CC BY
17Journal of Siberian Federal University. Biology 2 (2016 9) 153-161
УДК 579.6
Synthesis and Characterization of a Three Component Polyhydroxyalkanoates Containing Medium-Chain-Length Monomers of 3-Hydroxyhexanoate
Daria A. Syrvacheva*a and Natalia O. Zhilaa,b
aSiberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russia bInstitute of Biophysics SB RAS 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russia
Received 00.12.2015, received in revised form 00.02.2016, accepted 00.06.2016 The synthesis ofpoly(3-hydroxybutyrate/3-hydroxyvalerate/3-hydroxyhexanoate) [P(3HB/3HV/3HHx)] and poly(3-hydroxybutyrate/3-hydroxyhexanoate/diethylene glycol) [P(3HB/3HHx/DEG)] by Cupriavidus eutrophus B10646 was studied. Cultivation conditions of Cupriavidus eutrophus B10646 enabled production of high biomass yields and high content of the polymer. Three component copolymers [P(3HB/3HV/3HHx) and P(3HB/3HHx/DEG)] were synthesized with different content of 3HHx monomers. The physical and chemical properties of copolymers, including the degree of crystallinity, molecular weight and temperature characteristics and surface properties of the film samples were studied.
Keywords: polyhydroxyalkanoates, biosynthesis, copolymers, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, diethylene glycol, physical and chemical properties.
DOI:
© Siberian Federal University. All rights reserved
* Corresponding author E-mail address: syrvachevada@yandex.ru
Синтез и характеристика 3х-компонентных
полигидроксиалканоатов,
содержащих мономеры среднецепочечного
3-гидроксигексаноата
Д.А. Сырвачеваа, Н.О. Жилааб
аСибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 бИнститут биофизики Сибирского отделения РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгородок 50/50
Исследованы режимы выращивания Cupriavidus eutrophus B10646, обеспечивающие продуктивный синтез трехкомпонентных сополимеров ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата (3ГГ), а также 3-гидроксибутирата (3ГБ), 3-гидроксивалерата (3ГВ) и диэтиленгликоля (ДЭГ) при сохранении общих выходов ПГА и урожая биомассы клеток на высоком уровне. Синтезированы 3х-компонентные сополимеры [П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ ДЭГ)] с различным содержанием мономеров 3ГГ, и изучены их физико-химические свойства, включая степень кристалличности, молекулярно-массовые и температурные характеристики, а также свойства поверхности пленочных образцов.
Ключевые слова: полигидроксиалканоаты, биосинтез, сополимеры, 3-гидроксивалерат, 3-гидроксигексаноат, диэтиленгликоль, физико-химические свойства.
Введение
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - это семейство полимеров различной химической структуры, различающихся базовыми физико-химическими свойствами. В зависимости от строения мономеров, входящих в состав ПГА, они разделяются на коротко-цепочечные, среднецепочечные и длинно-цепочечные, соответственно, состоящие из мономеров с длиной С-цепи С3 - С5; С6 - С14; свыше См (Steinbüchel and Valentin, 1995). Особо перспективными ПГА являются сополимеры, имеющие низкую кристалличность и обладающие свойствами эластомеров. Это короткоцепочечные сополимеры 3- и 4-гидроксибутирата, а также сополимеры, содержащие, помимо короткоцепочечных,
среднецепочечные мономеры 3-гидрокси-гексаноата (3ГГ) или 3-гидроксиоктаноата (3ГО) (Madison and Huisman, 1999; Sudesh et al., 2000; Laycock et al., 2014). Однако синтез сополимерных ПГА является сложной биотехнологической задачей, так как для их получения в состав среды, как правило, необходимо внесение дополнительных источников углерода в качестве субстратов-предшественников целевых мономеров, которые в подавляющем большинстве ин-гибируют рост продуцентов. Это негативно сказывается на общей продуктивности процесса биосинтеза (как на приросте биомассы клеток, так и на выходах сополимеров) (Bhubalan et al., 2008, 2010; Cavalheiro et al., 2012).
