CC BY
28
УДК 577.115.4:535.37 Ю.В. Власенко, ЕЛ. Водовозова
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
СИНТЕЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНОМЕЧЕНОГО ЛИПИДНОГО МОДУЛЯ ДЛЯ НОВОГО ЗОНДА - ЛИПОФИЛЬНОГО ПРОЛЕКАРСТВА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА МЕТОТРЕКСАТА
A BODIPY-labeled analogue of a triglyceride - rac-l-[13 - (Me4-BODIPY-8) trideka-noyl]-2-oleoyl-3-(3-aminopropionyl) glycerol - an intermediate product in the scheme of the synthesis of the new fluorescent-labeled analogue of the lipophilic prodrug Methotrexate for loading into the membrane of liposome carriers and studying of the intracellular traffic in tumor cells was synthesized. (Me4-BODIPY-8 - 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-
yi)
Синтезирован BODIPY-меченый аналог триглицерида - rac-l-[13-(Me4-BODIPY-8)тридеканоил]-2-олеоил-3-(3-аминопропионил)глицерин - промежуточный продукт в схеме получения нового флуоресцентномеченого аналога липофильного пролекарства мето-трексата, предназначенного для встраивания в мембрану липосом-носителей и изучения внутриклеточного трафика в клетках опухолей. (Me4-BODIPY-8 - 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-30,4й-диаза-5-индацен-8-ил)
ВВЕДЕНИЕ
Противоопухолевые препараты, как правило, обладают высокой общей токсичностью, затрагивая деятельность здоровых клеток и органов. Создание липосомальной формы доставки лекарств позволяет уменьшить токсическое действие на организм благодаря уменьшению, концентрации свободного препарата в кровотоке [1]. Кроме того, за счет дефектной архитектуры формирующейся de novo сосудистой системы и повышенной проницаемости ее эндотелия, наноразмерные носители лекарств накапливаются в опухолях и очагах воспаления (эффект enhanced permeability and retention, EPR) [2]. В лаборатории химии липидов ИБХ РАН было предложено встраивать в липидный бислой липосом липидные пролекарства широко применяемых противоопухолевых препаратов [3-5]. Липофилизация цитотоксиче-ских препаратов - в основном гидрофильных веществ, позволяет уменьшить потери лекарства из липосом не только в кровотоке, но и при взаимодействии с клеткой в связи с возможностью прямого трансмембранного переноса. Липофильные свойства молекуле пролекарства придает ковалентно связанный липидный остаток, который при попадании в клетку отщепляется внутриклеточными ферментами, высвобождая активный агент. Известно, что липофильные пролекарства как таковые обладают улучшенной фарма-кокинетикой [6]. При разработке молекулярных структур учитывалось, что пролекарство должно эффективно встраиваться в липидный бислой с минимальным нарушением его упаковки. Молекула метотрексата (MTX), аналога фолиевой кислоты, достаточно крупная. Поэтому при встраивании пролекарства в бислойную мембрану остаток MTX должен локализоваться на ее поверхности и соединяться с надежным липидным якорем короткой поляр-
ной вставкой (спейсером), располагающейся на уровне полярных головок фосфолипидов. В молекуле пролекарства MTX (MTX-DG) в качестве мембранного якоря служит гас-1,2-диолеоилглицерин, а спейсером является N-метиленкарбонил-Р-аланпльный остаток при СЗ глицерина [3]. Механизм проникновения в опухолевые клетки пролекарства MTX в липосомальной форме и его внутриклеточный трафик еще не исследованы. Для изучения этих процессов полезным инструментом может явиться флуоресцентный зонд - аналог MTX-DG. Цель данной работы - синтез BODIPY-меченого аналога триглицерида, который можно будет использовать в качестве син-тона при получении зонда MTX-DG, а также флуоресцентномеченых липо-фильных пролекарств других препаратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Рис. 1. Схема синтеза
