CC BY
80
Лечение и профилактика
УДК 547.481:546.183:591.69-9:615.284
СИНТЕЗ И АПРОБАЦИЯ НОВЫХ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ*
И.В. ГАЛКИНА1 кандидат химических наук
М.Х. ЛУТФУЛЛИН2 доктор ветеринарных наук С.Н. ЕГОРОВА3 доктор фармацевтических наук Р.Ф. МАВЛИХАНОВ2
аспирант Н.А. ЛУТФУЛЛИНА2 ассистент А.М. ИДРИСОВ2 Н.В. ВОРОБЬЕВА3 кандидат фармацевтических наук Р.И. ХАМИДУЛЛИН3 доктор медицинских наук, академик РАЕН Л.М. ЮСУПОВА4 доктор химических наук Л.В. СПАТЛОВА4 кандидат химических наук В.И. ГАЛКИН1 доктор химических наук 1 Химический институт им. А.М. Бутлерова КГУ, e-mail: vig54@mail.ru 2Казанская государственная академия ветеринарной медицины 3Казанский государственный медицинский университет, e-mail: zimsve@yandex.ru 4Казанский государственный технологический университет
Предложена новая концепция антигельминтного средства, состоящего из четвертичной соли фосфония с высшим алкильным радикалом в качестве «мембранного якоря» и нитрозамещенного бензофуроксана в качестве генератора NO, реализованная в разработке препарата дегельм. Дегельм нарушает энергетический обмен у гельминтов, проникая через мембраны клетки и митохондрий, разрушая мышечную кутикулу, и приводит к фрагментарной деструкции паразита. Проведена экспериментальная апробация дегельма на свиньях при нематодозах, вызываемых Ascaris suum, Oesophagostomum dentatum и Trichocephalus suis. Острая токсичность препарата равна 3500 мг/кг. Дегельм не обладает токсическим действием, относится к 4 классу опасности и приводит к фрагментации кутикулы нематод при применении в низких дозах.
Ключевые слова: антигельминтик, дегельм, соли фосфония, динитробунзофуроксан, свиньи, синтез.
(* Работа выполнена при финансовой поддержке совместной российско-американской программы «Фундаментальные исследования и высшее образование» (BRHE), REC-007, BP4M07; гранта Минобрнауки РФ № 2.2.2.2/5013)
99
Лечение гельминтозов - довольно сложная терапевтическая проблема. По сути, это изгнание одного животного организма из другого. В отличие от простейших, грибов, вирусов и бактерий, имеющих достаточно «нежный» покров, многие гельминты, а особенно нематоды, имеют многослойную мышечную кутикулу, которая надежно защищает органы паразита. Однако гельминты чувствительны к химическим веществам, влияющим на их моторную активность и реакции энергетического обмена. Поэтому необходим молекулярный подход к синтезу новых антигельминтных лекарственных средств, который необходимо строить на значительных физиологических и биохимических различиях между паразитом и хозяином.
Одной из основных задач синтетиков является направленный синтез ан-тигельминтных лекарственных веществ, сочетающих высокую селективную токсичность для паразитов и низкую токсичность для человека. Подобная избирательность должна быть основана на существенных физиологических и биохимических различиях между паразитом и хозяином, а также между самими паразитами, в аспекте различного строения клеточных мембран, кутикул, ферментативной и нервной систем и т. д.
Целью наших исследований было теоретическое обоснование антигель-минтного действия композиции четвертичной соли фосфония с высшим ал-кильным радикалом в качестве «мембранного якоря» и нитрозамещенного бензофуроксана в качестве генератора N0, и экспериментальное изучение ее эффективности при нематодозах.
Материалы и методы
Для экспериментальной апробации композиции дегельм разработана лекарственная форма - крахмальные облатки, заполненные микродисперсным порошком активных компонентов и глюкозы, которая является основным питательным веществом для гельминтов («приманкой»). Пероральная лекарственная форма содержала 0,025 г соли фосфония «А» (н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид), и (или) 0,250 г динитробензофуроксана «Б» (5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан) и глюкозу до 0,5 г.
