CC BY
15УДК 57.037: (547.315+547.326)
V. A. Ivaschenko, V. I. Krutikov, A. V. Erkin, V. V. Krutikova
THE SYNERGIC INHIBITION OF HYDROLASES OF THE DEGRADATION PRODUCTS OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS AND CARBAMATES
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University) Moskovsky Pr. 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: kruerk@yandex.ru
An inhibitory effect of organophosphorus compounds and carbamates on enzymes of the class of peptidases was studied by UV-spectrophotometry in vitro. Trypsin lyophilized, which is obtained from the pancreas of cattle, and the acetylcholinesterase were chosen as research objects. The use of in-dophenylacetate as a chromogenic substrate of trypsin was proven. The degree of inhibition of trypsin by the combined effect of several inhibitors was evaluated using a full factorial experiment. The study of kinetic regularities of the combined effects of organophosphorus compounds and carbamates on the activity of trypsin showed a manifestation of synergy.
Keywords: indophenylacetate; organophosphorus compounds; carbamates; acetylcholinesterase; trypsin; kinetics of hydrolysis of indophenylacetate, biochemical indication, inhibition; full factorial experiment.
В. А. Иващенко1, В. И. Крутиков2, А.В. Еркин3, В.В. Крутикова4
СИНЕРГИЗМ
ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ
ГИДРОЛАЗ ПРОДУКТАМИ
ДЕСТРУКЦИИ
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ
СОЕДИНЕНИЙ
И КАРБАМАТАМИ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет). Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: kruerk@yandex.ru
Методом спектрофотометрии с применением в качестве хромогенного субстрата индофенилацета-та in vitro исследована ингибирующая активность фосфорорганических соединений (ФОС) и карбама-тов на ферменты класса гидролаз. В качестве объекта исследования выбраны трипсин лиофилизирован-ный, полученный из поджелудочной железы крупного рогатого скота (КФ 3.4.21), и ацетилхолинэстераза (КФ 3.1.1.7.). С использованием полного факторного эксперимента оценена степень угнетения ферментов при комбинированном воздействии нескольких ингибиторов. Изучение кинетических закономерностей совместного воздействия фосфорорганических соединений и карбаматов на активность холинэстера-зы и трипсина показало проявление синергизма.
Ключевые слова: индофенилацетат; фосфорорганичес-кие соединения; карбаматы; холинэстераза; трипсин; биохимическая индикация; ингибирование; полный факторный эксперимент.
DOI: 10.15217Zissn1998984-9.2015.28.58
Исследования биологического отклика живых систем на воздействия свермалых доз ксенобиотиков показали, что становление этого нового направления в науке прошло сложный путь - от полного отрицания существования самой проблемы и достоверности экспериментальных данных до осознания ее как единого явления [1].
При комбинированном влиянии на организм различных физиологически активных веществ важное значение имеют молекулярный механизм их токсического действия, характер и динамика развития нарушений биохимических и физиологических процессов. Известно, что низкомолекулярные нейротропные антихолинэстеразные вещества (фосфорсодержащие соединения, карбаматы) при действии в дозах и концентрациях на уровне эффективных токсодоз вызывают быстрое развитие симптомов
интоксикации. Иной аспект, возникающий при действии малых доз некоторых фосфорорганических соединений (ФОС), связана с так называемым «синдромом отставленной нейротоксичности ФОС» [2].
Ситуации, в которых возможно комбинированное действие ксенобиотиков и различных физических факторов на организм человека, безусловно, многочисленны и разнообразны, но особое внимание следует обратить на проблему уничтожения запасов химического оружия и некондиционных пестицидов, решение которой далеко до своего завершения. Требования мониторинга окружающей среды постоянно ужесточаются. Предельно допустимые концентрации (ПДК) ксенобиотиков в воде, почве, воздухе при уничтожении сильнодействующих ядовитых веществ весьма низки и строго контролируются, однако это не может гарантировать безопасность людей.
Наиболее сложную проблему составляет анализ продуктов деструкции низкомолекулярных ней-
1 Иващенко Владимир Александрович, студент кафедры химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: v.ivachtchenko@gmail.com Ivaschenko Vladimir A., student, Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances, e-mail: v.ivachtchenko@gmail.com
2 Крутиков Виктор Иосифович, докт. хим. наук, зав. кафедрой химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: kruerk@yandex.ru Krutikov Viktorl., Dr Sci. (Chem.), Head of Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances , e-mail: kruerk@yandex.ru
3 Еркин Андрей Викторович, канд. хим. наук, доцент кафедры химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: kruerk@yandex.ru Erkin Andrey V., Ph.D. (Chem), Associate Professor, Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances, e-mail: kruerk@yandex.ru
4 Крутикова Вера Валентиновна, мл. научн. сотр. кафедры химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: kruerk@yandex.ru Krutikova Vera V., Researcher, Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances, e-mail: kruerk@yandex.ru
Дата поступления - 16 февраля 2015 года Received February 16, 2015
ротропных веществ. Действительно, комбинированный вид ингибирования ряда ферментов ФОС изучен давно и весьма обстоятельно [3]. Именно поэтому нормативно-методическая база, строго регламентирующая проведение отдельных стадий химического анализа (про-боотбор, консервирование и транспортировка проб, пробоподготовка, получение и обработка результатов) самих объектов детоксикации - ФОС разработана достаточно полно. В то же время для анализа продуктов их деструкции большинство методик находится на стадии разработки и аттестации.