Возможности продуктивного синтеза ПГА, содержащих мономеры 3-гидрокси-гексаноата, дополнительно осложняются спецификой метаболизма гексаноата как субстрата-предшественника, так как он ме-таболизируется в цикле ув-окисления жирных кислот на более короткие фрагменты (С4 + С2), снижая тем самым количество субстрата для образования и включения в полимерную цепь мономеров 3ГГ. Поэтому получение высоких выходов ПГА с высоким содержанием среднецепочечных мономеров - трудно реализуемая задача, для ее решения необходимо организовать условия, при которых блокируются реакции ^-окисления гексаноата. Трудности регламентированного и воспроизводимого синтеза сополимерных ПГА сдерживают накопление знаний о влиянии состава мономеров на физико-химические свойства полимера.
Это определило направленность настоящей работы, ориентированной на изучение возможности продуктивного синтеза ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата и выявление взаимосвязи между структурой сополимеров этого типа и их свойствами.
Материалы и методы
Исследована культура бактерий Cupriavidus eutrophus B10646, характеризующаяся способностью синтезировать ПГА на различных углеродных субстратах. Для выращивания бактерий за основу принята минеральная среда Шлегеля (Schlegel et al., 1961). Бактерии выращивали в периодической авто-трофной и гетеротрофной культурах в режиме синтеза ПГА с лимитированным содержанием азота в среде (40 % от потребности культуры в элементе). Длительность культивирования составляла 48-72 ч. Проведено четыре серии экспериментов. В первой серии эксперимен-
тов бактерии выращивали в периодической автотрофной (СО2+Н2+О2) культуре. Для синтеза многокомпонентных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксивалерата (3ГВ) и 3-гидроксигексаноата (3ГГ), в состав среды в качестве субстратов-предшественников вносили валерат натрия (0,5 г/л) и гексаноат натрия («Acros Organics», США). С учетом возможного усиления токсичности при соче-танной подаче в культуру валерата натрия и гексаноата натрия, последний вносили дробно в течение всего эксперимента через каждые 6-8 ч (концентрация разовой дозы в различных экспериментах варьировала от 0,5 до 0,7 г/л). Общее количество добавок гексаноата натрия в разных экспериментах составляло от одной до трех. Далее во второй, третьей и четвертой сериях экспериментов бактерии выращивали в периодической гетеротрофной культуре. В качестве основного ростового субстрата использовали глюкозу в концентрации 10 г/л. Для блокирования реакций цикла в-окисления жирных кислот и усиления синтеза мономеров 3ГГ в культуру при выращивании бактерий на гетеротрофных субстратах одновременно с гексаноатом натрия вносили акрилат натрия («Sigma», США). Подачу гек-саноата натрия и акрилата натрия в культуру делали через каждые 6-8 ч в течение эксперимента в концентрациях 0,5 и 0,05 г/л, соответственно. Во второй серии экспериментов в качестве субстратов-предшественников для синтеза мономеров 3ГВ использовали валерат натрия, а в третьей - пропионат натрия в различных концентрациях (0,5; 0,7; 1,0 г/л), которые вносили в культуру однократно на 3842 ч культивирования бактерий. В четвертой серии экспериментов исследована возможность получения 3х-компонентных сополи-мерных ПГА, в которых, помимо мономеров 3ГБ и 3ГГ, присутствуют мономеры диэти-ленгликоля (ДЭГ). Диэтиленгликоль (ОАО
«Нижнекамскнефтехим», Россия) подавали однократно в концентрации 30 г/л в культуру различного возраста (1, 24, 48 ч культивирования).
