Синтетическая питательная среда King BS для определения синтеза флюоресцеина бактериями рода Pseudomonas Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© Е. П. СИвОЛОДСКИй, 2012 удК 579.841.11.083.135

Е. П. Сиволодский

синтетическая питательная среда №N6 вs для определения синтеза ФлюоресцеинА бактериями РОДА PSEUDOMONAS

ФГБОУ вПО военно-медицинская академия им. С. М. Кирова Минобороны РФ, Санкт-Петербург

На основе замены протеозопептонаL-глутамином или L-глутаминовой кислотой разработана синтетическая питательная среда King BS для выявления синтеза флюоресцеина бактериями рода Pseudomonas. Среда имеет равную со средой King B диагностическую чувствительность и специфичность, но превосходит ее по стандартности состава, не требует стерилизации в паровом стерилизаторе, выявляет флюоресцеин у штаммов, продуцирующих другие пигменты. Среда пригодна для стандартизации метода определения синтеза флюоресцеина псевдомонадами.

Ключевые слова: среда King B, синтетическая питательная среда, синтез флюоресцеина, Pseudomonas, стандартизация

Ye.P. Syvolodsky

THE SYNTHETIC GROWTH MEDIUM KINGS BS FOR DETECTION OF SYNTHESIS OF FLUORESCEIN

BY BACTERIA PSEUDOMONAS

The synthetic growth medium KINGS BS was developed on the basis ofsubstitution ofproteose-peptone by L-glutamine or L-glutamine acid. The medium is used to detect the synthesis of fluorescein by bacteria Pseudomonas. The actual medium has equal diagnostic sensitivity and specificity as compared with medium King B. At the same time, the medium excels King B by content regularity and has no need of sterilization in vapor sterilizer and detects fluorescein in strains producing other pigments. The medium is suitable for standardization of technique of detection of synthesis offluorescein by pseudomonads.

Key words: King B medium, synthetic growth medium, synthesis offluorescein, Pseudomonas, standardization

Выявление продукции флюоресцеина (пиовердина) имеет существенное значение для идентификации бактерий рода Pseudomonas. Эталонной питательной средой для определения флюоресцеина является среда King В, содержащая, по авторской прописи [3] (в г/л): протеозопептон № 3 (Difco) - 20, К2НР04 - 1,5, MgS04 • 7Н20 - 1,5, глицерол - 10 мл, агар - 15, воду дистиллированную - 1 л. Среду стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Посевы бактерий инкубируют при 25°С в течение 3 сут. Среду King В производят по авторской прописи фирмы bioMerieux (Франция ) и Sanofi Diagnostic Pasteur (Франция). Известны также различные модификации среды King В, которые отличаются в основном источниками азота и углерода. Так, фирма Difco (США) производит вариант среды King В под названием «Pseudomonas agar F, содержащий бактотриптон (10 г/л)» и «бактопротеозопептон № 3 (10 г/л)». Рекомендуют использовать в составе среды King В панкреатический гидролизат кильки (10 г/л) и панкреатический гидро-лизат животных тканей USP (10 г/л) [2] или пептон [7].

Недостатком указанных питательных сред является отсутствие их стандартности по составу в связи с неопределенным составом пептонов и гидролизатов, используемых в качестве источников азота, углерода и субстрата для образования флюоресцеина, что определяет paзную диагностическую чувствительность выявления флюоресцеина псевдомонад.

Целью настоящего исследования являются разработка синтетической питательной среды для выявления синтеза флюоресцеина псевдомонадами, обеспечивающей стандартность ее состава и методики лабораторного анализа, а также упрощение исследования путем исключения стерилизации среды в паровом стерилизаторе.

Для корреспонденции:

Сиволодский Евгений Петрович, д-р мед. наук, проф. каф. микробиологии

Адрес: 194044, Санкт-Петербург, ул. акад. Лебедева, 6 Телефон: 8(812)292-34-29 E-mail:[email protected]