Из продуктов деструкции ФОС в перечень веществ, подлежащих аналитическому контролю на уровне предельно допустимых концентраций в рабочей зоне, атмосферном воздухе, в воде и почве, входят алкил-метилфосфоновые кислоты, структура которых несёт в себе отличительные особенности, достаточные для их идентификации и заключения об источнике происхождения [4, 5]. При этом необходимо отметить, что наиболее вероятные продукты детоксикации ФОС, образующихся в условиях двухстадийной технологии их уничтожения, принятой в нашей стране, обладают весьма невысокой токсичностью. В частности, величина DL50 (крысы, пе-рорально) для метилфосфоновой кислоты составляет 0.5103 мг/кг.
Несмотря на низкую токсичность соединений из гомологических рядов моно- и диалкилметилфосфона-тов предполагается, что в заболеваниях «неясной этиологии», которые наблюдаются у жителей, проживающих в регионах уничтожения запасов химического оружия, важная роль принадлежит комплексному воздействию сверхмалых доз фосфорорганических соединений разного назначения, в том числе и отравляющих веществ нервно-паралитического действия, а также их комбинации. Синергизм в действии различных химических токсикантов и физических факторов, по-видимому, ответствен за развитие других экологических болезней.
Учитывая все многообразие протекающих реакций декомпозиции, гидролиза и вовлеченность молекул карбаматов в многочисленные метаболические процессы, следует сказать, что универсальный маркер, по которому можно было бы определить загрязненность среды карбаматами, отсутствует [6].
В настоящей работе поставлена задача оценить вероятность проявления синергизма при воздействии in vitro ряда фосфорорганических соединений и карбаматов на ферменты класса гидролаз - холинэстеразу и трипсин. Выбор ферментов обусловлен тем, что один из них играет ключевую роль в процессах нейрогуморальной и синапти-ческой передачи, а другой - являясь типичным представителем группы сериновых протеаз, способен активировать или изменять свойства белков.
Из многих разработанных к настоящему времени способов определения активности ферментов наиболее популярны колориметрические (фотометрические) методы, для которых характерны простота постановки анализа, высокая скорость и чувствительность. В частности, фотометрический метод определения имеет порог чувствительности по изопропилметилфосфонату 510-7 мг/мл [7]. При определении энзиматической активности холи-нэстеразы в качестве хромогенного субстрата часто используется индофенилацетат [8].
Выбор индофенилацетата обусловлен его оптимальными физико-химическими свойствами, а именно: отсутствием ингибирующей способности по отношению к изучаемому ферменту, значениями оптических характеристик лежащими в видимой области спектра, отсутствию влияния температуры на величину аналитического эффекта, хорошей растворимостью в воде.
Для определения эстеразной активности сериновых протеаз в лабораторной в качестве субстратов применяются эфиры аминокислот: гиппурил^-лизин, гиппу-рил^-аргининовая кислота, которые при расщеплении
сложноэфирной связи освобождают гиппуровую кислоту, обладающую высокой экстинкцией. Известен также гидрохлорид этилового эфира N-бензоил^-аргинина, который применяется для контроля над антитриптической активностью сыворотки [9]. Основным недостатком данных методов является дефицит субстратов.
Цель работы - исследование совместного действия фосфорорганических соединений и карбаматов на трипсин и холинэстеразу in vitro с использованием индофенилацетата в качестве хромогенного субстрата.
Результаты и обсуждение
При гидролизе индофенилацетата происходит следующая реакция:
.ОуСНз
О
CH3COONa
Индофенолят-ион имеет ярко синюю окраску; максимум поглощения приходится на длину волны 625 нм.
В ходе предварительного исследования записан спектр индофенилацтетата в нейтральной и щелочной средах в ближней УФ- и в видимой областях, представленный на рисунке 1.
