CC BY
79
https://doi.org/10.17116/molgen20213901118
Синтетическая биология. Современное состояние и применение
© Р.А. ВАСИЛЬЕВ1- 3, В.Ю. ЧЕРНИКОВИЧ2, М.А. ЕВТЕЕВА3, Д.А. САХАРОВ2, М.В. ПАТРУШЕВ2- 3
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; 2Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
РЕЗЮМЕ
Данный обзор посвящен синтетической биологии — области, в которой применяются методы и техники молекулярной биологии для формирования заданного поведения клеток на основе теоретически сконструированных регуляторных сетей с применением инженерных подходов. Клетку можно рассматривать как устройство, выполняющее несколько типов основных функций: сенсорную, обработку поступившей информации, формирование ответа. Входящими сигналами являются эндогенные и экзогенные физические или химические факторы, воздействие которых приводит к запуску каскадов обработки информации. К таковым можно отнести сигнальные и метаболические пути, изменения в которых, как правило, приводят к модификации транскрипционного профиля. Ответ заключается в перемене метаболического профиля с последующими физиологическими изменениями. Учитывая это, можно проводить прямую аналогию между клеткой и компьютером, что в свою очередь дает все основания применить принципы инженерии к естественным биологическим системам в целом и к генетическим сетям в частности. Помимо основных направлений синтетической биологии, их принципов и методов рассмотрены конкретные примеры применения синтетико-биологического подхода в медицине и других областях.
Ключевые слова: синтетическая биология (synthetic biology), искусственные генетические сети (artificial gene circuits), логические вентили (logic gates), ортогональность (orthogonality), регуляция экспрессии (expression regulation).
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Васильев Р.А. — https://orcid.org/0000-0002-6839-905X; e-mail: ruavasilev@gmail.com Черникович В.Ю. — e-mail: victoria.artistcat@gmail.com Евтеева М.А. — e-mail: evteeva_ma@rrcki.ru
Сахаров Д.А. — https://orcid.org/0000-0001-9333-586X; e-mail: sakharov@muctr.ru Патрушев М.В. — https://orcid.org/0000-0002-4748-9283; e-mail: maxpatrushev@yandex.ru Автор, ответственный за переписку: Патрушев М.В. — e-mail: maxpatrushev@yandex.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Васильев Р.А., Черникович В.Ю., Евтеева М.А., Сахаров Д.А., Патрушев М.В. Синтетическая биология. Современное состояние и применение. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021;39(1):18—30. https://doi.org/10.17116/molgen20213901118
Synthetic biology. Current state and applications
© R.A. VASILEV1' 3, V.Yu. CHERNIKOVICH2, M.A. EVTEEVA3, D.A. SAKHAROV2, M.V. PATRUSHEV2- 3
'Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1, Moscow, Russia; 2Dmitry Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia; 3National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
ABSTRACT
This review is devoted to synthetic biology, a field where the methods and techniques of molecular biology are applied to form a determined cell behavior based on theoretically constructed regulatory networks using engineering approaches. One can imagine a cell as a device that performs several types of basic functions: sensory, processing of incoming information, formation of a response. The input signals present as endogenous and exogenous, physical and chemical factors, the impact of which leads to the launch of information processing cascades. These include signaling and metabolic pathways, changes in which, as a rule, lead to a modification of the transcriptional profile. The answer lies in a change in metabolic profile followed by physiological changes. Taking this into account, it is possible to draw a direct analogy between a cell and a computer, which in turn gives every reason to apply the principles of engineering to natural biological systems in general and to genetic networks in particular. In addition to the main directions of synthetic biology, their principles and methods, specific examples of the application of the synthetic-biological approach in medicine and other fields are considered.
Keywords: synthetic biology, artificial gene circuits, logic gates, orthogonality, expression regulation. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Vasilev R.A. — https://orcid.org/0000-0002-6839-905X; e-mail: ruavasilev@gmail.com Chernikovich V.Yu. — e-mail: victoria.artistcat@gmail.com Evteeva M.A. — e-mail: evteeva_ma@rrcki.ru
Sakharov D.A. — https://orcid.org/0000-0001-9333-586X; e-mail: sakharov@muctr.ru Patrushev M.V. — https://orcid.org/0000-0002-4748-9283; e-mail: maxpatrushev@yandex.ru Corresponding author: Patrushev M.V. — e-mail: maxpatrushev@yandex.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Vasilev RA, Chemikovich VYu, Evteeva MA, Sakharov DA, Patrushev MV. Synthetic biology. Current state and applications. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2021;39(1):18—30. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20213901118
История синтетической биологии
Управление функциями клеток, их развитием и поведением представляло интерес с ранних этапов развития биологии как отдельного направления науки. На протяжении всего XX века попытки направленного изменения фенотипа ограничивались аппликацией какого-либо внешнего фактора, в результате чего клетки либо кратковременно, либо неконтролируемо меняли свой фенотип. Ситуация начала меняться с появлением синтетической биологии (СБ). Как и многие другие направления, СБ развивалась нелинейно, временами представляя собой мировой тренд развития биотехнологий, временами переходя в стадию застоя. Также не сразу возникло и определение СБ. Сегодня принято считать, что СБ — это область, в которой применяются методы и техники молекулярной биологии для формирования заданного поведения клеток на основе теоретически сконструированных регуляторных сетей с применением инженерных подходов (следует отметить, что это не единственное определение, однако, с точки зрения авторов, наиболее емко отражающее происходящее в данном направлении). Под «инженерными подходами» понимается конструирование сложных генетических сетей из простых функциональных элементов (блоков), взаимодействующих друг с другом в зависимости от внешних условий. Именно инженеризация, представленная на начальных этапах дизайном и конструированием таких элементарных блоков, а на более поздних — построением из них комплексных генетических сетей с обратной связью, отличает СБ от других способов получения организмов с заданными свойствами. Например, в отличие от классического использования молекулярных биосенсоров для измерения физического, механического или химического стресса в биореакторах синтетико-биологический подход предполагает конструирование регуляторных сетей на основе этих биосенсоров, интегрирующих ответы сразу от нескольких сигналов, причем с возможностью варьировать минимальный порог обнаружения целевой молекулы и без взаимодействия компонентов сети с нормальной внутри- и межклеточной средой и другими сетями.
Истоком СБ можно считать работу Ф. Жакоба и Ж. Моно 1961 г., в которой впервые было продемонстрировано наличие генной сети в клетках бактерий, состоящей из нескольких функциональных блоков, способной отвечать на определенные факторы внешней следы [1].
В период с 1961 по 2000 г. происходило накопление знаний в области структурной и функциональной молекулярной биологии, появлялись новые технологии и методы. Особым этапом в аспекте развития СБ можно считать разработку технологий рекомбинант-ных ДНК и следующее за ней бурное развитие методов генной инженерии, положивших основу технологиям практической реализации инженерных принципов в синтетической биологии [2].