Антигельминтную активность дегельма исследовали на 6 поросятах обоего пола, 3-4-месячного возраста (23-25 кг) в ООО «Колос» Тетюшского района Татарстана, а также в условиях вивария кафедры паразитологии Казанской академии ветеринарной медицины.
У каждого спонтанно инвазированного нематодами животного индивидуально брали пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц гельминтов по методу Фюллеборна. На основании результатов гельминтоовоскопиче-ских исследований отобрали 6 свиней и разделили на 3 группы по 2 животных в каждой. Характеристика животных до лечения и дозы препаратов на курс дегельминтизации приведены в таблице 1. Во всех группах животных картина крови до лечения характеризовалась анемией, лейкоцитопенией, эритроцитопенией.
В 1 -й группе свиней применяли композицию дегельм (0,025 г н-гексадецилтрифенилфосфонийбромида (А); 0,250 г динитробензофуроксана (Б) и 0.250 г глюкозы), во 2-й группе - соль фосфония (0,025 г соли фосфония (А) и 0.475 г глюкозы), в 3-й группе - динитробензофуроксан (0.250 г динитробензофуроксана (Б) и 0.250 г глюкозы). Исследуемые препараты вводили животным перорально в облатках с кормом 1 раз в день утром в течение 2-х дней.
Фекалии свиней исследовали через 1, 2, 3 и 4 нед после применения испытуемых препаратов.
1. Характеристика подопытных животных до лечения и дозы активных __ ингредиентов__
№ свинки № груп пы Диагноз Кол-во яиц в 1 г фекалий до лечения Картина крови до лечения Дозы веществ А и Б на курс лечения
1 1 Аскаридоз 140±6,8 Анемия, лейкопения, эритроци-топения 100 мг (А); 4 мг/кг 1000 мг (б); 40 мг/кг
2 1 Аскаридоз, эзофагостомоз 120±7,1 28±8,3 Анемия, лейкопения, эритроцитопения 100 мг (А); 4 мг/кг 1000 мг (б); 40 мг/кг
3 2 Аскаридоз 210±9,4 30±6,9 Анемия, лейкопения, эритроцитопения 100 мг (А) (4 мг/кг)
4 2 Аскаридоз, трихоцефалез 196±11,2 70±6,7 Анемия, лейкопения, эритроцитопения 100 мг (А) (4 мг/кг)
5 3 Аскаридоз, трихоцефалез ,4 ,6 г-" "ч" -н -н 00 82 Анемия, лейкопения, эритроцитопения 1000 мг (Б) (40 мг/кг)
6 3 Аскаридоз, эзофагостомоз 180 ±7,5 30±6,7 Анемия, лейкопения, эритроцитопения 1000 мг (Б) (40 мг/кг)
Результаты и обсуждение Антинематодозные препараты различной химической структуры, за небольшим исключением, по механизму действия делятся на две группы. К первой группе относятся вещества, влияющие на моторную активность, - нарушающие нейромышечную передачу и вызывающие паралич (производные диэтилендиамина, этаноламина, пиримидина и др.), ко второй - вещества, нарушающие энергетический обмен (хлорорганические углеводороды, производные бензимидазола и метилового эфира бензимидазолкарбаминовой кислоты и др.) [4].
Синтезированный нами препарат не является ни одним из вышеописанных производных, и механизм его действия сводится к разрыву мембраны гельминта. Аналогичное действие оказывает близкий по строению бензалко-ния хлорид, использующийся в качестве антисептика и спермицида в вагинальном контрацептиве «Фарматекс» [1].