Рисунок 1. УФ спектры индофенилацетата в щелочной и нейтральной средах
Концентрацию образующегося в растворе индо-фенолят-иона определяли по градуировочному графику, построенному на основе данных, полученных при измерении оптической плотности растворов с разной концентрацией при 625 нм. По результатам предварительных исследований сделан вывод о соблюдении закона Бугера в диапазоне концентраций 1-10"6 + 910-4 моль/л и получено уравнение, связывающее концентрацию индофенолят-ио-на с оптической плотностью раствора: D = 4598C - 0.03.
Гидролиз индофенилацетата. A priori принимали, что лимитирующая стадия процесса гидролиза является реакцией первого порядка. В принципе это возможно в двух предельных случаях: когда лишь малая часть из реагирующих активных центров в организме взаимодействует с приблизившимся веществом, либо когда количество молекул вещества существенно больше числа активных центров. Первая ситуация часто реализуется при воздействии лекарственных доз на организм. Реализация второй ситуации возможна при испытаниях in vitro, когда измеряются физико-химические характеристики при воздействии веществ на выделенную биомишень.
Для обеспечения постоянства рН среды использовали буферный раствор Михаэлиса [10]. На рисунке 2
О
О
+
представлены кинетические кривые спонтанного и ферментного гидролиза индофенилацетата (ИФА). Обращает на себя внимание значительное, по сравнению с трипсином, ускорение гидролиза АХЭ.
Таблица 1. Константы ферментного гидролиза ИФА в присутствии ингибиторов
Рисунок 2. Кинетические кривые спонтанного и ферментного гидролиза ИФА
Гидролиз в присутствии ингибированных ферментов. Для оценки дезактивации ферментов сравнены скорости гидролиза индофенилацетата в присутствии различных ингибиторов из ряда ФОС и карбаматов.
Ингибитор к, 1/мин Ингибитор к, 1/мин
Гидролиз индофенилацетата в присутствии ингибированной АХЭ
диизопропилметил-фосфонат 0.0229 ^метил-О-этилкарбамат 0.0240
диэтилцианфосфат 0.0163 ^этил-О-этилкарбамат 0.0295
дибутилметил-фосфонат 0.0234 ^циклогексил-О-этилкарбамат 0.0311
диэтилметил-фосфонат 0.0302 ^бензил-О-этилкарбамат 0.0278
диизопропил-цианофосфат 0.0293 ^фенил-О-пентилкарбамат 0.0268
диизопропил-хлорфосфат 0.0287
амитон 0.0220
диэтилфосфит 0.0366
хлорофос 0.0253
Гидролиз индофенилацетата в присутствии ингибированного трипсина
^этил-О-этил-карбамат 0.0358 Диизопропилметил-фосфонат 0.0345
^циклогексил-О-этилкарбамат 0.0327 Диэтилметил-фосфонат 0.0260
^бензил-О-этил-карбамат 0.0462 Диэтилфосфит 0.0389
^фенил-О-пентил-карбамат 0.0197 Амитон 0.0335
^метил-О-этил-карбамат 0.0263 Хлорофос 0.0340
Диэтилцианофосфат 0.0319
Диизопропилхлор-фосфат 0.0222
Диизопропилциано-фосфат 0.0496
Дибутилметил-фосфонат 0.0517
Рисунок 3. Сравнение кинетических кривых гидролиза ИФА в присутствии свободных и ингибированных ферментов
На рисунке 3 показаны кинетические кривые гидролиза ИФА в присутствии АХЭ и трипсина, ингибированных диэтилфосфитом, а в таблице 1 - константы скорости ферментного гидролиза ИФА в присутствии различных ингибиторов.
Следует отметить, что концентрация ингибитора заметно влияет на скорость ферментного гидролиза ИФА. Особенно это относится к малоэффективным ингибиторам, таким например, как диэтилфосфит. В то же время для амитона - сильного ингибитора АХЭ - кинетические кривые практически совпадают (рисунок 4).
Рисунок 4. Влияние концентрации ингибиторов трипсина на скорость ферментного гидролиза ИФА
Полный факторный эксперимент. Для оценки влияния конкретного ингибитора на константу скорости реакции гидролиза индофенилацетата трипсином, а также вероятного проявления синергизма этого влияния проводили полный факторный эксперимент [11].
Для этого приготовили несколько растворов, содержащих ингибиторы, выбранные согласно составленному плану. При составлении плана от натуральных значений факторов (концентраций ингибиторов) переходили к кодированным. Присутствие ингибитора (С = 1.910-5 М) обозначается как «+», а его отсутствие «-» (С = 0).
Задача факторного эксперимента - составление уравнения регрессии вида
где Y = к - функция отклика, то есть константа скорости гидролиза индофенилацетата в присутствии тех или иных ингибиторов, х0 - кодированная переменная и Xi - кодированные значения факторов.
Для учета вероятного проявления синергизма воздействия ингибиторов на трипсин введем переменную хсин: столбец с этой переменной является результатом алгебраического умножения всех прочих столбцов.
