CC BY
82
УДК 615.373:616.24-002.5
СИНТЕЗ И СЕКРЕЦИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ
О.И. Уразова1, И.Е. Есимова1, М.С. Игнатова1, В.В. Новицкий1,2, О.В. Филинюк1
1 Сибирский государственный медицинский университет,
г. Томск
2 Томский государственный университет E-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
Целью работы явилось исследование молекулярных патогенетических факторов дисрегуляции активации синтеза и секреции IFN-y Т-лимфоцитами при туберкулезе легких (ТЛ) на этапе IL-12ЛЬ-27-опосредованной сигнальной трансдукции. Обследовано 97 больных с инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым (ЛУ) туберкулезом легких. Использованы методы моделирования in vitro IL-12/IL-27-зависимой активации Т-лимфоцитов-хелперов типа 1 (Th1), иммуноферментный анализ, проточная цитометрия. Показано, что при туберкулезе легких спонтанная и IL-12/IL-27-индуцированная in vitro гиперсекреция IFN-y - ключевого цито-кина Thi-ассоциированного иммунного ответа - сочетается с уменьшением общего количества CD3+ Т-лимфоцитов и числа CD3+ Т-клеток с внутриклеточным содержанием IFN-y (CD3+IFN-y+) и транскрипционного фактора T-bet (CD3+T-bet+) при увеличении количества IFN-y+ CD3-негативных лимфоцитов. Максимально выраженный дефицит CD3+IFN-y+ и CD3+T-bet+ клеток отмечен при диссеминированном лекарственно-устойчивом туберкулезе легких. Продемонстрировано, что при туберкулезе легких независимо от клинической формы заболевания в лимфоцитах обнаруживается дефицит тирозиновых киназ (JAK1, JAK2, TYK2) и транскрипционных факторов (STAT1, STAT4), что препятствует реализации внутриклеточного каскада ГЬ-12/ГЬ-27-зависимых реакций, а следовательно, опосредует дисрегуляцию иммунного ответа уже на этапе активации и диф-ференцировки Т-лимфоцитов. Сочетание гиперсекреции IFN-y in vitro с указанными изменениями позволяет заключить, что она не связана с активацией Т-лимфоцитов.
Ключевые слова:
Т-лимфоциты, интерферон, внутриклеточный сигналинг, транскрипционные факторы, тирози-новые киназы, туберкулез легких.
В основе патогенеза распространенного деструктивного туберкулеза лежит дизрегуля-ция антигенспецифического иммунного ответа, опосредованного активацией, пролиферацией и дифференцировкой Т-лимфоцитов-хелперов типа 1 (ТЫ) [1-3]. Однако по-прежнему остается открытым вопрос о том, включение каких механизмов иммунного ответа на возбудитель и на каком его этапе способствует возникновению «иммунной девиации» и патологическому прогрессирующему течению туберкулезной инфекции. Одной из причин снижения активности (гипо- и анергии) Т-клеток и патологии противотуберкулезного иммунитета могут быть нарушения взаимодействия между T-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками [4]. Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется путем как непосредственного контактного взаимодействия клеток, в котором участвуют их поверхностные молекулы, так и
Уразова Ольга Ивановна,
д-р мед. наук, профессор, профессор кафедры патофизиологии СибГМУ. E-mail: [email protected] Есимова Ирина Евгеньевна, канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ.
E-mail: [email protected] Игнатова Мария Сергеевна,
аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ. E-mail:
[email protected] Новицкий Вячеслав Викторович, д-р мед. наук, профессор, академик Российской академии наук, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ, стар. науч. сотр. лаборатории моделирования физических процессов в биологии и медицине физического факультета ТГУ. E-mail: [email protected] Филинюк Ольга Владимировна, д-р мед. наук, доцент, заведующая кафедрой фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ.