О первой синтетической регуляторной сети было сообщено в 2000 г. Работа представляла результаты искусственной генетической сети (ИГС), в которой несколько генов репрессировали друг друга [3]. Это была первая бистабильная, зависимая от ампли-фицируемого внешнего фактора, ИГС.
В это же время М. Эловитц и С. Лейблер представили результаты работы по созданию осциллирующей искусственной цепи на основе репрессии, которую авторы назвали репрессилятором [4].
Важными вехами в развитии СБ стали работы, в которых продемонстрирована межклеточная ИГС, блоки которой находятся в различных клетках, образуя при этом единый функционал за счет обмена продуктами экспрессии этих блоков [5]. Межклеточные сети у бактерий в дальнейшим стали более тонко настраивать за счет использования «чувства кворума», что позволило создавать еще более сложные ИГС [6]. Работы по управлению поведением клеток млекопитающих начали появляться лишь в середине 2000-х годов, в то время как дрожжи применялись для этих целей с начала нулевых, хоть и значительно уступали бактериям по количеству сконструированных для них сетей.
Инженеризация биологических сетей
Схемотехника в синтетической биологии
Клетку можно рассматривать как устройство, выполняющее несколько типов основных функций: сенсорную (восприятие входящих сигналов), обработку поступившей информации, формирование ответа. Входящими сигналами являются эндогенные и экзогенные физические или химические факторы, воздействие которых приводит к запуску каскадов обработки информации. К таковым можно отнести сигнальные и метаболические пути, изменения в которых, как правило, приводят к модификации транскрипционного профиля. Ответ заключается в перемене метаболического профиля с последующими физиологическими изменениями. Учитывая это, можно проводить прямую аналогию между клеткой
Рис. 1. Комплексный логический вентиль «ANDN» на примере лактозного оперона.
Транскрипция бета-галактозидазы происходит только в условиях наличия лактозы и одновременного отсутствия глюкозы.
и компьютером, что в свою очередь дает все основания применить принципы инженерии к естественным биологическим системам в целом и к генетическим сетям в частности.
В 1995 г. Х. МакАдамс и Л. Шапиро впервые приводят аналогию между электрическими и генетическими сетями, вводят термин «вентиль» и фактически внедряют понятие схемотехники в генетику [7]. Это позволило систематизировать и схематизировать внутриклеточные процессы, что в свою очередь привело к более техническому пониманию происходящих процессов, а также упростило процедуры дизайна ИГС и дало возможность формировать различные сложные генетические функции. Например, подход с использованием электро-схемотехнической классификации позволяет упорядочить типы используемых схем взаимодействий для применения в синтетической биологии.
В цифровых сетях уровни сигналов, которые ниже или выше фонового значения, рассматриваются как «0» или «1» соответственно. Основным понятием в них является «логический вентиль», который представляет собой абстрактное в общем понимании устройство, реагирующее определенным образом в зависимости от суммы условий. Под «суммой условий», если рассматривать клетку, понимаются структурные (качественные) или количественные характеристики определенных молекул А и В внутри клетки или во внешней среде (обозначаются «входы» А и В), являющиеся необходимыми для качественных или количественных изменений молекулы У (обозначается «выход» У). Существуют 3 основных логических вен-
тиля - NOT (НЕ), OR (ИЛИ), AND (И) - и несколько их комбинаций. Принципиальным является наличие не менее, чем двух условий для получения ответа (за исключением вентиля NOT). Пример открытого Ф. Жакобом и Ж. Моно лактозного оперона с точки зрения электросхемотехники представляет собой вентиль ANDN (комбинация AND и NOT): для экспрессии бета-галактозидазы обязательно должны быть соблюдены условия одновременного наличия лактозы и отсутствия глюкозы (рис. 1) [1].
Логический вентиль XOR часто представлен более сложными взаимодействиями. Выходной сигнал этого вентиля наблюдается только в случае присутствия одного из субстратов. На рис. 2 представлен пример искусственной сети, в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка — GFP — происходит в присутствии либо изопропил^^-1-тиога-лактопиранозида — IPTG («вход А»), либо ангидро-тетрациклина — aTc («вход B») [8, 9].
Логический вентиль NOR описывает ситуацию, при которой сигнал на выходе наблюдается, только если на входе отсутствуют определенные стимулы. В качестве примера можно рассмотреть сеть, в которой вентиль NOR создавался присоединением дополнительного индуцируемого промотора к гену, кодирующему репрессор эффекторного гена. При активации любого из промоторов данного гена или обоих промоторов сразу индуцировалась экспрессия ре-прессора, который связывался с промотором эффекторного гена, ингибируя его экспрессию [10].
Остальные логические вентили также находят свое применение в СБ, а их различные комбина-
Рис. 2. Схема перекрестной индукции/репрессии.
Сверху вниз: гены репрессоров Ьас1, Те1Я на матрице ДНК; мРНК репрессоров. Острые стрелки отражают индукцию, Т-образные пунктирные стрелки отражают репрессию. Экспрессия двух белков Ьас1 и Те1Я происходит конститутивно с одного промотора. В системе присутствуют два гена, кодирующих GFP, под контролем разных промоторов. Ьас1 и Те1Я являются индукторами для одного из промоторов, но репрессорами для другого. Т.е. когда оба белка находятся в активном состоянии, они ингибируют соответствующие промоторы. При добавлении IPTG он связывается с Ьас1, что приводит к снятию репрессии с промотора, активируемого Те1Я. При добавлении аТс он связывается с Те1Я, что приводит к снятию репрессии с промотора, активируемого Ьас1. Если же в среде присутствуют и IPTG, и аТс, то репрессия снимается с обоих промоторов. Но экспрессии GFP при этом не происходит, так как отсутствует индукция.
ции расширяют сферы применения ИГС, опосредуя все большую инженеризацию биологической науки [11].
Многослойные и аналоговые ИГС
Выше были приведены примеры простых ИГС, однако для реализации систем более тонкой регуляции приходится конструировать более сложные.
Как правило, в таких сетях выходы одних вентилей являются входами для других. Такие ИГС принято называть многослойными. Как и простые ИГС, многослойные также направлены на единый результат, выражающийся в активации или репрессии экспрессии какого-либо гена либо же регуляции работы конкретного фермента.
Усложнение многослойных ИГС происходит через увеличение количества входов (больше,
чем 2 на первый слой) и выходов (больше, чем 1 у первого или последнего слоя ИГС). Конструирование подобных ИГС долгое время оставалось затруднительным из-за большого количества перекрестных взаимодействий компонентов при одновременной их аппликации. В 2017 г. был предложен принцип конструирования монослойных ИГС в клетках млекопитающих, в основе которого лежат механизмы сайт-специфической рекомбинации. При этом ти-розиновые рекомбиназы использовали для эксци-зии сайтов, окружающих регуляторные последовательности, сериновые — для инверсии этих фрагментов, что в итоге приводило к активации промотора или терминатора. Таким способом были сконструированы все 16 логических вентилей [11].