СН2СН2ОН
^ц^4 ® ,СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН3 ,,— СН2—\ /\ / \ /\2/ х ' \2 / \2/ 3 // 2/ СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2
С1 СН2СН2ОН
Химическая структура бензалконий хлорида
Спермицидное действие обусловлено способностью соли четвертичного основания - бензалконий хлорида - повреждать мембраны сперматозоидов: вначале жгутиков, затем головок. Важно отметить, что при этом бензалконий хлорид не влияет на сапрофитную микрофлору, в том числе на палочку До-дерляйна.
101
Таким образом, можно предположить, что лекарственные вещества, содержащие в своей химической структуре «мембранный якорь» [7] в виде высшего алкильного радикала (от С10 до С18) способны в низших живых организмах повреждать поверхностные мембраны благодаря сходству с ними в строении:
ffi^3 O O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 ,CH2 CH2
H3C-N-O-P-O-CH2 C—CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 O ж—o'
CH^O СШ CH2 .C№ ,C№ /CHVCH2 ^H2 CH2 CH2
4C-CH2VH2 YH2VH2XCH2XCH2XCH2XCH>H>h3
II 22
O
Фосфолипид биомембраны клетки
Важно отметить, что синтезированные нами соли фосфония (А) являются структурными аналогами фрагментов фосфолипидов биомембран клетки.
В свете вышесказанного, предложен новый по механизму действия комбинированный противонематодозный препарат на основе синтезированных нами четвертичной соли фосфония с липидной компонентой биомембран (А) и бис-нитроанилинозамещенного динитробензофуроксана (Б) - дегельм:
Компонент (А) представляет собой катионный детергент, который встраивается в клеточную мембрану кутикулы нематод, взаимодействуя с ней, блокирует ее барьерные функции и вызывает деструкцию нематод. Таким образом, компонент А разрушает кутикулу нематод и делает ее доступной для проникновения пищеварительных соков хозяина внутрь паразита. Полифункциональный компонент (Б), обладая сам значительно более низкой антигельминтной активностью и высокой антибактериальной [5], существенно усиливает активность компонента А своей способностью генерировать до 6 молекул N0 из одной молекулы бензофуроксана [6, 9] под действием серосодержащих (И28) компонентов кишечника, что позволяет заметно снизить концентрацию компонента (А) в композиции. Аналогичное тиол-зависимое высвобождение оксида азота из фуроксанов подробно описано в исследовании [8]. Механизм синергизма (А) и (Б) пока остается открытым, можно лишь констатировать факт значительной активизации процесса встраивания ли-пидного «хвоста» синтетического аналога биомембраны в мембрану кутикулы паразита, что в конечном итоге приводит к разрыву последней.
Взаимодействие фосфониевых бромидов с лецитином на модели ленгмю-ровских монослоев описано в работе [2], данные которой показывают, что фосфониевые бромиды взаимодействуют с лецитином и, следовательно, могут включаться в липидные слои биомембран паразитов, кардинально изме-
102
няя их состояние, приводя в предельном случае к разрыву биомембраны, что может служить объяснением антибактериального и антипаразитарного эффекта трифенил(алкил)фосфоний бромидов.
Результаты копрологических исследований и оценка состояния животных после применения дегельма приведены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, полная дегельминтизация свиней произошла только в 1-й группе, принимавшей дегельм (А, Б и глюкоза); процесс дегельминтизации прошел в течение 1-2 сут с дальнейшим 2-х недельным постепенным очищением организма от остатков гельминтов и мертвых яиц. Показатели крови нормализовались через 2 нед. Появлявшийся временно в течение первой недели кашель свидетельствовал о гибели личинок нематод в легких, а аллергические реакции были связаны с одновременной гибелью большого количества нематод. Кашель и аллергия были выражены незначительно и прошли самопроизвольно. Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились у 2-х животных: один раз на 10-е сутки у 1-й свинки и дважды у 2-й свинки на 7 и 10-е сутки. Методом микроскопии в пластилинообразных по консистенции фекалиях поросят было обнаружено большое количество яиц разного срока созревания и разной степени деструкции крышечек, а также ишемические и некротические обрывки мышечной ткани кутикулы нематод в скрученном, задубленном состоянии.