В качестве исходного вещества в синтезе был использован незащищенный глицерин в целях сокращения числа стадий. Для получения продукта моноацилирования Р-ВОС-аланином (I) использовали многократный избыток глицерина. Продукт 1,3-диацилирования обнаруживался в реакционной смеси лишь в очень малых количествах. Значительные потери продукта (I) произошли при выделении в ходе экстрагирования избыточного глицерина в водную фазу. Затем моноглицерид (I) вводили в реакцию с 13-(Ме4-
ВСЮ1РУ-8)тридекановой кислотой (II) (получена омылением Ме-эфира). Основные потери на стадиях О-ацилирования в присутствии дициклогек-силкарбодиимида (DCC) и основных катализаторов обусловлены использованием кислот, а не их ангидридов [7] или ацилхлоридов [8]; необратимой перегруппировкой О-ацилизомочевин в N-ацилмочевины и образованием ацилированного по экзоциклическому азоту 4-аминопиридина [9-12]. Снятие Вос-защиты проводили в максимально мягких условиях (0°С, 30 мин), чтобы избежать присоединения трифторуксусной кислоты по двойным связям. Однако смолообразование из-за частичной деградации BODIPY-группы все-таки происходило. Другие методы деблокирования Вос-группы (НС1/диоксан 1 ч при комнатной температуре или 98% НСООН [13]) приводили к полному разрушению флуорофора. Спектр флуоресценции и УФ-спектр продукта (V) был идентичен спектрам BODIPY-кислоты (II). В ЯМР-спектрах диглицерида (III) и последующих продуктов не были обнаружены характеристические пики глицериновых протонов. Однако анализ COSY-NMR показал наличие связей между сигналами 3.9, 1.72 и 1.83 м.д., что может быть следствием образования необычных аддуктов с BODIPY-группой. Для доказательства присутствия в молекуле глицеринового остова было проведено омыление триглицерида (IV) в мягких основных условиях. ТСХ показала наличие среди продуктов гидролиза исходных веществ - мо-ноглицерида (I), кислоты (II).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и реактивы
В работе были использованы глицерин, ß-BOC-аланин, синтезированный ранее в лаборатории химии липидов ИБХ РАН, дициклогексилкар-бодиимид, 4-аминопиридин (Merck, Германия), 4-(N,N-диметиламино)пиридин (DMAP) (Merck), олеиновая кислота (Merck, ФРГ), метиловый эфир 13-(Ме4-ВОБ1РУ-8)тридекановой кислоты, любезно предоставленный к.х.н. Болдыревым И.А. [14], трифторуксусная кислота (Fluka, Швейцария). Сухой хлороформ получали перегонкой над пятиокисью фосфора (Р = 760 мм.рт.ст., tKHn = 61°С). Другие растворители использовались после обычной очистки. Для колоночной хроматографии применяли силика-гель 60 (40-60 мкм и 60-200 мкм, Merck), для гель-фильтрации - сефадекс LH-20 (Pharmacia, Швеция). Для ТСХ использовали пластинки с флуоресцентным индикатором Kieselgel 60 F254 и без индикатора Kieselgel 60 на алюминиевой подложке , а также обращенно-фазные пластинки с индикатором RP-8 F254 на стекле (Merck).
Обнаружение пятен на хроматограммах проводили фосфорномолиб-деновой кислотой (ФМК), нингидрином или просматриванием пластинок в УФ- и видимом свете (BODIPY и его производные имеют интенсивную оранжевую или лимонно-желтую окраску, в зависимости от количества). Спектры !Н-ЯМР снимали на приборе Bruker WM-500 (США), УФ-спектры - на двухлучевом спектрофотометре СФ-256-УВИ (Ломофотоника, С.Петербург), спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония).
гас-1-(3-трет-бутоксикарбоксиамино)пропионил глицерин (I)
Для проведения синтеза глицерин перегоняли под вакуумом масляного насоса (Р = 3,5 мм.рт.ст., tKHn = 147°С). К смеси глицерина 1,45 г (18,8 ммоль), Boc-ß-аланина 0,26 г (1,38 ммоль), 4-диметиламинопиридина (DMAP) 118 мг (0,97 ммоль), растворенных в 15 мл хлороформа, при комнатной температуре добавляли DCC 3,315 ммоль (2,55-молярный раствор в ССЦ, 1,3 мл). В атмосфере аргона перемешивали 24 ч. Экстрагировали на холоду 0,4 н HCl (6 мл), затем водой (6 мл), разделяя фазы центрифугированием (1500 g/Ю мин). Органические экстракты объединяли, упаривали на роторном испарителе. Остаток хроматографировали на колонке с силикаге-лем (35 г, 60-200 мкм) в градиенте изопропилового спирта (2^10%). после объединения фракций и упаривания, выделяли .