Накопление биомассы в культуре определяли измерением оптической плотности и по весу абсолютно сухого вещества. Внутриклеточное содержание и состав ПГА определяли на хромато-масс-спектрометре Agilent Technologies 7890А с масс детектором Agilent Technologies 5975С («Agilent», США). Для определения мономеров диэ-тиленгликоля сняты 'H-ЯМР спектры растворов полимеров в дейтерированном хлороформе (CDCl3) с использованием ЯМР-спектрометра Advance III 600 («Bruker», Германия).
Физико-химические свойства полученных ПГА исследовали с применением рент-геноструктурного анализа (D8 Advance, «Bruker», Германия), дифференциального термического анализа (DSC-1, Mettler Toledo, Швейцария) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (Agilent Technologies 1260 Infinity, Германия). Для анализа структуры поверхности были изготовлены плотные гладкие пленки из 1,5 % растворов ПГА в хороформе методом полива растворов полимеров с последующим испарением растворителя. Микроструктуру поверхности пленочных образцов исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии S5500 («Hitachi», Япония), свойства поверхности - на приборе для измерения краевых углов смачивания поверхности DSA-25E («Kruss», Германия).
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования возможности синтеза трехкомпонентных ПГА [П(3ГБ/3ГВ/3ГГ)] культурой C. eutrophus В10646 в автотрофных условиях при подаче в культуру двух субстратов-предшественников - валерата натрия и гек-саноата натрия представлены на рис. 1а. С увеличением концентрации гексаноата натрия в культуре содержание мономеров 3ГГ в П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) увеличивалось. Максимальное включение 3ГГ (17-25 мол.%) зарегистрировано при подаче в культуру 3-х добавок гексаноата натрия (суммарно до 2,0-2,1 г/л). При этом общий выход сополимера составлял 45 % от веса сухой биомассы, а урожай биомассы находился на уровне 2,3-2,5 г/л. Содержание мономеров 3ГВ в П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) в разных опытах варьировало от 21 до 30 мол.%.
Для повышения продукционных характеристик культуры C. eutrophus В10646 ав-тотрофный углеродный субстрат был заменен гетеротрофным (глюкоза). Во второй и третьей серии экспериментов общий выход сополимера и содержание в нем мономеров 3ГВ и 3ГГ мало зависели от концентрации субстратов-предшественников (рис. 1 б, в). Однако выход сополимера в экспериментах с валератом натрия достигал 38 - 44 % от веса сухой биомассы при суммарном содержании мономеров 3ГВ и 3ГГ на достаточно высоком уровне (43-48 мол.%). Доля мономеров 3ГВ варьировала от 33 до 41 мол.%, доля мономеров 3ГГ была ниже (7-15 мол.%) (рис. 1б).
При замене валерата натрия пропионатом натрия (рис. 1в) общий выход П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) увеличился до 45-52 % от веса сухой биомассы, при этом суммарное содержание мономеров 3ГВ и 3ГГ было несколько ниже (на уровне 27-31 мол.%). Доля мономеров 3ГГ в сополимере составляла от 12 до 16 мол.%;
Рис. 1. Росткультуры Cupriavidus eutrophus B10646 и синтез 3 х-компонентных сополимеров П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) в автотрофных условиях (1а), П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) (1б, 1в) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ) (1г) в гетеротрофных условиях при различном режиме дозирования гексаноата натрия, акрилата натрия, валерата натрия (1а, 1б, 1г) или пропионата натрия (1в). 1а - 2* и 3* - количество добавок гексаноата натрия при концентрации валерата натрия 0,5 г/л; 1б и 1в - разовая добавка гексаноата натрия и акрилата натрия составляла 0,5 и 0,05 г/л соответственно при концентрациях валерата натрия или пропионата натрия 0,5; 0,7; 1,0 г/л; 1г -однократная подача ДЭГ (30 г/л) на 1, 24 или 48 ч культивирования и дробной подаче гексаноата натрия и акрилата натрия в культуру (разовая доза 0,5 г/л и 0,05 г/л, соответственно)
мономеров 3ГВ - 14-15 мол.%. Максимальное содержание сополимера в клетках бактерий (52 % от веса сухой биомассы) получено при минимальной концентрации пропионата натрия в культуре (0,5 г/л). Урожай биомассы во всех экспериментах находился в границах 4,0 - 4,5 г/л.