Материалы и методы. Объектами исследования были 156 штаммов псевдомонад, в том числе типовые штаммы 10 видов. Типовые штаммы P. putida biovar A CIP 52191 (ATCC 12633), P alcaligenes CIP 101034 T (ATCC 1409), P. luteola CIP 102995 T (JCM 3352), P oryzihabitans CIP 102996 T (JCM 2952) получены из коллекции бактерий Института Пастера (Париж); типовые штаммы P. fluorescens ИМВ 4125 (АТСС 13525), P. chlororaphis subsp. chlororaphis ИМВ 4139 (АТСС 944б), P. mendocina ИМВ 4172 (АТСС 25411), P. stutzeri ИМВ 4136 (АТСС 17588), P. pseudoalcaligenes ИМВ 4134 (АТСС 17440) - из коллекции культур Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины (Киев), типовой штамм P. aeruginosa ГИСК 190154 (АТСС 10145) - из коллекции бактерий ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Изучали 140 штаммов флюоресцирующих видов псевдомонад (P aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, P. chlororaphis, Pseudomonas spp.), из них 4 типовых штамма, 90 штаммов, выделенных из клинического материала, и 46 штаммов, выделенных из воды Невы. Контролем являлись 16 штаммов нефлюоресцирующих видов псевдомонад (P. stutzeri, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. mendocina, P. luteola, P. oryzihabitans), из них 6 типовых штаммов и по 5 штаммов, выделенных из клинического материала и воды Невы. Штаммы псевдомонад из клинического материала были изолированы в бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии. Штаммы псевдомонад идентифицировали по методикам и критериям, изложенным в литературе [2-4, 7, 8]. Все указанные штаммы псевдомонад находятся в рабочей коллекции культур автора на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург). Для выращивания исследуемых бактерий использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) производства НПЦ генно-инженерных препаратов (Оболенск). Для выявления синтеза пиоцианина, пиорубина, пиомеланина бактериями P. aeruginosa применяли питательную среду King A (bioMerieux, Франция). Продукцию флюоресцеина (пиовердина) псевдомонадами изучали на питательной среде King B (bioMerieux, Франция). Исследуемые культуры псевдомонад, выращенные в течение 24 ч на среде ГРМ-агар, засевали по

МИКРОБИОЛОГИЯ

одной полной петле (диаметром 2 мм) на сектор (1/6 часть чашки Петри) сред King A и King B, инкубировали при 28°C в течение 24-48 ч. Продукцию пиоцианина, пиорубина, пиоме-ланина определяли визуально по характерной окраске газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды; продукцию флюоресцеина выявляли при облучении ультрафиолетовым светом по желто-зеленой флюоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды.

Методика приготовления использования синтетической питательной среды King BS для определения синтеза флюоресцеина бактериями рода Pseudomonas. Указанная питательная среда разработана нами [5]. Состав питательной среды King BS (в г/л): L-глутамин 2-5 или L-тутаминовая кислота (L-глутамат натрия) - 4-6, NaCl - 5, Na2S04 - 2, KH2P04 - 0,5, K2HP04 - 2, MgS04 • 7H20 - 1,5, агар - 15, глицерол - 10 мл, вода дистиллированная - 1 л; pH 7,0-0,2. Приготовление среды: все ингредиенты (кроме глицерола) вносят в 1 л дистиллированной воды, растворяют при нагревании, добавляют глицерол, кипятят в течение 5 мин и без последующей стерилизации в паровом стерилизаторе разливают в стерильные чашки Петри. Среда прозрачная, пригодна к использованию в течение 14 сут при хранении при температуре от 4° до 8°С. Использование среды: суточную агаровую культуру бактерий рода Pseudomonas засевают полной петлей (диаметром 2 мм) на сектор питательной среды (1/6 часть чашки Петри), инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°C, после чего облучают газон бактерий ультрафиолетовым светом и учитывают результат: наличие желто-зеленой флюоресценции газона бактерий и окружающей его зоны питательной среды указывает на образование флюоресцеина и принадлежность исследуемых бактерий к группе флюоресцирующих псевдомонад. Контроль: наличие обильного роста и продукции флюоресцеина у контрольного штамма P. aeruginosa АТСС 10145, используемого по такой же методике. Диагностическую чувствительность (ДЧ) и диагностическую специфичность (ДС) среды King BS определяли в сравнении с эталонной средой King B (bioMerieux) по методике на основе теоремы Байеса [1]. Истинно положительным (ИП) результатом считали совпадение выявления флюоресцеина на средах King BS и King B в группе штаммов флюоресцирующих видов псевдомонад: лож-ноотрицательным (ЛО) результатом считали отсутствие флюо-ресцеина на среде King BS при наличии флюоресцеина на среде King B в группе штаммов флюоресцирующих видов псевдомонад, истинно отрицательным (ИО) результатом - совпадение отрицательных результатов выявления флюоресцеина на обеих средах в группе штаммов нефлюоресцирующих видов псевдомонад, ложноположительным (ЛП) результатом - выявление флюоресцеина на среде King BS при отсутствии флюоресцеина на среде King B в группе штаммов нефлюоресцирующих видов псевдомонад. Расчет производили по формулам: ДЧ = ИП/ИП + ЛО • 100% и ДС = ИО/ИО + ЛП • 100%.

