сспбк = 13.8 мас. %) при 37°С
Почти всегда усилие регистрируется не по достижению поршнем верхней границы из-за наличия жидкой оболочки, которая обязана своим происхождением синерезису воды во время фазового распада системы. Вязкоупругие свойства растворов матричных полимеров соответствуют требованиям, предъявляемым к термочувствительным РФП для локальной радиотерапии, Например, для образца СПБК-1 абсолютная вязкость ~14 % раствора равна 25 мПа-с (измерена на вискозиметре Гепплера) при 25°С, а эффективный модуль сжатия студня, образовавшегося в результате фазового перехода после нагревания до 37°С, составлял 2-104 Па (рисунок 4), что характерно для достаточно крепких студней.
Радиоактивное мечение. Так как радиоактивный йод доступен в виде йодида натрия, где йод является анионом, а для замещения атомов водорода в тирозиновых аминокислотных остатках белков нужен катион 15+, катализаторами реакции йодирования белков служат сильные окислители. Мы использовали наиболее распространенную методику мечения с использованием хлорамина Б - К-хлорбензолсульфамида натрия. Хлорамин Б наряду с йодидом способен окислить также сульфогидрильные группы SH цистеиновых остатков белков. Образующийся сульфонилйодид является неустойчивым соединением (энергия разрыва связи S-I < 2 эВ, для сравнения связь С-1 требует для диссоциации 2.8 эВ) и
способен гидролизоваться с высвобождением радиоактивного йода. Поэтому при йодировании БСА-содержащих образцов проводили предварительное окисление SH-групп с применением перекиси водорода в растворе с рН = 4.0-4.5, когда гидроксильная группа тирозина не ионизована, а условия для окисления SH подходящие. Приведем на конкретном примере всю цепочку изготовления йодсодержащего РФП на основе СПБК. На первой стадии в 5 см3 раствора сополимера СПБК-1 в воде с концентрацией Сспбк ~ 10 мас. % и рН = 4.5 добавляли 30 мкл 3 % перекиси водорода. Далее непосредственно перед мечением с помощью 0.1 моль/дм3 раствора NaOH делали полимерный раствор нейтральным. В порцию 0.75 см3 этого раствора вводили 0.5 см3 хлорамина Б (Сха = 1 г/дм3) и 0.5 см3 раствора Na131I с активностью 100 МБк/см3, выдерживали в течение 25 мин, после чего избыток хлорамина Б блокировали добавлением сильного восстановителя - метабисульфита натрия (V = 0.5 см3, Смбс = 10 г/дм3). На второй стадии реакционную смесь разделяли в колонке диаметром 18 мм и высотой 190 мм, элюентом служила вода или водные растворы различных химических соединений, преимущественно неорганических солей из таблицы 1. Колонку с набухшим наполнителем Sefadex G50-f предварительно калибровали по каждому компоненту реакционной смеси. Активность проб измеряли на радиометре - Дозкалибратор РИС-1А. В результате элюирования водой или солевым раствором отделяли две полимер-протеиновые фракции объемом по 6 см3 каждая в интервале удерживаемого объема 15-27 см3, представляющими собой конечную субстанцию изготовления РФП. В ряде случаев радиоактивное мечение и последующее колоночное фракционирование проводили по аналогичной схеме в фосфатном буфере с рН = 7.5.
Методом восходящей радиотонкослойной хроматографии на пластинах силуфола фирмы Merck с использованием смеси ацетона и воды (95:5) в качестве элюента определяли РХЧ полимерных фракций. Измерения радиоактивности проводили на гамма-спектрометре «Гамма-1П» в свинцовом домике. Радиохимически чистым принято считать препарат, в котором 95-98 % активности обусловлено основным веществом [7,311]. Результаты испытаний сведены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние дестабилизирующего качества элюента на РХЧ полимерных фракций радиоактивно меченого
препарата
Полимер-прекурсор Элюент Cs, моль/ дм3 РХЧ, % g, граддм3/ моль Оценка РФП
Проба 1 Проба 2
СПБК-1 вода - 75 81 - -
СПБК-1 NaCl в H2O 0.3 82 78 14 —
СПБК-2 K2CO3 в H2O 0.15 95 97 32 +
СПБК-2 Na2SO4 в H2O 0.1 96 96 55 +
СПБК-3 (NH4)2SO4 в H2O 0.1 95 96 42 +
СПБК-1 Фосфатный буфер рН = 7.5 0.09 97 96 39 +
СПБК-1 KCNS в H2O 0.5 76 75 0 -
Спектры флуоресценции от полимерных растворов регистрировали при комнатной температуре на флуориметре Флюорат-02 Панорама. Флуоресцентный метод позволил проиллюстрировать эффективность йодирования в белковой компоненте СПБК. На рисунке 5 приведены спектры флуоресценции (1воз = 260 нм) водных бессолевых растворов образца СПБК3, полученных при комнатной температуре.