Следует отметить, что основная масса ИГС строится на основе принципа дискретности, т.е. по аналогии с электрическими сетями, в которых существуют два состояния: присутствие сигнала — 1, его отсутствие — 0. Однако биологические системы не могут быть полностью дискретными и в массе своей являются аналоговыми. При конструировании дискретных сетей обычно пренебрегают незначительными фоновыми значениями и амплитудой сигнала, если они не сказываются на общем функционале сети. Вследствие этого конструирование аналоговых ИГС является одним из основных векторов развития синтетической биологии. По мнению ряда авторов, именно они позволят создать так называемые «клеточные электронно-вычислительные машины» [12]. В 2013 г. были предложены ИГС, реализующие математические функции, цифровая репрезентация которых потребовала бы построения сложнейшей многослойной сети с большим количеством вентилей. Аналоговая же реализация включала всего 2 фактора транскрипции, функции которых модулировались широким диапазоном концентраций их индукторов. В основе модуляции находились петли положительной обратной связи. При этом активация обеих петель обратной связи интерпретировалась клеткой как отношение между ними [13].
Таким образом, вызовы современной биологической науки требуют конструирования как аналоговых ИГС, потенциал которых может быть успешно применен, например, в области биосенсоров, о чем подробнее сообщается в разделе «Применение», так и сложных, многослойных сетей, позволяющих реализовывать более сложные функции внутри клеток.
Полусумматоры
Примерами таких многослойных сетей являются, в частности, полусумматоры и полувычитатели. Два соединенных полусумматора представляют собой сумматор. В цифровых вычислениях сумматоры являются ключевыми компонентами сдвиговых реги-
стров, двоичных счетчиков и последовательно-параллельных преобразователей. Полусумматор — это многослойная логическая схема, состоящая из базовых вентилей, но имеющая два выхода: первый отражает сумму значений входов (SUM), второй также отражает ее и заодно переносит результат суммы к следующему полусумматору (CARRY) в качестве входа. Разработка подобных систем в прокариотах дает возможность улучшения контроля и принятия решений клеткой при производстве лекарств и биотоплива, биосенсоров, пробиотиков и т.д., в то время как полусумматоры в эукариотах могут играть роли в терапевтических приложениях. Так, используя в качестве входов арабинозу и рамнозу (наличие каждой равно 1, отсутствие равно 0), в качестве выхода SUM — красный флуоресцентный белок (его появление в системе соответствует сумме равной 1), выхода CARRY — зеленый флуоресцентный белок (появление его в системе равно 2), удалось реализовать ортогональный полусумматор в E. coli [14]. Ортогональностью в контексте СБ принято называть отсутствие влияния искусственных регуляторных элементов на нативные компоненты клетки. Работа по конструированию этих сетей неожиданно для самих авторов позволила определить оптимальную топологию элементов сети для более эффективного ее функционирования [14].
Возможность реализации фундаментальных арифметических операций с использованием полусумматоров и полувычитателей на культуре клеток млекопитающих была показана еще в 2012 г. [15]. В качестве входов системы использовались антибиотики, в качестве выходов — флуоресцентные белки, а «ядром» многослойной сети выступали так называемые контроллеры РНК, то есть белки или нуклеиновые кислоты, влияющие на трансляцию, связываясь с конкретными мотивами мРНК. Например, белок оболочки фага MS2, связывающий РНК-мотив MS2-бокс, и рибосомальный белок архей инги-бируют трансляцию содержащих соответствующие боксы мРНК. Используя эти свойства, а также антибиотик-зависимые трансактиваторы транскрипции, возможно конструировать комплексные сети с заданными свойствами. Важным результатом серии работ, посвященных полусумматорам, является реализация полного сумматора на примере 3D-культуры клеток млекопитающих [16]. Благодаря практически неограниченной суммарной вычислительной мощности клеточных культур, а также детерминированному ответу на различные эндогенные и экзогенные стимулы, ИГС на основе полных сумматоров открывают новые возможности в тканевой инженерии, а также могут привести к значительному упрощению скрининга потенциальных лекарственных препаратов на ЗО-культурах в дальнейшем.
Инженеризация биологических сетей, как было сказано выше, обусловлена идеей прямой аналогии между клеткой и компьютером. В рамках подобной
инженерной логики должен быть сформирован молекулярный инструментарий, используемый для конструирования ИГС и функционирующий в широком диапазоне возможностей. Так как инженерный взгляд предполагает формирование сетей из взаимодействующих элементарных блоков (функциональных частей), необходимо определить подходы к получению этих блоков.
Элементарные блоки и уровни регуляции
На сегодняшний день применяются два подхода получения новых функциональных частей генетических сетей:
1) включает поиск естественных функциональных элементов в базах данных генетических последовательностей (part mining);
2) основан на конструировании направленных регуляторов, таких как химерные транскрипционные факторы, сшитые с нуклеазным белком системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR/Cas) или с транскрипционными активатор-подобными эффекторами TALEN. Подобные регуляторы могут быть также представлены рибопереключателями типа «toehold» и т.п.
При этом первый подход осложняется требованием ортогональности при выборе регуляторных частей ИГС. Специфичность же второго подхода обусловливается изначальными требованиями ортогональности к конструируемым частям. Результатом применения любого из этих подходов является молекула или набор молекул, осуществляющих свою функцию на одном из возможных уровней регуляции: генетическом, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном или посттрансляционном.
Генетическая регуляция
Регуляция на генетическом уровне происходит за счет модификации последовательности ДНК регу-ляторного элемента или его окружения. Рекомбиназы представляют собой один из наиболее часто используемых инструментов для создания искусственных генетических сетей с заданными свойствами. Удобство использования рекомбиназ обусловлено их ортогональностью, с одной стороны, и большим их разнообразием, с другой [17]. Преимуществом рекомбиназ также являются их автономность и многообразие функций: делеция, интеграция, инверсия фрагментов ДНК. Также нельзя не отметить и тот факт, что сегодня существуют технологии получения искусственных рекомбиназ, специфичных к заданным последовательностям, что создает еще больше возможностей для конструирования ИГС. Рекомбиназы могут применяться для построения как простых сетей, в которых часто используется инверсия части
промотора для обратимого ингибирования транскрипции, так и комплексных, через каскадную активацию или многослойные алгоритмы активации элементов ИГС. В то же время использование рекомбиназ позволяет избежать конструирования многослойных сетей на основе логических вентилей. Например, недавно была протестирована регуляторная сеть с формированием генетической памяти, работы по разработке которой тоже являются примерами ин-женеризации биологических сетей. В описанной сети химические стимулы использовались для индукции экспрессии рекомбиназ (для каждой рекомбиназы отдельный стимул). В зависимости от экспрессии конкретной рекомбиназы последняя осуществляла либо инверсию, либо эксцизию определенного сайта, что приводило к изменению регистра и формированию памяти для последнего состояния [18].