Исследована возможность получения Зх-компонентных сополимерных ПГА нового типа, в которых, помимо мономеров 3ГБ и ЗГГ, присутствуют мономеры диэтиленгли-коля (ДЭГ). Эти сополимеры относят к «необычным» ПГА. Известно, что при наличии
в культивационной среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) возможен микробиологический синтез диблок-сополимера ПГА/ПЭГ, где карбоксильный конец (-COOH) цепей ПГА ковалентно связан эфирной связью с цепью ПЭГ Это явление было названо «PEGylation» (Foster, 2007). Для синтеза Зх-компонентных П(3ГБ/3ГГ/ ДЭГ) культивирование бактерий C. eutrophus В10646 проводили в гетеротрофных условиях с использованием раствора глюкозы, где в качестве субстрата-предшественника для синтеза мономеров этиленгликоля (ЭГ) использовали диэтиленгликоль (ДЭГ) наряду с
добавками гексаноата натрия и акрилата натрия (рис. 1г).
Урожай биомассы клеток в опытах имел близкие значения (2,5-2,7 г/л). Однако выход сополимера и содержание в нем мономеров 3ГГ и ДЭГ варьировали. Наибольшее включение мономеров этиленгликоля (0,5 и 0,7 мол.%) зафиксировано при подаче ДЭГ в раннюю культуру (1 и 24 ч, соответственно). При этом доля 3ГГ мономеров составляла 0,3 мол.%. При более поздней подаче ДЭГ в культуру (48 ч) содержание ЭГ было ниже (0,15 мол.%), в то время как содержание мономеров 3ГГ увеличилось до 3,0 мол.%. Общий выход сополимера находился в диапазоне от 40 до 61 % от веса сухой биомассы в зависимости от времени добавления ДЭГ в культуру.
Таким образом, варьируя подаваемые в среду субстраты-предшественники, их концентрацию в культуре, а также условия углеродного питания, синтезирована уникальная линейка трехкомпонентных ПГА с содержанием 3ГВ от 14 до 41 мол.%, 3ГГ от 2 до 16 мол.% и ДЭГ от 0,15 до 0,7 мол.% (таблица).
При изучении молекулярно-массовых характеристик 3х-компонентных сополимеров показано, что для них характерно снижение значений средневесовой молекулярной массы и возрастание полидисперсности по сравнению с гомополимером П(3ГБ) (таблица). Особенно это было выражено у образцов П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ), для которых зарегистрированы самые высокие значения полидисперсности (ПД) (до 7,02 и 15,42). У одного образца П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ) обнаружена гетерогенность фракций с различными значениями МВ: низкомолекулярного (14 кДа) и высокомолекулярного (731 кДа). Также во всех синтезированных 3х-компонентных образцах [П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ)] наблю-
дались изменения термического поведения и появление двух пиков в области плавления. Первый пик плавления зафиксирован в области 148-156 °С; второй - 162-171 °С. Температура термической деградации образцов П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ) и образцов П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) с различным содержанием мономеров 3ГВ, 3ГГ и ДЭГ практически не изменялась относительно П(3ГБ) (290 °С) и находилась в диапазоне от 288 до 297 °С. Степень кристалличности сополимеров с диэтиленгликолем (68-75 %) имела незначительные различия с гомополимером (76 %), в то время как у П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) эти показатели были ниже и составляли 43-61 % (таблица).
Для исследования биологических свойств 3х-компонентных ПГА были получены плотные гладкие пленки. РЭМ снимки пленок представлены на рис. 2. По результатам РЭМ морфология поверхности сопо-лимерных пленок значительно отличается от поверхности пленок из гомополимера П(3ГБ), имеющих более гладкую плотно -зернистую поверхность с малым количеством мелких пор. Пленки сополимерных образцов имеют более выраженный рельеф, отличающийся наличием множества пор (от 1 до 23 на см2) различного диаметра (от 5 до 75 мкм).