По сравнению с поросятами 2 и 3-й групп, в 1-й группе животные после дегельминтизации были наиболее активны, поноса и каких-либо других побочных эффектов приема препаратов не наблюдали. Необходимо отметить улучшение общего состояния животных и хороший аппетит после приема дегельма. При патолого-анатомическом исследовании гельминты в кишечнике не обнаружены.
Во 2 группе, получавшей соль фосфония (А и глюкоза), картина дегельминтизации оказалась более размытой и очищение организма хозяина от-гельминтов более плавным. Показатели крови нормализовались в течение 3-х нед. У 4-й свинки произошел затяжной процесс очищения. Таким образом, несмотря на разрушение кутикулы нематод под действием соли фосфония, прием соли без динитробензофуроксана оказался менее эффективным, чем их сочетание в композиции дегельм (группа 1).
В 3-й группе поросят, получавших динитробензофуроксан (Б и глюкоза), наряду с дегельминтизацией (выход мертвых неполовозрелых аскарид длиной от 8 до 15 см) через 4 нед количество яиц паразитов не изменялось, а в дальнейшем у шестой свинки появилась тенденция к их росту на фоне присоединившейся кишечной инфекции, что проявлялось диареей, исхуданием животного и сопровождалось лейкоцитозом крови. Таким образом, несмотря на наличие антигельминтной активности у динитробензофуроксана, применение его менее эффективно по сравнению с композицией дегельм, содержащей динитробензофуроксан и соль фосфония, т. к., во-первых, кутикула нематод не разрушается, и, во-вторых, присоединяется кишечная инфекция.
Появление большого количества яиц разного срока созревания в 1 и 2-й группах поросят объясняется нарушением целостности кутикулы гельминтов, а также матки и яйцеводов, что делает тело гельминта доступным для пищеварительных соков кишечника хозяина. Результаты выращивания (инкубация) личинок из полученных таким образом яиц нематод однозначно показали полное отсутствие развития последних по сравнению с контрольным выращиванием.
Острая токсичность антигельминтной композиции дегельм» (ЛД50 3500 мг/кг у мышей при внутрибрюшинном и пероральном способах введения) соответствует категории «малоопасные» - VI классу токсичности [8], что расширяет перспективы медицинского применения разработанного препарата.
__103
Российский паразитологический журнал, 2010, № 2
2. Результаты копрологических исследований свиней после применения лекарственного препарата дегельм и его компонентов
№ № группы, Диагноз Кол-во яиц в 1 г фекалий через, нед Примечание
свинки препарат 1 2 3 4
1 1 Дегельм Аскаридоз 10500±7 фрагментация яиц и кутикул 3500±5,7 фрагментация яиц и кутикул 1420±6,7 фрагментация яиц 0 Фрагменты аскарид (2 нед), разрушенные яйца разных сроков созревания, аллергия, кашель (1 нед), на 2-й неделе показатели крови пришли в норму
2 1 Дегельм Аскаридоз, эзофагостомоз 8950±8,9 284±8,3 фрагментация яиц и кутикулы 3410±9,2 52±8,5 фрагментация яиц и кутикулы 1100±9,1 фрагментация яиц 37±8,7 Фрагменты эзофагостом (1 нед), аскарид (2 нед), разрушенные яйца разных сроков созревания, аллергия (1нед), на 2-й неделе показатели крови пришли в норму
3 2 Аскаридоз 14120±9,4 4840±7,8 2120±5,9 425±6,0 Состояние стабильное, без изменений
«А» 285±6,9 68±6,4 16±5,5 (1-2 нед), на 3-й неделе показатели крови пришли в норму
4 2 Аскаридоз, 7750±8,8 1320±5,9 2630±7,8 730±6,0 Состояние стабильное, без изменений
«А» трихоцефалез 270±6,1 68±7,5 42±6,8 18±5,8 (1-2 нед), на 3-й неделе показатели крови пришли в норму
5 3 «Б» Аскаридоз, трихоцефалез 80±7,4 20±5,6 68±7,3 36±7,4 26±7,9 15±5,9 22±8,3 7±5,8 Вышло 9 мертвых аскарид с прозрачной кутикулой, показатели
выход мертвых аска- выход мертвых аска- выход мертвых аска- выход мертвых аска- крови к 3-й неделе пришли в норму
рид рид рид рид
6 3 «Б» Аскаридоз, эзофагостомоз 180±7,5 30±6,7 160±7,7 17±5,4 выход мертвых аскарид 46±7,5 28±8,5 выход мертвых аскарид 41,3±8,9 выход мертвых аскарид 13±7,2 Вышло 17 мертвых аскарид с прозрачной кутикулой, на фоне сохраненных показателей крови появился лейкоцитоз
Российский паразитологический журнал, 2010, № 2
Литература
1. Бурбелло А.Т., Шабров А.В. Современные лекарственные средства: Клинико-фармакологический справочник практического врача. - М.: ОЛМА Медиа Групп, 2007. - С. 627.
2. Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В. и др. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран // Фармация. - 2009, № 4.
- С. 35-38.
3. Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении. - М.: Медицина, 1977. - С. 196-197.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей. - М.: Новая волна, 2008. - 1206 с.
5. Юсупова Л.М., Фаляхов И.Ф., Спатлова Л.В., Гарипова Т.В. Патент (Россия) 2255935. 5,7-Дизамещенный-4,6-динитробензофуроксан общей формулы С6№06^1)2, обладающий акарицидной и бактерицидной активностью. Опубл. 10.07.2005. Бюлл. № 19; Haynes J.W. Bactericides benzofuroxans / Chem. Abstr. - 1977. - № 86. - Р. 151443.
6. Bohn H., Brendel J., Martorana P.A. et al. Cardiovascular actions of the fu-roxan CAS 1609, a novel nitric oxide donor // Brit. J. Pharmacol. - 1995. - V. 114.
- P.1605-1612
7. Koolman J., Rohm K. Taschenatlas der Biochemie. - New York: Georg Thieme Verlag Stuttgard. - 1998. - S. 230.
8. Medana C., Ermondi G., Di StiloA. et al. Furoxanes as Nitric Oxides Donors. 4-phenyl-3-furoxan carbonitrile: thiol-mediated Nithric Oxide release and biological evaluation // J. Med. Chem. - 1994. - V. 37. - P. 4412.
9. Mu Li, Feng S-s., Go M.L. Study of synthesis and cardiovascular activity of some furoxan derivatives as potential NO-donors // Chem. Pharm. Bull. - 2000. -V. 48. - № 6. - P. 808-816.
Synthesis and approbation of new anthelmintics
I.V. Galkina, M.H. Lutfullin, S.N. Egorova, R.F. Mavlihanov, N.A. Lutfullina, A.M. Idrisov, N.V. Vorob'eva, R.I. Hamidullin, L.M. Jusupova, L.V. Spatlova,
V.I. Galkin
The new concept of anthelmint means consisting from quaternary phospho-nium salt with higher alkyl radical as a «membrane anchors» and nitro-substituted benzofuroxan as NO generator, has been suggested and realized in elaboration of preparation degelm. Degelm breaks the energetic exchange in helminths, getting through membranes of cell and mitochondrions, destroying muscular cuticula, that leads to fragmentary destruction of the parasite. Experimental approbation of de-gelm is spent on pigs at helminthosis caused by Ascaris suum, Oesophagostomum dentatum and Trichocephalus suis. Sharp toxicity of degelm is 3500 mg/kg. Degelm has no toxic action, concerns to 4 class of danger and leads to a fragmentation of nematode cuticula at use in low doses.
Keywords: anthelmintic, degelm, quaternary phosphonium salts, dinitrobenzo-furoxan, pigs, synthesis.