К другому подтипу регуляции на генетическом уровне можно отнести системы направленного редактирования геномов. Зарекомендовавшие себя системы на основе белков-цинковых пальцев (ZFN) TALEN и CRISPR/Cas получили широкое распространение при конструировании генетических сетей [19]. Модули, распознающие целевые последовательности в ZFN и TALEN, представлены белками. Для большинства случаев конструирования генетических сетей это не совсем удобно, так как любые изменения дизайна сети требуют полной «пересборки» направляющих белков. В то же время системы на основе CRISPR гораздо удобнее, так как направляющим элементом в них является РНК. Дизайн и получение последней сегодня является рутинной процедурой [20, 21].
Транскрипционная регуляция
Транскрипционный уровень регуляции можно считать важнейшим в аспекте как пространственной, так и временной организации функционала генетических регуляторных сетей. В отличие от генного уровня транскрипционный позволяет не только качественно, но и количественно регулировать экспрессию отдельных блоков сети. Большинство ИГС построено на взаимодействии между блоками посредством пространственно-временной регуляции транскрипции.
Наиболее часто используемыми в конструировании искусственных сетей являются транскрипционные факторы белковой природы, представленные активаторами или репрессорами транскрипции. Между тем не любой транскрипционный фактор может стать элементом синтетической ре-гуляторной сети. В контексте СБ значение имеют лишь ортогональные транскрипционные факторы, что отражается на их разнообразии при конструировании ИГС. В случае прокариот наиболее часто используемыми являются LacI, TetR и cI, а в случае
эукариот VP16, Gal4, KRAB, tTA. В этой связи фокус исследований многих групп сосредоточен на получении искусственных ортогональных пар промотор — транскрипционный фактор. Ряд таких работ привел к значительным успехам. В частности, были получены 12 вариантов транскрипционного фактора cI бактериофага X, которые могут проявлять как репрессорную, так и активаторную активность по отношению к подконтрольным генам с бинаправленными промоторами. Помимо этого также было предложено 270 различных последовательностей искусственных промоторов для этого транскрипционного фактора, что позволяет создать комплексную сеть, используя лишь различные варианты cI с комбинациями промоторов в качестве элементарных блоков [22].
Посттранскрипционная регуляция
Белковые регуляторы представляют собой большой, но не единственный класс регуляторных макромолекул, позволяющих модулировать экспрессию генов в зависимости от внешних условий. Другим классом являются регуляторные РНК, разнообразие которых позволяет конструировать как «цифровые», так и «аналоговые» ИГС. Например, интеграция в 5'-нетранслируемую область эу-кариотической мРНК белок-связывающего апта-мера позволяет регулировать ее трансляцию [23]. В СБ нашли применение так называемые автокаталитические рибозимы, которые представлены относительно короткими РНК-мотивами, способными катализировать расщепление РНК при изменении конформации. Было, в частности, показано, что искусственная интеграция рибозима в различные области эукариотической РНК приводит к расщеплению последней и снижению экспрессии соответствующего гена [24]. Активность рибозима можно контролировать посредством интеграции в часть его структуры аптамера, позволяющего индуцировать активность получившегося аптазима специфическими лигандами. В свою очередь, интеграция аптазима в структуру мРНК дает возможность контролировать экспрессию заданного гена этими лигандами [25]. Большинство ИГС, функционирующих как логические устройства, конструируются на основе белковых регуляторов, взаимодействующих, как правило, с низкомолекулярными соединениями, определяющими их активность. Однако РНК также могут выполнять роль всех элементов систем передачи сигналов: сенсоров, процессоров и актуаторов. В подтверждение этого была представлена работа, в которой основные логические вентили были сконструированы на основе РНК: вентиль AND был сконструирован посредством интеграции в З'-нетранслируемую область мРНК двух аптазимов, каждый из которых взаи-
модействовал со своим лигандом. Аналогичного эффекта удалось добиться формированием аптазима, контролируемого двумя аптамерами, специфичным к разным лигандам [26].
Трансляционная регуляция
Создание искусственных функциональных элементов клетки сфокусировано и на трансляционной машинерии. Работы, ведущиеся в этой области, включают как создание ортогональных рибосом, взаимодействующих с определенными мРНК [27], так и конструирование трансляционного аппарата, ориентированного на искусственный генетический код [28]. В частности, было продемонстрировано, что естественные рибосомы могут встраивать в синтезируемые белки более 150 неканонических аминокислот [29—31], катализировать полимеризацию непептидных полимеров (например, полиэстеров) [32]. Возможность использования стратегии мультиплексной автоматизированной инженерии геномов (MAGE) в создании высокоселективных и ортогональных ааРС-тРНК пар способствует включению неканонических аминокислот в полипептидную цепь in vivo [33].
Посттрансляционная регуляция
Принципы инженеризации используются также для перенастройки нативных биологических сетей, например, было продемонстрировано искусственное переключение путей активации MAPK [34] (рис. 3). Такое переключение возможно при наличии в сигнальных путях общего звена, связывающегося со скаффолдными белками. Позднее этой же группой была предложена концепция искусственных скаф-фолдных белков, специфичность связывания разных звеньев каскада которыми может быть изначально задана посредством «пришивания» к целевым белкам аминокислотной последовательности, аффинной к домену скаффолда. При этом, задавая силу связывания аминокислотной последовательности со скаф-фолдом, удавалось добиться более тонкой регуляции данного сигнального пути, например, через введение в него дополнительных звеньев или, наоборот, через их делецию [35].
Еще одним важным белковым инструментом СБ являются интеины, цис- или транссплайсинг которых используется, например, для доставки больших конструкций в клетки млекопитающих [36], детектирования белок-белковых взаимодействий in vivo [37], лиганд-зависимой активации белков [38], редокс-зависимой активации [39] и т.д. На примере транскрипционных факторов на основе цинковых пальцев (ZF-TF) транс-сплайсинг интеинов использовали для конструирования NAND и AND логических сетей [40]. По подобной схеме создали про-
Рис. 3. Переключение MAPK пути.
Два различных сигнальных каскада в дрожжах осуществляются посредством работы белка Ste11: 1) передача сигнала о повышении ос-молярности и 2) феромон-зависимое размножение. Используя этот факт, был создан гибридный путь, начало сигнального каскада в котором проходило по феромон-зависимому пути до звена Ste11, а далее сигнал передавался по пути ответа на высокую осмолярность, то есть клетки реагировали на феромон аналогично гиперосмотическому ответу. Сверху слева показан путь при клеточном ответе на феромон, справа сверху — при ответе на гиперосмотические условия. Снизу показан объединенный путь благодаря общему звену — Ste11.