E-mail: [email protected]
посредством цитокинов, одним из которых является IFN-y - ключевой цитокин противотуберкулезного иммунитета [3, 5, 6]. Способность цитокинов регулировать клеточные функции обусловлена тем, что после их взаимодействия с комплементарными рецепторами на поверхности клеток сигнал через элементы внутриклеточной трансдукции передается в ядро, где активируются соответствующие гены [5, 6]. По сути, само по себе наличие цитокина не обеспечивает клеточный ответ. Ввиду недостаточности (слабости) «внешнего» сигнала клетка использует так называемые каскадные механизмы его усиления. Учитывая, что механизм сигнальной трансдукции является сложным комплексным процессом, при котором нарушения могут присутствовать в различных его звеньях, вопрос о существовании внутриклеточных механизмов, приводящих к дисфункции иммунокомпетентных клеток при туберкулезе, в настоящее время остается открытым и требует дальнейшего изучения.
Цель исследования: охарактеризовать роль нарушений сигнальной трансдукции (сигнального JAK-STAT-пути) в дисрегуляции активации Т-лимфоцитов цитокинами индуктивной фазы противотуберкулезного иммунного ответа (IL-12 и IL-27) у больных с различными кли-нико-патогенетическими вариантами туберкулеза легких (ТЛ).
Материал и методы. Обследовано 97 больных (75 мужчин и 22 женщины) в возрасте от 20 до 55 лет с впервые выявленным инфильтративным (48 (49,48 %) человек) и диссемини-рованным (49 (50,52 %) человек) туберкулезом легких (ТЛ). Больные ТЛ находились на стационарном лечении в ОГБУЗ «Томская областная клиническая туберкулезная больница». Диагноз ТЛ основывался на данных анамнеза, рентгенологического обследования, бактериологического и мироскопического исследования мокроты, анализа клинической картины.
Исследования проводились до начала больным ТЛ этиотропной химиотерапии. Критериями исключения больных ТЛ из исследования считались: возраст младше 20 и старше 55 лет; наличие других (кроме инфильтративной и диссеминированной) клинических форм туберкулезной инфекции; наличие аллергии и сопутствующих заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза в стадии обострения; терапия глюкокортикоидами и иммуномодулирующими препаратами; у женщин исключалась беременность.
При проведении исследований учитывалась лекарственная чувствительность возбудителя (M. tuberculosis). Всего был обследованы 51 (52,58 %) пациент с лекарственно-чувствительным ТЛ (ЛЧТЛ) и 46 (47,42 %) пациентов с лекарственно-устойчивым ТЛ (ЛУТЛ).
В контрольную группу вошли 35 практически здоровых мужчин и женщин с сопоставимым больным ТЛ распределением по полу и возрасту.
Эксперименты in vitro выполнялись в лаборатории клинической и экспериментальной патофизиологии кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.
В работе исследовались лимфоциты крови, взятой утром натощак из локтевой вены.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов из цельной крови осуществляли методом градиентного центрифугирования (р = 1,077 г/см3). Лимфоциты отделяли от моноцитов на основе способности последних прилипать к пластику.
Подсчет количества лимфоцитов в суспензии осуществляли общепринятыми методами. Жизнеспособность клеток оценивали посредством теста с трипановым синим. Жизнеспособность лимфоцитов была не менее 95 %.
Специфическую цитокиновую индукцию лимфоцитов осуществляли путем добавления в культуральную среду индукторов Thl-иммунного ответа (рекомбинантных цитокинов IL-12 и IL-27 (eBioscience Company, США) в дозе 20 и 10 нг/мл) и блокатора внутриклеточного транспорта моненсина (Sigma, США) (5 мкг/мл). Время инкубации с индукторами варьировало от 1 до 48 ч в зависимости от тестируемого параметра.
Для определения содержания в лимфоцитах активных (фосфорилированных) форм транскрипционных факторов STAT1, STAT4 и тирозинкиназ JAK1, JAK2, TYK2 готовили клеточные лизаты с использованием лизирующего буфера (протокол Cell Signaling Technology, США).
Для оценки содержания IFN-y в базальной и цитокин-индуцированной культуральной среде (оценка секреции IFN-y), определения содержания активных форм STAT1, STAT4 и JAK1, JAK2, TYK2 в лизатах лимфоцитов использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» анализ, согласно методическим рекомендациям производителя (Cusabio
Biotech, США). Для регистрации результатов использовали фотометр Multiscan EX (Thermo, Финляндия).
