CC BY
32
СИНТЕЗ И МЕТАБОЛИЗМ ОКСИДА АЗОТА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ И ПРИ ВОСПАЛЕНИИ
19 1 1 9
В.Ю. Титов , , В.Г. Вертипрахов , А.М. Долгорукова , А.Н. Осипов
1ФНЦ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства РАН, Россия
ФГБОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, Россия
Abstract
It is shown that the NO donors (nitrosothiols and dinitrosyl iron complexes) are a significant part of the total amount of nitro- and nitroso compounds in living tissues. In some cases, the concentration of NO donors exceeds the concentration of nitrate - the final product of NO oxidation. The concentration of nitrite and non-thiolate nitroso compounds normally does not exceed 100 nM. The concentration of these compounds increases in inflammatory processes. It is result of the interaction of superoxide produced by activated leukocytes with NO donors, but not the result of activation of NO synthesis. Since NO donors are highly effective superoxide traps, the appearance of nitrite and non - thiolate nitroso compounds in plasma at concentrations above 150 nM is a highly sensitive and highly specific marker of inflammation. Normally the result of activation of NO synthesis is the increase of concentration of NO donors but not nitrite and non - thiolate nitroso compounds. The intensity of transformation of the NO donors to nitrate depends on the availability of the physiological targets of NO.
Key words: nitric oxide (NO), dinitrosyl-iron complexes, nitrosothiols, inflammation
При помощи ферментного сенсора показано, что соединения - доноры оксида азота (нитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа) в живых тканях составляют значительную часть от общего состава нитро- и нитрозосоединений. В ряде случаев концентрация доноров NO превышает концентрацию нитрата - конечного продукта окисления NO в организме. В то же время концентрация нитрита и нетиолатных нитрозосоединений в норме не превышает 100 нМ. Концентрация этих соединений возрастает при воспалительных процессах и является следствием взаимодействия продуцируемого активированными лейкоцитами супероксида с соединениями-донорами NO, но не активации синтеза NO. Так как соединения-доноры NO являются высокоэффективными ловушками супероксида, появление нитрита и нетиолатных нитрозосоединений в плазме в концентрации свыше 150 нМ -высокочувствительный и высокоспецифичный маркер воспаления. Активация синтеза NO в норме сопряжена с увеличением концентрации соединений-доноров, но не нитрита и нетиолатных нитрозосоединений. Интенсивность
трансформации доноров N0 до нитрата зависит от наличия физиологической мишени N0.
Ключевые слова: оксид азота (N0), динитрозильный комплекс железа, нитрозотиолы, воспаление
В настоящее время считается, что оксид азота (N0) осуществляет свое физиологическое воздействие через так называемые соединения-доноры N0, продлевающие его физиологическое время жизни и предохраняющие от окисления до токсичного нитрита. Эту функцию выполняют Б-нитрозотиолы (RSN0), динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), а также некоторые органические нитросоединения. Предполагают, что именно эти соединения непосредственно взаимодействуют с мишенью N0 [1]. Но до сих пор нет однозначной информации касательно их содержания в живых тканях. Причина -несовершенство используемых методик [2]. Так содержание нитрозотиолов в крови в большинстве работ определяется в пределах 100 нМ. Есть данные и о большем их содержании - до нескольких микромоль [3]. Еще больше неясности о концентрации ДНКЖ в различных тканях. Содержание ДНКЖ определяют по соответствующему сигналу ЭПР. Но, как показано в ряде работ, существуют ЭПР-недетектируемые формы ДНКЖ, которые, согласно предположению авторов, в живых тканях преобладают [1].
В связи с этим интенсивность синтеза N0 обычно определяют по суммарному содержанию конечных его метаболитов - нитрита и нитрата ^0х).
Разработанный нами ферментный сенсор, основан на феномене обратимого ингибирования фермента каталазы нитритом и другими нитрозосоединениями с примерно равной эффективностью. Эффективность этого ингибирования усиливается на два порядка в присутствии хлорида в плазменной концентрации, а также бромида и тиоцианата. Мы предполагаем, что ингибитором является положительно заряженная N0 - группа, которую нитрозосоединения либо имеют исходно, либо приобретают под воздействием различных факторов [3]. ДНКЖ теряют ингибирующие свойства в среде, содержащей ловушку N0 и хелатор железа: хелатор разрушает комплекс, ловушка перехватывает N0. Нитрит (N0^) и нитрозоамины (RN0), а также нитрозотиолы в таких условиях сохраняют способность ингибировать. В то же время нитрозотиолы трансформируются в ДНКЖ под действием железа и тиолов и приобретают их свойства. Нитрат не имеет исходно ингибирующих свойств, но приобретал их, восстанавливаясь до нитрита под действием хлорида ванадия [3].