Выход продукта 39 мг (165 мкмоль), 15,4%. ТСХ (CHCl3-iPrOH-АсОН. 9:1:0,1), Rf = 0,26. ^-ЯМР-спектр (CDC13), 5, м.д.: 1.44 (9Н, с, С(СНз)з), 2.57 (2Н, т, NH-CH9CH9CO). 3.48 (2Н, уш. м, NH-CH2CH2CO), 3.65 (1Н, м, СН20), 3.72 (1Н, м, СН20), 3.97 (1Н, уш. м, СНО), 4.18 (1Н, дд, СШОН), 4.26 (Щ дд, СН2ОН), 4.97 (1Н, уш. м, NH).
13- (Ме4- В 01)1 Р Y-8) три декан овая кислота (II)
Метиловый эфир 13-(Ме4-ВСЮ1РУ-8)тридекановой кислоты 145 мг (297,7 мкмоль) растворяли в смеси iProH:0,5% КОН водн. 5:2 (75 и 30 мл соответственно) при перемешивании в течение 3,5 ч. Раствор упаривали, остаток растворяли в 10 мл воды, подкисляли 1 н HCl до pH 3-4. Экстрагировали 3 мл CHCI3, отделяли органический слой центрифугированием и упаривали. Получали 97 мг (210,8 мкмоль) (71%) кислоты (II). ТСХ (бензол-этилацетат-АсОН, 80:19:1), Rf = 0,52.
rac-l-[13-(Me4-BODIPY-8)mpudeKaHounJ-3-(3-mpem-6ymoKCUKap6oK-сиамино)пропионил глицерин (III)
В 15 мл CHCI3 растворяли моноглицерид (I) (39 мг, 165 мкмоль), кислоту (II) (97 мг, 210,9 мкмоль). При перемешивании добавляли DMAP 20 мг (165 мкмоль), DCC 150 мг (750 мкмоль) и 4-аминопиридин 15 мг (150 мкмоль). Реакция велась 17 ч при комнатной температуре. Фильтровали через вату, затем проводили гель-фильтрацию (CH3OH-CHCI3 1:1) для отделения от основной массы катализаторов и побочных продуктов. Остаток хроматографировали на силикагеле (4,5 г, 40-60 мкм) в градиенте этилацетата (хлф-ЭА-у.к 9,7:0,2:0,1 ^ хлф-ЭА-у.к 9,5:0,4:0,1) получали 33,3 мг продукта (28,6%). ТСХ (ПЭ-ЭФ-у.к. 70:30:1), Rf = 0,18. ^-ЯМР-спектр (CDCI3), 5, м.д.: 1.28, м, (23Н, С(СН3)3, (СН2)9), 1.49, т, (2Н, ССН2СН2СН2), 1.64, м, (4Н, СОСН2СН2, ССН2СН2), 1.72, м, (2Н, СН20С(0)), 1.83, м, (2Н, СН20С(0)), 1.96, с, (4Н, CH2CH2-NH), 2.42, с, (8Н, 2*С(СН3), СОСН2), 2.52, с, (6Н, 2*С(СН3)), 2.95, т, (2Н, ССН2), 3.9, с, (1Н, СНОН), 6.06, с, (2Н, аром. CHC(CH3)N)
гас-1-[13-(Ме4-ВОШРТ-8)тридеканоил]-2-олеил-3-(3-трет-буток-сикарбоксиалшно)пропионил глицерин (IV)
В 2 мл CHCI3 растворили (III) 33,3 мг (47 мкмоль), добавили олеиновую кислоту 41 мг (145 мкмоль), DMAP 12 мг (95 мкмоль), DCC 120 мкл 2,55н раствора в ССЦ, 4-аминопиридин 10 мг (95 мкмоль). Реакцию вели около 2 сут при комнатной температуре. Продукт очищали гель-