Анализ свойств поверхности пленок из ПГА различного химического состава включал измерение краевых углов смачивания водой и дийодметаном с последующим вычислением свободной поверхностной энергии, ее дисперсной и полярной составляющих (таблица). Результаты показали отличия в величине краевых углов смачивания водой; у пленок, изготовленных из П(3ГБ/3ГВ/3ГГ), угол составлял 74,8-88,2°, у гомополимера П(3ГБ) -92,8°. Значения свободной энергия межфазной поверхности исследуемых полимеров были близки - 30,5-36,5 эрг/см2 и 35,9 эрг/см2, соот-158 -
Таблица - Химический состава и физико-химические свойства, включая свойства поверхности пленок, Зх-компонентных ПГА - П(ЗГБ/ЗГВ/ЗГГ) и П(ЗГБ/ЗГГ/ ДЭГ) с различным соотношением мономеров 3ГБ, ЗГВ, ЗГГ и ДЭГ
Состав ПГА, мол.% Мв, кДа пд Сх, % т °г т °г Контактные краевые углы смачивания водой,град Контактные краевые углы смачивания дийодмета ном, град Свободная энергия межфазной поверх-ности, (эрг/см2) Свободная энергия межфазной поверх ности -полярная часть, ЗЪь. (эрг/см2)
3ГБ ЗГВ ЗГГ ДЭГ Пик 1 Пик 2 Пик 1 Пик 2
100 0 0 0 920 - 2,52 76 - 178 290 92,8 ± 0,7 49,4 ± 0,6 35,9 ± 0,4 1,3 ±0,1
73 25 2 0 574 - 3,55 43 150 162 296 74,8 ± 3,4 54,9 ± 1,4 35,1 ± 1,3 10,5 ± 0,7
52 41 7 0 480 - 3,55 60 149 167 292 88,2 ± 1,4 49,5 ± 0,8 34,1 ± 0,6 2,9 ±0,2
57 33 10 0 557 - 3,22 60 148 164 290 78,9 ± 1,0 49,4 ± 2,3 35,8 ± 1,7 6,9 ± 0,4
73 15 12 0 615 - 3,15 61 150 166 296 84,6 ±2,2 51,2 ±2,0 36,5 ± 1,0 3,7 ± 0,2
53 32 15 0 482 - 4,03 47 152 167 297 76,5 ± 1,5 66,8 ± 1,8 30,5 ± 1,0 12,5 ±0,4
70 14 16 0 511 - 4,20 61 148 166 288 85,7 ± 1,5 50,5 ±2,4 33,9 ± 1,8 3,9 ± 0,4
99,2 0 0,3 0,5 102 - 7,02 68 150 169 294 100,8 ± 1,0 51,4 ± 1,6 33,7 ± 0,3 0,3 ±0,1
99,0 0 0,3 0,7 731 14 4,95 75 154 171 291 89,2 ± 1,7 52,8 ± 1,4 35,0 ± 0,4 2,3 ±0,1
96,85 0 3,0 0,15 576 - 15,42 72 156 171 292 92,2 ± 3,6 54,4 ± 4,2 33,5 ± 1,0 1,7 ± 0,2
Примечания: Мв _ средиевесовая молекулярная масса, кДа; ПД - полидисперсность; Сх _ степень кристалличности, %; Тпл - температура плавления, °С; ТДЕГР - температура термической деградации, °С.