В исходном образце (рисунок 5, кривая 1) флуоресцируют аминокислотные остатки, в основном фенилаланин (1фл 285 нм), тирозин (1фл 303 нм), триптофан (1фл 340 нм) [12,85].
После «холодного» йодирования с помощью неактивного изотопа 1271 (рисунок 5, кривая 2) в спектре испускания БСА остается только свечение фенилаланинового остатка, а флуоресценция тирозина тушится атомом галогена, сигнализируя о наличии, по крайней
мере, одного атома йода в каждом ароматическом кольце. О правильности отнесения полос флуоресценции сополимера свидетельствует кривая 3 (рисунок 5). В последнем случае флуоресценция зарегистрирована в среде с рН = 13. В этих условиях происходит отщепление протонов от ионогенных групп, благодаря чему флуоресценция фенилаланиновых и триптофановых остатков тушится частично, а тирозиновых - полностью [12,74].
X, нм
Рис.5 - Спектры флуоресценции водных растворов образцов СПБК-3: 1 - исходный (рН = 7), 2 -йодированный (рН = 7), 3 - исходный (рН = 13). Температура измерения (Тизм) - комнатная, длина волны
возбуждения Хвоз = 260 нм
Обсуждение результатов
Сводка данных о РХЧ препаратов, полученных на основе СПБК в результате представленного набора операций, приведена в таблице 3. Те из них, которые отмечены знаком (-) в последнем столбце, обладают одновременно низкими уровнями значений РХЧ препарата (70-80 %) и коэффициента дестабилизации (у = 0-20 граддм3/моль) ПНИПА-гидратных комплексов в элюирующем растворе, использованном при фракционировании. Также верно и противоположное утверждение: элюенты, обладающие значениями у > 30 граддм3/моль, обеспечивают РХЧ препаратов больше 95 %. Чтобы объяснить эту устойчивую корреляцию, рассмотрим явления, происходящие в водной системе и гидратных слоях макромолекул термочувствительного полимера после введения в раствор химических добавок. В общих чертах термотропный переход растворение-осаждение управляется двумя типами взаимодействий - гидрофобными дисперсионными внутри- и межмолекулярными силами и водородными связями между амидными группами полимера и молекулами воды. На примере ПВКЛ было показано [8,243], что введение в водный раствор ПВКЛ низкомолекулярных добавок различного химического строения сопровождается ослаблением водородных связей, повышением подвижности молекул воды и сжатием полимерных клубков. Указанные эффекты изменяют температуру фазового перехода, причем на величину и знак ^ влияют в случае солей природа аниона и, в меньшей мере, катиона, а также концентрация добавки. Так К1 и KCNS проявляют экстремальные зависимости Та от С.; с максимальными значениями вблизи С 1 моль/дм3, близкими к 53 и 57°С, соответственно, что примерно на 20° превосходит Та ПВКЛ в чистой воде [8,242]. Это свидетельствует о том, что соли К1 и КС№ служат эффективными стабилизаторами ПВКЛ-гидратного комплекса. Для растворов ПНИПА сведения по этому вопросу в научной литературе практически отсутствуют. В таблице 1 представлен полученный в настоящей работе массив данных по влиянию химических добавок на коэффициент дестабилизации ПНИПА-гидратных комплексов.
Отмечаем, что как и в случае растворов ПВКЛ особняком ведут себя добавки йодистого и роданистого калия (или натрия). Зависимости Та (С;) для этих солей носят экстремальный характер (рисунок 2), причем в интервале концентраций до 0.5 моль/дм3 Та превышает значение Та в чистой воде. Это означает, что К1 и KCSN выступают в роли эффективных стабилизаторов ПНИПА-гидратных комплексов. Для остальных соединений из
таблицы 1 наблюдается пропорциональное уменьшение Та с увеличением концентрации солей и постоянство фактора стабильности ПНИПА-гидратных комплексов у (рисунок 3).
Устойчивые комплексы йодидов с поливиниламидами были зарегистрированы оптическими методами в растворах ПВКЛ (рисунок 6).
240
340
440
нм
Рис. 6 - Влияние термочувствительных полимеров на спектр поглощения 13 в воде: 1 - Ь , 2 - ПНИПА, 3
- ПВКЛ
Анионы I- практически не поглощают в УФ-области, но после добавления в раствор молекулярного 12 формируются анионы 13-, обладающие огромным коэффициентом экстинкции 2.5104 дм3/сммоль с главным максимумом в спектре поглощения 1т 353 нм (рисунок 6, кривая 1). Ведение цепей ПВКЛ в раствор смещает максимум поглощения до 1т ~ 370 нм (рисунок 6, кривая 2 - позаимствована из книги [8,149]). Как следует из аналогичных спектров поглощения ПНИПА (рисунок 6, кривая 3), батохромное смещение максимума поглощения зондирующего 13- не наблюдается, хотя деформация спектра в присутствии цепей ПНИПА очевидна.