Stell Ш Ste4
/ гиперосмотический
^ ответ
«Г,* ■ V Я Г
ш* Язями
Pbs2
*
Högl
стейшую AND сеть с тремя ВВОДами, но на примере TALE. Для этого использовали транс-сплайсинг трех частей мини-интеина dnaB [41]. Чуть позже была показана возможность использования интеинов для конструирования полосового фильтра (band-pass filter), широко используемого в СБ для экспрессии продукта только при средних уровнях концентрации ВВОДа. Такой фильтр зачастую требует наличия AND вентиля, которым послужила уже созданная система [42].
Применение
Наибольшее количество ожиданий применения технологий синтетической биологии связано с медициной. Созданные и разрабатываемые концепции СБ дают возможность оптимистичных прогнозов формирования новых классов диагностических и терапевтических решений. В ряде случаев такие решения уже внедряются в практическую медицину. Свое применение находят как молекулярные компоненты генетических сетей, так и модифицированные клет-
ки. Так, в настоящий момент проходят регистрационные процедуры для новых типов тест-систем, основанных на РНК-переключателях типа toehold, особенностью которых является возможность точного обнаружения заданной последовательности РНК. В частности, подобные тест-системы были предложены для быстрого обнаружения вирусов Зика и Эбо-ла [43, 44]. Эта же технология с небольшими модификациями была предложена для оценки профиля микробиоты и выявления связанных с ней биомаркеров заболеваний [45].
Сегодня рассматриваются различные аспекты применения принципов и инструментов СБ, начиная от более глубокого понимания клеточных функций, заканчивая диагностическими и терапевтическими системами. В отличие от ранних подходов «слепого» конструирования, при котором изменения, вносимые в клетки, часто приводили к непредсказуемым результатам, принцип направленного конструирования позволил прогнозировать поведение клетки при применении тех или иных инструментов изменения генома и фенотипа клеток. Это позволило повысить эффективность разработок, главным образом, за счет снижения издержек, возникающего по причине большого количества ошибок при «слепом» конструировании. Так, например, ортогональность продуктов искусственных генетических сетей значительно снижает их влияние на внутриклеточное окружение. С другой стороны, такие инструменты, как язык булевой логики, обеспечили повышение эффективности теоретического этапа конструирования, благодаря чему искусственные генетические сети стали более комплексными по структуре и многофункциональными по сути.
При создании молекулярных инструментов, таких как РНК-переключатели, эффекторные гены, рекомбиназы, искусственные промоторы и т.п., также стал учитываться принцип ортогональности.
Одним из главных достижений СБ можно смело назвать уход от дискретности при внесении каких-либо модификаций генома. Сегодня мы можем с большой точностью прогнозировать количественные характеристики вносимых изменений, что крайне важно для медицинских и биотехнологических приложений продуктов, созданных с применением подходов модификации генома. Создаваемые сегодня ИГС становятся все более «аналоговыми», степень выраженности отдельных частей которых можно регулировать как внешними факторами, так и через петли обратной связи.
Микробиота также является объектом пристального внимания при разработке новых терапевтических подходов, что объясняется относительной простотой конструирования бактерий с заданными свойствами и сниженными по сравнению с вмешательством в клетки человека рисками. А именно были предложены несколько подходов терапии вос-
палительных заболеваний кишечника, основанных на секреции представителями кишечной микробио-ты (Lactococcus lactis) противовоспалительных цито-кинов, в том числе IL-10 [46], или антител, направленных на провоспалительные цитокины [47]. Подходы, основанные на использовании способностей бактерий продуцировать заданные, в том числе терапевтические соединения, рассматриваются и в противоопухолевых стратегиях. Было предложено решение, в основе которого лежит модификация E. coli с целью переноса в клетки человека плазмидного вектора, кодирующего короткие шпилечные РНК (shRNA), ин-гибирующие продукцию катенина бета-1, гиперэкспрессия которого наблюдается при некоторых типах рака [48]. Терапевтический потенциал бактериальных клеток заключается не только в их способности продуцировать заданные соединения, но и в возможности таргетной доставки этих соединений непосредственно к очагам заболевания с помощью модификаций клеточной стенки бактерий, направленных на способность узнавать специфические антигены на поверхности эукариотических клеток. В итоге была продемонстрирована способность модифицированных клеток E. coli колонизировать очаг пролиферации опухоли [49].
Использование технологий СБ для модификации бактериальных представителей микробиоты человека открывает большие возможности для терапии не только локальных заболеваний кишечника. Инфекционные и метаболические болезни также находятся в поле внимания исследователей. Разрабатывается терапия с использованием внедренных в микробиотические консорциумы искусственных генетических сетей. Например, на животных моделях была продемонстрирована стратегия репрограммиро-вания клеток кишечника в инсулин-продуцирующие клетки посредством конструирования GLP-1 секре-тирующего штамма Lactobacillus gasseri [50]. Подход с использованием микробиоты представил эффективную стратегию превентивной анти-ВИЧ-терапии: модификация представителя микробиоты влагалища — Lactobacillus jensenii, направленная на формирование штамма, продуцирующего циановирин (обладающий определенной активностью против ВИЧ), снижала обсемененность ВИЧ у подопытных макак на 63% [51].
Одним из важнейших примеров внедрения в клиническую практику технологий СБ для современного мирового здравоохранения является CAR-T терапия. В ее основе лежит искусственно-конструируемый антигенный рецептор, индукция которого приводит к противоопухолевой активации Т-кле-ток [52]. В настоящий момент проводится большое количество исследований, направленных на повышение эффективности CAR-T и создание альтернативных, в том числе лиганд-индуцируемых вариантов данного метода. В качестве одного из вариантов
рассматривается применение синтетических Notch-рецепторов (SynNotch), активация которых поверхностными антигенами позволяет создавать более точные системы, активируемые свободными лигандами или поверхностными антигенами и приводящие в конечном итоге к индукции экспрессии трансгена [53]. Развитие концепций СБ как терапевтических стратегий наиболее активно происходит в направлении модификации иммунных клеток посредством комбинации различных растворимых и трансмембранных рецепторов и, главным образом, направлено на достижение ортогональности искусственных каскадов повышенной специфичности. Одновременно с этим ведутся работы по конструированию тераностиче-ских подходов для диагностики и терапии метаболических нарушений. Так, была создана генетическая сеть, продуцирующая инсулин в ответ на понижение pH [54]. Наряду с этим существует апробированная на животных моделях стратегия регуляции уровня глюкозы в крови, основанная на генетических сетях с оптогенетическими сенсорами [55], а также ИГС, функционирующая по принципу петли обратной связи для поддержания в крови баланса жирных кислот [56].
Основной причиной метаболических эндокринных и воспалительных болезней принято считать дисбаланс соответственно метаболитов, гормонов и ци-токинов [57]. Подавляющее большинство из этих соединений крайне важны для нормального функционирования организма, в связи с чем возможной терапевтической стратегией является восстановление их баланса посредством ИГС, функционирующих по принципу петли обратной связи. Применение данной стратегии позволило создать систему контроля уровня глюкозы в крови посредством конструирования ИГС, в которой экспрессия инсулина активировалась глюкозным сенсором, в качестве которого выступал глюкозо-чувствительный кальциевый канал [58].