Нами показано, что в плазме крови содержатся соединения с ингибирующими свойствами ДНКЖ в концентрации от 2 до 20 мкМ и нитрат в концентрации от 20 до 150 мкМ. Содержание N02 и RN0 в норме не превышает 100 нМ, хотя согласно тесту Грисса, плазма содержит до нескольких микромоль нитрита. Это связано с тем, что ДНКЖ, распадаясь в кислой среде, также могут реагировать с реактивом Грисса как нитрит. Других нитро- и нитрозосоединений плазма крови не содержит. В крови больных, страдающих различными воспалительными заболеваниями, появлялась субстанция с ингибирующими
свойствами N02 и RN0. Она появлялась задолго до наступления клинических признаков и исчезала по мере выздоровления.
При активации в образце крови лейкоцитов зимозаном происходит снижение содержания субстанции с ингибирующими свойствами ДНКЖ и параллельное увеличение концентрации N02 + RN0. Концентрация нитрата не изменялась. Трансформация ДНКЖ в N02 и RN0 полностью предотвращалась супероксиддисмутазой. Трансформации не происходило также при извлечении из плазмы лейкоцитов путем центрифугирования. Но достаточно 700 клеток на микролитр, чтобы при их активации 30% пула ДНКЖ трансформировались до N0^ + RN0 [3].
Те же самые закономерности наблюдались в плазме при добавлении в нее препарата ДНКЖ. Он также трансформировался до N02 + RN0 под действием супероксида, продуцируемого активированными лейкоцитами. Но достоверного увеличения общего содержания нитро- и нитрозосоединений в плазме не было [3]. Следовательно, образование N02 + RN0 не связано с активацией синтеза N0, а с окислительной деструкцией уже имеющихся в плазме доноров N0.
У кур через 0,5 часа после начала кормления наблюдалось повышение концентрации ДНКЖ в крови в 2-2,5 раза. Концентрация нитрата при этом существенно не изменялась, нитрит и RN0 оставались в следовых количествах. То есть это повышение концентрации ДНКЖ не связано с активацией лейкоцитов.
Следовое содержание нитрита в норме во всех тканях, кроме слюны [3], говорит о том, что существуют механизмы, предохраняющие синтезированную молекулу N0 от окисления кислородом до нитрита. По-видимому, вновь синтезированный N0 сразу включается в состав нитрозотиолов или ДНКЖ, находясь в свободном состоянии минимальное время. То же самое и при передаче молекулы N0 с донора на мишень. В противном случае синтезированная молекула N0 с большой вероятностью будет окислена до нитрита и маловероятно ее взаимодействие с физиологически значимой мишенью.
Специфичность воздействия ДНКЖ, как донора N0, может быть достигнута, если это воздействие лимитируется состоянием мишени. На птичьих эмбрионах -относительно замкнутой системе, показано, что эмбрионы различных пород одного и того же вида имеют одинаковую интенсивность синтеза N0, который определяли по накоплению в эмбрионе доноров N0. Но интенсивность их трансформации до нитрата различна в десятки раз. То же наблюдалось при экзогенном введении доноров N0 в эмбрион. Показано, что этот эффект связан с интенсивностью постэмбрионального роста [4]. Нитрит и RN0 во всех случаях оставались в следовых количествах.
Таким образом, живые ткани в норме имеют механизмы, предотвращающие окисление оксида азота кислородом до нитрита. Интенсификация синтеза N0 сопряжена с увеличением содержания соединений - доноров, но не с увеличением содержания нитрита и нитрата. Нитрит и другие нетиолантные нитрозосоединения могут образоваться при взаимодействии с кислородом N0, находящегося вне соединений - доноров, а также при их взаимодействии с
активными формами кислорода, что имеет место при активации лейкоцитов. Взаимодействие оксида азота с физиологическими мишенями лимитируется наличием, или состоянием последних. По-видимому, таким образом достигается специфичность физиологического действия NO.
Список литературы
1. Vanin, A., Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide. 2009. Vol. 21. P. 1-13.
2. Tarpey, M.; Wink, D.; Grisham, M. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations // Am. J. Physiol. Regul. Integr Comp. Physiol. 2004. Vol. 286. P. R431-R444 .
3. Titov V.Y., Kosenko O.V., Starkova E.S., Kondratov G.V., Borkhunova E.N., Petrov V.A., Osipov A.N. Enzymatic Sensor Detects Some Forms of Nitric Oxide Donors Undetectable by Other Methods in Living Tissues // Bull. Exp. Biol. Med. 2016. Vol. 162, №1. P. 107-110.
4. Titov V.Yu., Vinnikova E.Z., Akimova N.S., and Fisinin V.I. Nitric oxide (NO) in bird embryogenesis: physiological role and ability of practical use // World's Poultry Science Journal. 2012. Vol. 68, №1. P. 83-95.