Для определения содержания IFN-y (оценка синтеза IFN-y) и активной формы фактора транскрипции T-bet непосредственно в Т-лимфоцитах применяли метод проточной цитометрии (проточный цитофлуориметр «FACS Calibur Flow cytometr BD», Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител, обработанных флуоресцентными метками (FITC, PE, PerCP) (R&D Systems, США).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica for Windows фирмы Statsoft Inc. Проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента или критерия Аспина - Уэлча. Для оценки статистической значимости отличий между независимыми выборками с равными дисперсиями использовали непараметрический критерий Манна - Уитни, при различных дисперсиях - критерий Уолда - Вольфовита.
Результаты и их обсуждение. Анализ полученных в работе данных показал, что у больных инфильтративным и диссеминированным ТЛ на фоне дефицита Т-лимфоцитов в крови секреция IFN-y in vitro - базальная и 1Ь-12/1Ь-27-индуцированная, не снижается, а напротив, увеличивается при наибольшей выраженности изменений при диссеминированном ЛУТЛ (табл. 1).
Таблица 1. Секреция 1РК-у лим( юцитами крови in vitro у больных туберкулезом легких, Ме (Q1-Q3)
Группы обследованных лиц Базальная секреция, пг/мл 1Ь-12ЛЬ-27-индуцированная секреция, пг/мл
Здоровые доноры 33,11 (17,94-40,15) 65,30 (59,28-85,34) р4 < 0,001
Больные инфильтративным туберкулезом легких ЛЧ 87,45 (47,54-106,00) p1 < 0,001 194,65 (150,22-259,32) p1 < 0,001; р4 < 0,001
ЛУ 96,85 (61,40-114,50) p1 < 0,001 202,18 (170,10-248,11) p1 < 0,001; р4 < 0,001
Больные диссеминированным туберкулезом легких ЛЧ 93,71 (68,18-121,41) p1 < 0,001 254,60 (216,17-298,63) p1 < 0,001; p2 < 0,05; р4 < 0,001
ЛУ 101,47 (68,66-127,12) p1 < 0,001 305,38 (201,43-373,02) p1 < 0,001; p2 < 0,05; р4 < 0,001
Примечание (здесь и далее): ЛЧ - лекарственно-чувствительный; ЛУ - лекарственно-
устойчивый; р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров; р2 - у больных с инфильтративным ТЛ; р4 - с показателями базальной секреции цитокина.
Одной из вероятных причин этого могла быть активация Т-клеток посредством внутриклеточной трансдукции сигналов с поверхностных рецепторов, стимулирующих лимфоциты к интерферонопродукции [7].
Однако в опровержение этому было показано, что во всех группах больных ТЛ, независимо от клинической его формы и чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам (ПТП), содержание в лимфоцитах активных (фосфорилированных, р-) форм тирозиновых киназ и факторов транскрипции 1АК-8ТАТ-сигналинга (р-1АК1, р-1АК2, р-ТУК2, р-8ТАТ1, р-8ТАТ4) (табл. 2), равно как и транскрипционного фактора T-bet в Т-клетках, оказалось существенно ниже, чем у здоровых доноров.