Благодаря конвергенции СБ с другими направлениями науки и технологий, разрабатываются подходы к диагностике острых состояний. Например, был разработан комбинированный сенсор, состоящий из бактерий, несущих гем-чувствительную ИГС, и электронной части, которая посылает радиосигнал в случае активации генетической сети гемом [59]. Разработанный сенсор предназначен для обнаружения кровотечений в желудочно-кишечном тракте и является прорывом в диагностике данного состояния. Несмотря на уже имеющиеся успехи, применение решений СБ в медицине находится в начале своего пути, что демонстрируется концепциями, реализация которых происходит в настоящее время [60].
Но применение СБ не ограничивается медицинскими приложениями. Международные коммерческие компании также используют достижения СБ, например, для разработки биоизопрена, получаемого
из возобновляемого сырья и используемого для изготовления автомобильных покрышек без материалов нефтепереработки. Для этого используют модифицированные бактерии, эффективно перерабатывающие сахара, получаемые из сахарного тростника, кукурузы, проса и другой биомассы в изопрен. Важнейшим этапом этого процесса является настройка метаболических путей для получения 3,3-диметилал-лилпирофосфата фМАРР), из которого уже получается конечный продукт с помощью фермента изо-пренсинтазы.
Принципы и методы синтетической биологии позволяют воссоздать процессы клеточной дифференциации, управляя дальнейшей судьбой клеток. Подход, продемонстрированный в [61], показывает возможность модификации транскрипционных факторов с помощью трансактиваторных доменов, пришитых к концам белков, на примере ОСТ4, 80X2, КАКОО, Е^4, чья принципиальная роль в репро-граммировании фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) широко известна.
Еще одним примером может служить работа по получению глюкозо-чувствительных инсулин-се-кретирующих бета-клеток из ИПСК путем построения синтетической регуляторной сети [62].
Одно из самых ранних применений СБ нашла в сенсорах токсичных веществ в воде, почве, пище. Для детектирования тяжелых металлов и антибиотиков используются простые схемы с репортерным белком и чувствительным элементом, передающим сигнал на репортер. Например, была предложена концепция бактериального биосенсора с осциллирующей флуоресценцией, интенсивность и частота которой сообщала о концентрации мышьяка в среде [63].
В то же время возможно запрограммировать микроорганизмы на удаление вредных органических веществ и тяжелых металлов из среды. Интродукция металл-связывающего пептида в ризобакте-рий, деградирующих трихлорэтилен (ТХЭ), приводит одновременно к захвату металлов и уничтожению ТХЭ [64].
Широкое применение СБ также нашла в биотопливной сфере. Различные виды микроводорослей успешно программируются, используя достижения метаболической инженерии для получения биотоплива [65].
Массачусетский технологический институт в сотрудничестве с несколькими другими университетами участвовали в разработке СуЪегр^ш — микроробота, работающего на принципах СБ. Это комплексная система, состоящая из мышечных клеток млекопитающих, получающая энергию за счет бактерий. Онтогенетически модифицированные мышечные клетки необходимы для перемещения микроробота в воде, имитируя ундулирующее движение. Ко-
ординацию сокращений обеспечивает электронный биоподражаемый центральный генератор паттерна (central pattern generator, CPG). В природе центральный генератор паттерна — это нейронный ансамбль, члены которого совместно порождают (генерируют) упорядоченную по времени и мишеням выходную активность ансамбля, которая служит командой для мышц [66]. Электронный аналог посылает сигналы мышечным клеткам через органический светодиод (organic light-emitting diode, OLED), получаемый методом SD-печати из каптона — по-лиимидной пленки. OLED отвечает за сопряжение процессов возбуждения/сокращения. Электронное устройство работает благодаря «микробному топливному элементу», интегрированному в «тело» робота. Вся система находится в гидрогеле, что обособляет ее от внешней среды [67]. По задумке исполнителей проекта микроробот должен имитировать поведение морской миноги.
Заключение и перспективы
Таким образом, современный этап развития синтетической биологии характеризуется формированием инженерных принципов конструирования регуляторных сетей, а также развитием инструментов, включающих все известные типы биологических макромолекул и надмолекулярных структур. Главной задачей в этом аспекте является поиск
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Monod J, Jacob F. General Conclusions: Teleonomic Mechanisms in Cellular Metabolism, Growth, and Differentiation. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 1961;26(0):389-401. https://doi.org/10.1101/SQB.1961.026.01.048
2. Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 2014;12(5):381-390. https://doi.org/10.1038/nrmicro3239
3. Gardner TS, Cantor CR, Collins JJ. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 2000;403(6767):339-342. https://doi.org/10.1038/35002131
4. Elowitz MB, Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 2000;403(6767):335-338. https://doi.org/10.1038/35002125
5. Weiss R, Knight TF. Engineered communications for microbial robotics. In: Condon A, Rozenberg G, eds. DNA Computing. Vol 2054. Lecture Notes in Computer Science. Springer Berlin Heidelberg; 2001;1-16. https://doi.org/10.1007/3-540-44992-2_1
6. Basu S, Gerchman Y, Collins CH, Arnold FH, Weiss R. A synthetic multicellular system for programmed pattern formation. Nature. 2005;434(7037):1130-1134. https://doi.org/10.1038/nature03461
7. McAdams H, Shapiro L. Circuit simulation of genetic networks. Science. 1995;269(5224):650-656. https://doi.org/10.1126/science.7624793
8. Beal J, Phillips A, Densmore D, Cai Y. High-Level Programming Languages for Biomolecular Systems. In: Koeppl H, Setti G, di Bernardo M, Densmore D, eds. Design and Analysis of Biomolecular Circuits. Springer New York; 2011;225-252.
https://doi.org/10.1007/978-1-4419-6766-4_11
9. Konur S, Gheorghe M, Dragomir C, Ipate F, Krasnogor N. Conventional Verification for Unconventional Computing: a Genetic XOR Gate Example. Fundamenta Informaticae. 2014;134(1-2):97-110. https://doi.org/10.3233/FI-2014-1093
или создание ортогональных систем, функционирование которых внутри клеток не будет затрагивать нативные метаболические и биогенетические пути. Тенденция к инженеризации СБ будет развиваться и дальше и, по мнению авторов данного обзора, в конечном итоге должна привести к формированию общей базы элементарных блоков, комбинации которых смогут реализовывать потенциально любой функционал, а задача исследователей будет сведена к правильному подбору элементов разрабатываемой сети.
Обилие возможностей синтетических сетей, даже минимально проиллюстрированных в данном обзоре, показывает широкое их применение в различных областях, несмотря на тот факт, что СБ как наука зародилась относительно недавно и находится на начальном этапе своего развития. Поэтому можно предположить, что в среднесрочной перспективе ожидаются дальнейшие крупные успехи СБ в медицине, экологии, биотехнологической и других отраслях.