фильтрацией (CH3OH-CHCI3 1:1), затем хроматографией на силикагеле (3,5 г, 40-60мкм). Выход 30,3 мг (66%). ТСХ (RP-8) (СН30Н-СНС13-Н20 9:0,5:0,5), Rf = 0,19. ^-ЯМР-спектр (CDCI3), 5, м.д.: 0.89, м, (ЗН, СН3), 1.28, м, (43Н, С(СНз)з, (СН2)9, (СН2)6, (СН2)4), 1.49, т, (2Н, ССН2СН2), 1.64, м, (8Н, 2*СОСН2СН2, 2* ССН2СН2СН2), 1.83, м, (2Н, СН20С(0)), 1.72, м, (2Н, СН20С(0)), 1.96, с, (4Н, CH2CH2-NH), 2.01, м, (4Н СН2СНСНСН2), 2.42, с, (ЮН, 2*С(СН3), 2* СОСН2), 2.52, с, (6Н, 2*С(СН3)), 2.95, т, (2Н, ССН2), 3.9, с, (1Н, СНОН), 5.35, м, (2Н, СН=СН), 6.06, с, (2Н, аром. CHC(CH3)N)
гас-1-[13-(Ме4-ВОВ1Р¥-8)тридеканоил]-2-олеил-3-(3-аминопропио-нид)глицерин (V)
К 30 мг (30,1 мкмоль) соединения (IV) в 100 мкл CHCI3 при постоянном помешивании при 0°С прилили 1 мл TFA, выдерживали смесь 30 мин, затем дважды упаривали с добавлением толуола. Выход 6 мг (22%). ТСХ (CHCI3-CH3OH- Н20-Ас0Н, 92:4:0,5:1), Rf = 0,76. ^-ЯМР-спектр (CDCI3), 5, м.д.: 0.89, м, (ЗН, СН3), 1.28, м, (34Н, (СН2)7, (СН2)6, (СН2)4), 1.49, т, (2Н, ССН2СН2), 1.64, м, (8Н, 2*СОСН2СН2, 2* ССН2СН2СН2), 1.83, м, (2Н, СН20С(0)), 1.72, м, (2Н, СН20С(0)), 1.96, с, (4Н, CH2CH2-NH), 2.01, м, (4Н СШСНСНСШ), 2.42, с, (ЮН, 2*С(СН3), 2* СОСН2), 2.52, с, (6Н, 2*С(СН3)), 2.95, т, (2Н, ССН2), 3.9, с, (1Н, СНОН), 5.35, м, (2Н, СН=СН), 6.06, с, (2Н, аром. CHC(CH3)N), 8.67, с, (2Н, NH2).
Библиографические ссылки
1. basic D.D., Papahadjopoulos D. // Science, 1995. V.267. № 5202. P. 12751276.
2. Yuan F., Dellian M., Fukumura D.F. [et al.]; // Cancer Res., 1995. № 55. P. 3752-3756.
3. E.JI. Водовозова, П.Ю. Никольский, И.И. Михалев, Юл.Г Молотков-ский. //Биоорган. Химия, 1996. Т. 22. № 7. С. 548-556.
4. E.JI. Водовозова, Г.П. Гаенко, Е.С. Бобрикова, Г.В. Пазынина, Юл.Г. Молот-ковский//Химико-фармацевтический журнал, 2007. Т. 41, №6. С. 10-14
5. E.JI. Водовозова, Н.Р. Кузнецова, В.А. Кадыков, С.С. Хуцян, Г.П. Гаенко, Юл.Г. Молотковский//Российские Нанотехнологии, 2008. Т. 3. № 3-4. С. 162-172
6. Wong A., Toth I. // Curr. Med. Chem., 2001. V. 8. № 9. P. 1123-1136.
7. Robles C.E., Van Den Berg D. // Biochim. Biophys. Acta, 1969, V. 187, P. 520-526.
8. Baer E., Buchnea D. // Can. J. Biochem. Physiol., 1959, V. 37. P. 953959.
9. Mattson F.H., Volpenheim R.A. // J. Lipid Res., 1962. V. 3, P. 281-296.
10. Selinger Z., Lapidot V. // J. Lipid Res., 1966. V. 7, P. 174-175.
11. Joule J.A., Smith G.F. in: Heterocyclic Chemistry, Chapter 3. Van Nostrand Reihold Co. London, 1972.
12. Steglich W., Hoefle G. // Angew. Chem., Int. Ed. Eng., 1969, V. 8, P. 981.
13. Lajoiea G., Kraus J.L. //Tetrahedron Lett., 1967. V. 5, P. 3031-3033
14. Болдырев И. А., Молотковский Юл.Г. // Биоорганическая химия, 2006. Т. 32. №1. С. 87-92.