Таблица 2. Содержание киназ JAK1, JAK2, TYK2 и факторов транскрипции STAT1, STAT4 в лизатах лимфоцитов после ^-12/^-27-индукции in vitro у больных туберкулезом легких, Ме (Q1-Q3)
Показатель Группы обследованных лиц
Здоровые доноры Инфильтративный ТЛ Диссеминированный ТЛ
ЛЧ ЛУ ЛЧ ЛУ
р-JAO, пг/мл 20,90 (20,19-21,80) 17,75 (17,30-19,76) Р1 < 0,05 16,31 (15,70-16,86) Р1 < 0,05 18,76 (17,10-19,48) p1 < 0,05 15,44 (15,12-16,90) p1 < 0,05
р-JAO, пг/мл 18,63 (17,30-18,96) 15,22 (15,03-16,40) p1 < 0,05 14,95 (13,71-16,42) p1 < 0,05 16,62 (15,73-17,48) p1 < 0,05 14,03 (13,20-14,51) p1 < 0,05
р-TY^, пг/мл 20,92 (18,91-23,33) 13,26 (12,80-15,00) p1 < 0,01 12,60 (12,10-12,83) p1 < 0,001 14,14 (13,80-14,75) p1 < 0,01 12,04 (11,62-14,73) p1 < 0,001
р-STATl, пг/мл 46,55 (31,81-55,54) 29,43 (24,78-40,53) Р1 < 0,01 20,02 (19,64-21,45) p1 < 0,001 p3 < 0,01 22,20 (20,11-30,89) p1 < 0,001 20,26 (19,87-29,96) p1 < 0,001
р-STAT4, пг/мл 24,56 (17,93-30,01) 19,65 (13,71-22,92) p1 < 0,05 16,75 (12,74-18,55) p1 < 0,01 19,70 (14,81-20,35) p1 < 0,05 11,07 (10,10-16,92) p1 < 0,001 p2 < 0,01 p3 < 0,01
Примечание: р3 - у больных ЛЧТЛ (внутри каждой клинической формы)
Возможно, это связано с гипоэкспрессией на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов к IL-12 и IL-27 либо аномалией данных рецепторов, вследствие чего клетки не активируются и внутриклеточный каскад реакций, направленных на индукцию генов дифференцировки и синтеза IFN-y в клетках, не запускается [8, 9, 10].
Действительно, в результате анализа IFN-y-синтетической функции Т-клеток у больных ТЛ было выявлено снижение численности CD3IFN-y+ и CD3T-bet+ Т-лимфоцитов на фоне увеличения количества CD3 IFN-y+ и CD3T-bet+ клеток. Наиболее выраженными данные изменения были у больных диссеминированным ЛУТЛ.
Заключение. Учитывая, что увеличение секреции IFN-y in vitro у больных ТЛ сочетается с дефицитом CD3 IFN-y и CD3 T-bet Т-лимфоцитов и снижением содержания активных компонентов внутриклеточного JAK-STAT-сигнального пути, обусловливающих активацию, дифференцировку и IFN-у-синтетическую активность Т-клеток, следует полагать, что гиперсекреция IFN-y при ТЛ опосредована не Thl-клетками, а лимфоцитами других субпопуляций, в частности NK-клеток (натуральных или естественных киллеров). В пользу это свидетельствует увеличение у больных ТЛ содержания CD3IFN-y+ и CD3T-bet+ лимфоцитов в крови.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Совета по грантам Президента РФ (НШ-4184.2014.7).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Иммунопатология туберкулеза легких / О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. - Томск: Изд-во Томского университета, 2007. - 194 с.
2. Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: влияние M. tuberculosis на течение иммунитета / И.Е. Есимова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2012. - № 3. - С. 79-86.
3. Ивашкин В.Т. Основные понятия и положения фундаментальной иммунологии // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, еолопроктологии. - 2008. - № 4. - С. 4-13.
4. Чернушенко Е.Ф., Процюк Р.Г. Противотуберкулезный иммунитет (Часть I) // Украинский пульмонологический журнал. - 2010. - № 4. - С. 53-58.
5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. - СПб.: Фолиант, 2008. - 552 с.
6. Ярилин А.А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.
7. Минеев В.Н. Экспрессия транскприпционного фактора T-bet в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14, № 1/2. - С. 169-173.
8. McAleer P.J., Saris C.J., Vella A.T. The WSX-1 pathway restrains intestinal T-cell immunity // Int. Immunol. - 2011. - V. 23 (2). - P. 129-137.
9. Silver J.S., Hunter C.A. Gp130 at the Nexus of Inflammation, Autoimmunity, and Cancer // Journal of leukocyte biology. - 2010. - V.88 (6). - P. 1145-1156.
10. WSX-1 over-expression in CD4(+) T cells leads to hyperproliferation and cytokine hyperproduction in response to TCR stimulation / A. Takeda, S. Hamano, H. Shiraishi et al. // Int. Immunol. - 2005. - V. 17 (7). - P. 889-897.
Поступила 10.11.2014.