ЩЗГБ/ЗП7ДЭГ} ЩЗГБ/ЗГГ/ДЭГ} П(ЗГБ/ЗГТ/ДЭГ>
(98,85/3,0/0,15) (99,2/0,3/0,5) (99,0/0,3/0,7)
Рис. 2. РЭМ снимки пленок, полученных из П(3ГБ), П(3ГБ/3ГВ/3ГГ), П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ) с различным содержанием (мол.%) мономеров 3ГБ, 3ГВ, 3ГГ и ДЭГ (маркер 100 мкм)
ветственно. Показано увеличение величины полярной энергии (2,9 - 12,5 эрг/см2) у пленок из П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) в сравнении с таковой у П(3ГБ) (1,30 эрг/см2), что косвенно характеризует поверхность данных образцов как более гидрофильную. Полимерные пленки, содержащие в составе мономеры этиленгликоля (ЭГ), по измеряемым показателям близки к гомополимеру П(3ГБ) - краевой угол смачивания водой - 89,2-100,8°, свободная энергия межфазной поверхности - 33,5-35,0 эрг/см2, величина полярной энергии - 0,3-2,3 эрг/см2.
Заключение
Реализована возможность синтеза 3х-компонентных сополимерных ПГА, содержащих в своем составе мономеры 3-гидркоисгексаноата (3ГГ), а также мономеры 3-3ГБ, 3ГВ и ДЭГ. Синтезировано семейство 3х-компонентных сополимеров
[П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ)] с различным набором и соотношением мономеров и исследованы их физико-химические свойства. Показана вариабельность молекулярно-массовых характеристик без четкой связи с составом сополимеров и сохранение термостабильности. Зафиксирована гетерогенность по величине молекулярной массы у П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ) и изменения в термическом поведение отдельных сополимерных ПГА. При анализе свойств поверхности пленок из ПГА показано увеличение величины полярной энергии у пленок из П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) в сравнении с таковой у П(3ГБ), что косвенно характеризует поверхность данных образцов как более гидрофильную, в то время как полимерные пленки, содержащие в составе мономеры этиленгликоля (ЭГ), по измеряемым показателям близки к значениям гомополи-мера П(3ГБ).
Работа выполнена за счет средств государственного задания на проведение фундаментальных исследований РАН (проект № гос. регистрации 01201351505).
Список литературы
Bhubalan K., Lee W.H., Loo C.Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. (2008) Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate) from mixtures of palm kernel oil and 3HV-precursors. Polym. Degrad. Stabil., 93: 17-23.
Bhubalan K., Rathi D.N., Abe H., Iwata T., Sudesh K. (2010) Improved synthesis of P(3HB-co-3HV-co-3HHx) terpolymers by mutant Cupriavidus necator using the PHA synthase gene of Chromobacterium sp. USM2 with high affinity towards 3HV. Polym. Degrad. Stabil., 95: 1436-1442.
Cavalheiro J.M.B.T., Raposo R.S., de Almeida M.C.M.D., Cesario M.T., Sevrin C., Grandfils C., da Fonseca M.M.R. (2012) Effect of cultivation parameters on the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator using waste glycerol. Biores. Technol., 111: 391-397.
Foster L.J.R. (2007) Biosynthesis, properties and potential of natural-synthetic hybrids of polyhydroxyalkanoates and polyethylene glycols. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 1241-1247.
Laycock B., Arcos-Hernandez M.V., Langford A., Buchanan J., Halley P. J., Werker A., Lant P.A., Pratt S. (2014) Thermal properties and crystallization behavior of fractionated blocky and random polyhydroxyalkanoate copolymers from mixed microbial cultures. J. Appl. Polym. Sci., 131: 4083640854.
Madison L.L., Huisman G.W. (1999) Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21-53.
Schlegel H.G., Kaltwasser H., Gottschalk G. (1961) A submersion method for culture of hydrogen-oxidizing bacteria: growth physiological studies. Arch. Microbiol., 38: 209-222.
Steinbüchel A., Valentin H.E. (1995) Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoiv acids. FEMS Microbiol. Lett, 128: 219-228.
Sudesh K., Abe H., Doi Y. (2000) Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci., 25: 1503-1555.