Нам удалось зафиксировать включенные в гидратную оболочку ПНИПА йодиды I-прямым измерением радиоактивности проб, отбираемых по ходу элюирования водой на гелевой колонке активных растворов соли Ыа1311 и смеси ПНИПА + Ыа1311 (рисунок 7).
Заметная ступенька на кривой 3 рисунка 7 вызвана частичным распадом гидрат-йодидных комплексов, связанных со звеньями ПНИПА. Чем больше у, тем сильнее разрушающее действие соли на тройной комплекс в процессе движения элюента в колонке, тем эффективнее экстракция йодида из окрестности полимерной цепи и тем выше РХЧ РФП.
Рис.7 - Кривые элюирования через хроматографическую колонку: 1 - СПБ-3; 2 - ^1311; 3 - ^1311 + СПБК-3; способ регистрации: 1 - гравиметрия, 2 и 3 - измерение радиоактивности проб ^ - число
импульсов)
Внимательное рассмотрение данных таблицы 3 позволяет сделать вывод о том, что использование чистой воды в качестве элюента при колоночном фракционировании меченых йодом РФП на основе синтезированных СПБК не позволяет достичь значений РХЧ, близких к предельным, если не принять дополнительных мер по разрушению комплексов между анионами I- и макромолекулами термочувствительного ПНИПА. Достаточно полная деградация ПНИПА-гидрат-йодидных комплексов в процессе элюирования имеет место при введении в элюент химических добавок, выступающих в качестве катализаторов разрушения комплексов и очищения РФП от следов радиоактивных анионов 1311-. Этот прием дает возможность получить РФП на основе СПБК, обладающие РХЧ в интервале 95-98 %.
Заключение
Работа представляет собой успешную попытку создания термочувствительного РФП с радиохимической чистотой 95-98 %, матрицей которого служит полимер-белковый конъюгат поли-Ы-изопропилакриламида и глобулярного белка - бычьего сывороточного альбумина.
Цепи термочувствительного полимера ПНИПА присоединены в результате прививочной полимеризации к белковым молекулам, с которыми благодаря реакции электрофильного замещения ковалентно связаны атомы радиоактивного 1311. Водный раствор РФП, введенный туморально, обладает способностью совершать фазовый переход вблизи температуры человеческого тела, так что препарат превращается в компактный локальный облучатель, разрушающий опухоль. Показано, что в процессе мечения формируются тройные ПНИПА-1311-гидратные комплексы, которые не полностью удаляются на стадии колоночного фракционирования и тем самым сильно занижают РХЧ препарата. Установлено, что успешное удаление радиоактивных йодидов и превосходная РХЧ РФП достигаются за счет действия растворенных в элюенте добавок, преимущественно неорганических солей, обладающих коэффициентом дестабилизации у = - > 30 граддм3/моль, где ^ - температура
фазового перехода в растворе, содержащем стимулирующую добавку соли с концентрацией С;.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы»,
ГК № 14.512.11.0061.
Литература
1. Галаев И.Ю. «Умные» полимеры в биотехнологии и медицине // Успехи химии. - 1995. - Т. 65; № 5. - С. 505-524.
2. Patent US 2002/0131935 A1. Fibrin carrier compound for treatment of disease.
3. Patent US 2004/0228794 A1. Therapeutic agent carrier compositions.
4. Патент РФ 2011/2478401 C2. Термочувствительный интерполимерный носитель радионуклидов.
5. Cao Z., Jin Y., Zhang B., Miao Q., Ma C. A Novel Temperature and pH-responsive Polymer-biomolecule Conjugate Composed of Casein and Poly(N-isopropylacrylamide) // Iran. Polym. J. - 2010. - V. 19; № 9. - P. 689698.
6. Hruby M., Subr V., Kucka J., Kozempel J., Lebeda O., Skoda A. Thermo responsive polymers as promising new materials for local radiotherapy // Applied Radiation and Isotopes. - 2005. - V 63. - P. 423-431.
7. Богородская М.А., Кодина Г.Е. Химическая технология радиофармацевтических препаратов. М.: Изд-во ФГУ ФМБЦ им. А. И. Бурназяна ФМБА России, 2010.
8. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды: Синтез и физико-химические свойства. М.: Наука, 1998.
9. Yang J.T., Foster J.F. Changes in the Intrinsic Viscosity and Optical Rotation of Bovine Plasma Albumin Associated with Acid Binding // JACS. - 1954. - V 76; № 6. - P. 1588-1595.
10. G. Bocias, D. Houdret, J. Hiopolos. Positively Charged Amphiphilic Polymers Based on Poly(N-isopropylacrylamide): Phase Behavior and Shear- Induced Thickening in Aqueous Solutions // Macromolecules. 2000. - V. 33; № 8. - P. 2929-2935.
11. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворе. М.: Наука, 1964.
12. Ю.А. Владимиров. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука, 1965.