Финансирование работы
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-2907046.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
10. Tamsir A, Tabor JJ, Voigt CA. Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical 'wires.' Nature. 2011;469(7329):212-215. https://doi.org/10.1038/nature09565
11. Weinberg BH, Pham NTH, Caraballo LD, Lozanoski T, Engel A, Bhatia S, et al. Large-scale design of robust genetic circuits with multiple inputs and outputs for mammalian cells. Nat Biotechnol. 2017;35(5):453-462. https://doi.org/10.1038/nbt.3805
12. Cardinale S, Arkin AP. Contextualizing context for synthetic biology — identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 2012;7(7):856-866. https://doi.org/10.1002/biot.201200085
13. Daniel R, Rubens JR, Sarpeshkar R, Lu TK. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 2013;497(7451):619-623. https://doi.org/10.1038/nature12148
14. Wong A, Wang H, Poh CL, Kitney RI. Layering genetic circuits to build a single cell, bacterial half adder. BMC Biol. 2015;13(1):40. https://doi.org/10.1186/s12915-015-0146-0
15. Rossetti M, Del Grosso E, Ranallo S, Mariottini D, Idili A, Bertucci A, et al. Programmable RNA-based systems for sensing and diagnostic applications. Anal Bioanal Chem. 2019;411(19):4293-4302. https://doi.org/10.1007/s00216-019-01622-7
16. Ausländer D, Ausländer S, Pierrat X, Hellmann L, Rachid L, Fussenegger M. Programmable full-adder computations in communicating three-dimensional cell cultures. Nat Methods. 2018;15(1):57-60. https://doi.org/10.1038/nmeth.4505
17. Gaj T, Sirk SJ, Barbas CF. Expanding the scope of site-specific recombinas-es for genetic and metabolic engineering: Expanding the Scope of Site-Specific Recombinases. Biotechnol Bioeng. 2014;111(1):1-15. https://doi.org/10.1002/bit.25096
18. Roquet N, Soleimany AP, Ferris AC, Aaronson S, Lu TK. Synthetic recombi-nase-based state machines in living cells. Science. 2016;353(6297):aad8559-aad8559. https://doi.org/10.1126/science.aad8559
19. Carroll D. Genome Engineering with Targetable Nucleases. Annu Rev Bio-chem. 2014;83(1):409-439.
https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060713-035418
20. Pickar-Oliver A, Gersbach CA. The next generation of CRISPR—Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(8):490-507. https://doi.org/10.1038/s41580-019-0131-5
21. Kocak DD, Josephs EA, Bhandarkar V, Adkar SS, Kwon JB, Gersbach CA. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures. NatBiotechnol. 2019;37(6):657-666. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0095-1
22. Brödel AK, Jaramillo A, Isalan M. Engineering orthogonal dual transcription factors for multi-input synthetic promoters. Nat Commun. 2016;7(1):13858. https://doi.org/10.1038/ncomms13858
23. Stripecke R, Oliveira CC, McCarthy JE, Hentze MW. Proteins binding to 5' untranslated region sites: a general mechanism for translational regulation of mRNAs in human and yeast cells. Mol Cell Biol. 1994;14(9):5898-5909. https://doi.org/10.1128/MCB.R9.5898
24. Yen L, Svendsen J, Lee JS, Gray JT, Magnier M, Baba T, et al. Exogenous control of mammalian gene expression through modulation of RNA self-cleavage. Nature. 2004;431(7007):471-476. https://doi.org/10.1038/nature02844
25. Ausländer S, Ketzer P, Hartig JS. A ligand-dependent hammerhead ri-bozyme switch for controlling mammalian gene expression. Mol BioSyst. 2010;6(5):807.
https://doi.org/10.1039/b923076a
26. Win MN, Smolke CD. Higher-Order Cellular Information Processing with Synthetic RNA Devices. Science. 2008;322(5900):456-460. https://doi.org/10.1126/science.1160311
27. Rackham O, Chin JW. A network of orthogonal ribosome-mRNA pairs. Nat Chem Biol. 2005;1(3):159-166. https://doi.org/10.1038/nchembio719
28. Chen Z, Lichtor PA, Berliner AP, Chen JC, Liu DR. Evolution of sequence-defined highly functionalized nucleic acid polymers. Nature Chem. 2018;10(4):420-427.
https://doi.org/10.1038/s41557-018-0008-9
29. Davis L, Chin JW. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13(3):168-182. https://doi.org/10.1038/nrm3286
30. Forster AC, Tan Z, Nalam MN, Lin H, Qu H, Cornish VW, et al. Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed de novo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003;100(11):6353-6357. https://doi.org/10.1073/pnas.1132122100
31. O'Donoghue P, Ling J, Wang Y-S, Söll D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 2013;9(10):594-598. https://doi.org/10.1038/nchembio.1339
32. Farzadfard F, Gharaei N, Higashikuni Y, Jung G, Cao J, Lu TK. Single-Nu-cleotide-Resolution Computing and Memory in Living Cells. Synthetic Biology; 2018.
https://doi.org/10.1101/263657
33. Amiram M, Haimovich AD, Fan C, Wang YS, Aerni HR, Ntai I, et al. Evolution of translation machinery in recoded bacteria enables multi-site incorporation of nonstandard amino acids. Nat Biotechnol. 2015;33(12):1272-1279. https://doi.org/10.1038/nbt.3372
34. Park S-H. Rewiring MAP Kinase Pathways Using Alternative Scaffold Assembly Mechanisms. Science. 2003;299(5609):1061-1064. https://doi.org/10.1126/science.1076979
35. Ryu J, Park S-H. Simple synthetic protein scaffolds can create adjustable artificial MAPK circuits in yeast and mammalian cells. Sci Signal. 2015;8(383):ra66-ra66. https://doi.org/10.1126/scisignal.aab3397
36. Truong DJ, Kühner K, Kühn R, Werfel S, Engelhardt S, Wurst W, et al. Development of an intein-mediated split—Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 2015;43(13):6450-6458. https://doi.org/10.1093/nar/gkv601
37. Kanno A, Ozawa T, Umezawa Y. Bioluminescent Imaging of MAPK Function with Intein-Mediated Reporter Gene Assay. In: Rich PB, Douillet C, eds. Bioluminescence. Vol 574. Methods in Molecular Biology. Humana Press; 2009:185-192.