Результаты и обсуждение. Основным отличием синтетической среды King BS от среды King B является замена про-теозопептона № 3 одной из аминокислот: L-глутамином или L-глутаминовой кислотой (L-глутаматом натрия) в качестве единственного источника азота, углерода и субстрата для синтеза флюоресцеина. Ранее нашими исследованиями по изучению профилей утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода бактерий рода Pseudomonas было установлено, что универсальным субстратом для роста всех штаммов флюоресцирующих видов псевдомонад является 6 аминокислот: L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-аланин, L-пролин [6]. Исследование этих аминокислот в качестве единственного субстрата для образования флюоресцеина, источника азота и углерода в составе среды King B (без глицеро-ла) показало, что только L-глутамин и L-глутаминовая кислота (L-глутамат натрия) обеспечивают эффективную продукцию флюоресцеина всеми штаммами флюоресцирующих видов псевдомонад. Остальные 4 аминокислоты являлись источником флюоресцеина только для единичных штаммов псевдомо-

над, и продукция флюоресцеина была слабой. Среда King BS отличается от среды King B также наличием дополнительных солей: NaCl, Na2S04, КН2Р04. Эти компоненты необходимы для обеспечения утилизации псевдомонадами аминокислот в составе синтетической среды. Присутствие двузамещенного фосфата калия и однозамещенного фосфата калия в используемом соотношении обеспечивает оптимальное значение pH среды без дополнительной корректировки. Наличие MgS04 • 7Н20 в указанной концентрации стимулирует продукцию флюоресцеина. Содержащийся в среде глицерол не является субстратом для синтеза флюоресцеина и, по нашим данным, не стимулирует продукцию флюоресцеина псевдомонадами. Он также не обязателен как источник углерода для псевдомонад. При его отсутствии в средах King BS и King B продукция флюоресцеина псевдомонадами имеет такую же частоту и интенсивность, как при его наличии. Вместе с тем использовать его в составе сред King BS и King B целесообразно, так как он предохраняет среду от выпадения кристаллов солей (протектор кристаллизации), особенно при хранении чашек со средой в холодильнике. Синтетическая среда King BS позволяет упростить ее приготовление за счет исключения стерилизации в паровом стерилизаторе при 121°C. Для изготовления питательной среды достаточно кипячения в течение 5 мин, что уничтожает все вегетативные формы бактерий. Возможно сохранение спор ана- и аэробных спорообразующих бактерий, однако споры анаэробов не прорастают ввиду проведения исследования в аэробных условиях, споры аэробов рода Bacillus не прорастают, так как эти бактерии - ауксотрофы и не могут расти на минимальной синтетической среде. Опыт использования среды King BS, обработанной только кипячением в течение 5 мин, показал отсутствие прорастания среды посторонней микрофлорой во всех случаях инкубации посевов псевдо-

Таблица 1

выявление флюоресцеина псевдомонад на среде King B (bioMerieux) и синтетической питательной среде King BS при 28°C в течение 24 ч

Группа и виды псевдо- Число Число штаммов, синтезирующих флюоресцеин

монад мов среда King B (P ± m%) среда King BS (P ± m%)

Флюоресцирующие виды псевдомонад:

Р. aeruginosa* 80 73 73

Р. putida biovar A* 22 21 21

Р. putida biovar B* 2 2 2

Р. fluorescens* 10 10 10

Р. chlororaphis* 6 6 6

Pseudomonas spp. 20 20 20

Всего ... 140 132 (94,3 ± 1,7) 132 (94,3 ± 1,7)

Нефлюоресцирующие виды псевдомонад:

Р. stutzeri* 4 0 0

Р. alcaligenes* 4 0 0

Р. pseudoalcaligenes* 4 0 0

Р. mendocina* 1 0 0

Р. luteola* 2 0 0

Р. oryzihabitans* 1 0 0

Всего... 16 0 0

Примечание. * - в том числе типовой штамм; 0 - отрицательный результат.

Таблица 2

выявление флюоресцеина, пиорубина и пиомеланина на питательных средах King A, King B и синтетической питательной среде King BS при 28°С в течение 24 ч

Группа штаммов Число Продуцируют на среде King B Продуцируют на среде King BS

P. aeruginosa мов пио- пиоме- флюо- пио- пиоме- флюо-

рубин ланин ресцеин рубин ланин ресцеин

Продуцирующие пиорубин на среде King A 10 4 - 10 0 - 10

Продуцирующие 3 - 3 0 - 0 0

пиомеланин на среде

King A

Примечание. 0 - отрицательный результат.