https://doi.org/10.1007/978-1-60327-321-3_15
38. Davis KM, Pattanayak V, Thompson DB, Zuris JA, Liu DR. Small molecule — triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nat Chem Biol. 2015;11(5):316-318. https://doi.org/10.1038/nchembio.1793
39. Callahan BP, Topilina NI, Stanger MJ, Van Roey P, Belfort M. Structure of catalytically competent intein caught in a redox trap with functional and evolutionary implications. Nat Struct Mol Biol. 2011;18(5):630-633. https://doi.org/10.1038/nsmb.2041
40. Lohmueller JJ, Armel TZ, Silver PA. A tunable zinc finger-based framework for Boolean logic computation in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 2012;40(11):5180-5187. https://doi.org/10.1093/nar/gks142
41. Lienert F, Torella JP, Chen J-H, Norsworthy M, Richardson RR, Silver PA. Two- and three-input TALE-based AND logic computation in embryonic stem cells. Nucleic Acids Research. 2013;41(21):9967-9975. https://doi.org/10.1093/nar/gkt758
42. Schaerli Y, Gili M, Isalan M. A split intein T7 RNA polymerase for transcriptional AND-logic. Nucleic Acids Research. 2014;42(19):12322-12328. https://doi.org/10.1093/nar/gku884
43. To AC, Chu DH, Wang AR, Li FC, Chiu AW, Gao DY, et al. A comprehensive web tool for toehold switch design. Wren J, ed. Bioinformatics. 2018;34(16):2862-2864. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty216
44. Hall RA, Macdonald J. Synthetic Biology Provides a Toehold in the Fight against Zika. Cell Host & Microbe. 2016;19(6):752-754. https://doi.org/10.1016Xj.chom.2016.05.020
45. Takahashi MK, Tan X, Dy AJ, Braff D, Akana RT, Furuta Y, et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nat Commun. 2018;9(1):3347. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05864-4
46. Steidler L. Treatment of Murine Colitis by Lactococcus lactis Secreting In-terleukin-10. Science. 2000;289(5483):1352-1355. https://doi.org/10.1126/science.289.5483.1352
47. Vandenbroucke K, de Haard H, Beirnaert E, Dreier T, Lauwereys M, Huy-ck L, et al. Orally administered L. lactis secreting an anti-TNF Nanobody demonstrate efficacy in chronic colitis. Mucosal Immunol. 2010;3(1):49-56. https://doi.org/10.1038/mi.2009.116
48. Xiang S, Fruehauf J, Li CJ. Short hairpin RNA—expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat Biotechnol. 2006;24(6):697-702. https://doi.org/10.1038/nbt1211
49. Piñero-Lambea C, Bodelón G, Fernández-Periáñez R, Cuesta AM, Álva-rez-Vallina L, Fernández LÁ. Programming Controlled Adhesion of E. coli to Target Surfaces, Cells, and Tumors with Synthetic Adhesins. ACS Synth Biol. 2015;4(4):463-473. https://doi.org/10.1021/sb500252a
50. Duan FF, Liu JH, March JC. Engineered Commensal Bacteria Reprogram Intestinal Cells Into Glucose-Responsive Insulin-Secreting Cells for the Treatment of Diabetes. Diabetes. 2015;64(5):1794-1803. https://doi.org/10.2337/db14-0635
51. Lagenaur LA, Sanders-Beer BE, Brichacek B, Pal R, Liu X, Liu Y, et al. Prevention of vaginal SHIV transmission in macaques by a live recombinant Lactobacillus. Mucosal Immunol. 2011;4(6):648-657 https://doi.org/10.1038/mi.2011.30
52. Lim WA, June CH. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 2017;168(4):724-740. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.01.016
53. Roybal KT, Williams JZ, Morsut L, Rupp LJ, Kolinko I, Choe JH, et al. Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell. 2016;167(2):419-432.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.011
54. Ausländer D, Ausländer S, Charpin-El Hamri G, Sedlmayer F, Müller M, Frey O, et al. A Synthetic Multifunctional Mammalian pH Sensor and CO2 Transgene-Control Device. Molecular Cell. 2014;55(3):397-408. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.06.007
55. Ye H, Baba MD-E, Peng R-W, Fussenegger M. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science. 2011;332(6037):1565-1568. https://doi.org/10.1126/science.1203535
56. Rössger K, Charpin-El-Hamri G, Fussenegger M. A closed-loop synthetic gene circuit for the treatment of diet-induced obesity in mice. Nat Commun. 2013;4(1):2825.
https://doi.org/10.1038/ncomms3825
57. Kotas ME, Medzhitov R. Homeostasis, Inflammation, and Disease Susceptibility. Cell. 2015;160(5):816-827. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.02.010
58. Xie M, Ye H, Wang H, Charpin-El Hamri G, Lormeau C, Saxena P, et al. [-cell-mimetic designer cells provide closed-loop glycemic control. Science. 2016;354(6317):1296-1301. https://doi.org/10.1126/science.aaf4006
59. Mimee M, Nadeau P, Hayward A, Carim S, Flanagan S, Jerger L, et al. An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health. Science. 2018;360(6391):915-918. https://doi.org/10.1126/science.aas9315
60. Purcell O, Lu TK. Synthetic analog and digital circuits for cellular computation and memory. Current Opinion in Biotechnology. 2014;29:146-155. https://doi.org/10.1016/jxopbio.2014.04.009
61. Hirai H, Tani T, Kikyo N. Structure and functions of powerful transactiva-tors: VP16, MyoD and FoxA. Int JDev Biol. 2010;54(11-12):1589-1596. https://doi.org/10.1387/ijdb.103194hh
62. Saxena P, Bojar D, Zulewski H, Fussenegger M. Generation of glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells from human embryonic stem cells by incorporating a synthetic lineage-control network. Journal of Biotechnology. 2017;259:39-45.
https://doi.org/10.1016/jobiotec.2017.07.018
63. Prindle A, Samayoa P, Razinkov I, Danino T, Tsimring LS, Hasty J. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels.' Nature. 2012;481(7379):39-44. https://doi.org/10.1038/naturel0722
64. Lee W, Wood TK, Chen W. Engineering TCE-degrading rhizobacteria for heavy metal accumulation and enhanced TCE degradation. Biotechnol Bioeng. 2006;95(3):399-403. https://doi.org/10.1002/bit.20950
65. Jagadevan S, Banerjee A, Banerjee C, Guria C, Tiwari R, Baweja M, et al. Recent developments in synthetic biology and metabolic engineering in mi-croalgae towards biofuel production. Biotechnol Biofuels. 2018;11(1):185. https://doi.org/10.1186/s13068-018-1181-1
66. Balaban PM, Vorontsov DD, Dyakonova VE, Dyakonova TL, Zakharov IS, Korshunova TA, et al. The Central Pattern Generators. Жвысш нерв деят-сти. 2013;63(5):520-541. https://doi.org/10.7868/S0044467713050031
67. Lu J, Yang J, Kim Y-B, Ayers J. Low power, high PVT variation tolerant central pattern generator design for a bio-hybrid micro robot. In: 2012 IEEE 55th International Midwest Symposium on Circuits and Systems (MWSCAS). IEEE; 2012;782-785.
https://doi.org/10.1109/MWSCAS.2012.6292137
Поступила в редакцию 18.03.2020 Received 18.03.2020 После доработки 10.07.2020 Revised 10.07.2020 Принята к публикации 18.07.2020 Accepted 18.07.2020