монад в течение 48 ч при 28°С (156 чашек Петри) и инкубации незасеянной среды в чашках Петри при 28 и 37°С в течение 7 сут (40 чашек). Кроме того, стерилизовать среду King BS в паровом стерилизаторе нецелесообразно, так как снижается интенсивность флюоресценции.

Диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность синтетической питательной среды King BS изучали в отношении к эталонной среде King B (bioMerieux) по методике, изложенной в разделе «Материалы и методы». Как показали результаты исследований, питательная среда King BS имеет ДЧ 100% и ДС 100% (табл. 1).

Результаты выявления синтеза флюоресцеина на среде King BS у 140 штаммов флюоресцирующих видов псевдомонад были полностью воспроизводимы при повторном исследовании. Для изучения возможности выявления синтеза флюоресцеина у штаммов P. aeruginosa, продуцирующих другие пигменты, исследовали на средах King BS и King B штаммы синегнойной палочки, продуцирующие на среде King A пиорубин (10 штаммов) и пиомеланин (3 штамма). Установлено, что все штаммы синегнойной палочки, образующие пиорубин, на среде King BS продуцируют только флю-оресцеин, на среде King B - флюоресцеин и дополнительно (4 штамма) - пиорубин слабой интенсивности (табл. 2).

Все штаммы синегнойной палочки, образующие пиомела-нин на среде King A, продуцируют пиомеланин слабой интенсивности на среде King B и не синтезируют пиомеланин на среде King BS (см. табл. 2). Вероятно, пиорубин и пиомеланин

не продуцируются синегноиными палочками на синтетической среде King BS ввиду отсутствия субстрата для синтеза этих пигментов.

Заключение. Таким образом, разработанная нами синтетическая питательная среда King BS для выявления синтеза флюо-ресцеина псевдомонадами обладает высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, равной таковой среды King B, но превосходит ее по стандартности состава, упрощению изготовления без стерилизации в паровом стерилизаторе, возможности четкого выявления флюоресцеина у штаммов псевдомонад, продуцирующих другие пигменты. Среда King BS пригодна для стандартизации и применения в стандартизированной методике выявления синтеза флюоресцеи-на у псевдомонад. На указанную среду получен патент РФ на изобретение [5], питательная среда производится отделом новых технологий Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Меньшиков В. В. // Клин. лаб. диагн. - 1996. - № 5. - С. 4-12.

2. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. М. Герхардта: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - Т. 3.

3. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных) / Вейгант Р., Мосс У, Уивер Р. и др.: Пер. с англ. - М.: Мир, 1999.

4. Сиволодский Е. П. // Журн. микробиол. - 1992. - № 9-10. - С. 10-12.

5. СиволодскийЕ. П. Патент РФ № 2366714. Способ определения синтеза флюоресцеина бактериями рода Pseudomonas. Бюлл. изобретений № 25. - 2009.

6. Сиволодский Е. П. // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 766-772.

7. Смирнов В. В., Киприанова Е. А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наукова думка, 1990.

8. Palleroni N. J. // Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds G. M. Garriti et al. - 2-nd Ed. - New York: Springer, 2005. - Vol. 2, Pt B. - P. 324-379.

Поступила 22.09.11

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012

УДК 579.871.1:579.252.55].083.1(470.61)

Г. Г. Харсеева, Н. А. Боронина, А. Ю. Миронов, А. Р. Харисова

АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ CORYNEBACTERIUM NON DIPHTHERIAE, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В РОСТОВЕ-НА-ДОНУ И РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону; Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова

Целью работы явилось изучение чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов Corynebacterium non diphthe-riae, циркулировавших в Ростове-на-Дону и Ростовской области. Исследованы штаммы Corynebacterium non diphtheriae, выделенные из урогенитального тракта: C. xerosis, C. pseudotuberculosis, C. amycolatum, C. striatum. У 41 штамма C. non diphtheriae методом серийных разведений в жидкой питательной среде проводили определение чувствительности к 9 антибактериальным препаратам. Диапазон колебаний минимальной подавляющей концентрации (МПК) препаратов в отношении Corynebacterium non diphtheriae составлял 0,003-20,0 мкг/мл. Полученные результаты показали, что Corynebacterium non diphtheriae высокочувствительны к гентамицину, ванкомицину и цефотаксиму, чувствительны к рифампицину и устойчивы к линкомицину. Для всех исследованных штаммов Corynebacterium non diphtheriae наибольшие показатели МПК выявили у линкомицина, причем для C. striatum он был максимальным - 11,52 ± 2,26 мкг/мл.

Ключевые слова: Corynebacterium non diphtheriae, чувствительность к антибактериальным препаратам, минимальная подавляющая концентрация