Таблица 2. Константы скорости гидролиза ИФА для многофакторного эксперимента
N к в2 N к в2
1 0.0293 7Е-08 9 0.0256 1.754Е-06
2 0.0283 1.583Е-06 10 0.0321 4.633Е-07
3 0.0227 1.17Е-06 11 0.0273 5.203Е-06
4 0.0273 8.94Е-07 12 0.029 6.033Е-07
5 0.0248 4.643Е-06 13 0.0264 6.93Е-07
6 0.0324 1.343Е-06 14 0.0282 4.767Е-08
7 0.0263 1.96Е-06 15 0.0246 1.773Е-06
8 0.0206 5.07Е-06 16 0.0296 2.025Е-06
Расчет дисперсии производится по следующей формуле:
52 =
I (к - к)2
т -1
где т = 5 - число опытов в каждой точке. После этого рассчитывается критерий Кохрена, определяющий однородность дисперсий и, соответственно, воспроизводимость эксперимента:
V2
_ гпах
IV2
G = 0.1776
Полученное значение G сравнивается с табличным Gl-o,o5(fl, f2), где п-1, f2 = N - число опытов (16) при уровне значимости 0.05 [12]. Таким образом, из таблицы, содержащей верхние процентные точки (5 %) для статис-
тики критерия Кохрена выбирается цифра, лежащая на пересечении столбца 1 = 4 и строки f2 = N = 15 (выбирается ближайшая).
Gl-0,05(fl, f2) = 0.2758 > 0.1776.
Следовательно, дисперсии однородны. Воспроизводимость данных может считаться удовлетворительной.
Определили дисперсию воспроизводимости коэффициентов регрессии:
Доверительный интервал:
а = Ь.0,0б(^в|, 0
где ^-0,05(1) - коэффициент Стьюдента, устанавливающий связь между числом измерений и погрешностью; 1 = Цт-1) = 162 = 32.
Из справочника [12] получаем:
Ь-0 05(32) = 2.0360,
а = 0.000689
Заполним таблицу, включающую план многофакторного эксперимента. Первый столбец будет содержать свободный член уравнения регрессии, необходимого для вычисления скорректированного значения константы скорости. Во всех последующих столбцах представлены содержащиеся в растворе вещества (1.910-5 М). Их наличие обозначается знаком «+», отсутствие «-». Для расчета коэффициентов регрессии хи «+» = +1, «-» = -1.
Таблица 3. Многофакторный эксперимент
Номер раствора о диэтилфосфит амитон диизопропилметилфосфонат диэтилметилфосфонат диэтилцианофосфат диизопропилхлорфосфат диизопропилцианофосфат дибутилметилфосфонат хлорофос этилэтилкарбамат метилэтилкарбамат бензилэтилкарбамат циклогексилэтилкарбамат фенилпентилкарбмат X
1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 0.0293
2 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 0.0283
3 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 0.0227
4 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 0.0273
5 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 0.0248
6 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 0.0324
7 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 0.0263
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.0206
9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0.0256
10 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1 0.0321
11 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 0.0273
12 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 0.0290
13 1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 0.0264
14 1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 0.0282
15 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 0.0246
16 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 0.0296
На основе средних значений рассчитанных констант рассчитываются коэффициенты уравнения регрессии:
где к - значение константы, соответствующее определенному опыту; хи - значение кодированной переменной (+1 или -1).
Аналогичным образом рассчитываются все остальные коэффициенты регрессии. Определили значимость коэффициента: должно выполняться условие |Ь| > а. В случае, если < а, то коэффициент принимается равным нулю.
Таким образом, уравнение регрессии приобретает вид:
к расч = 0.0272 - 0.00213X1 + 0.00209x2 + 0.00254хз + 0.00322 Х4 - 0.000880 Х5 - 0.00179 Хе - 0.00110x1 + 0.00325x8 + 0.00173X9 - 0.0009 Х13 + 0.00640 хм - 0.00517 Х15
где ^ = +1 или - 1 в зависимости от ячейки.
Определили расчетное значение констант скорости согласно полученному уравнению. Далее оценивали достоверность рассчитанных констант. Для этого рассчитанная дисперсия экспериментальных и расчетных значений не должна превышать четырехкратного среднего значения дисперсии:
Б2сред = 8,38410-5
красч доп = красч,
Таким образом, оказалось, что наибольшее соответствие между расчетными и экспериментальными данными наблюдается для опытов №№ 3, 6, 10, 11, 13 и 15.
Теперь следует рассчитать корректные значения коэффициентов регрессии. Для этого в матрице планирования оставляются только те строки, которые соответствуют номерам адекватных планов.
Описанным выше способом рассчитываются коэффициенты регрессии, отражающие влияние ингибиторов на скорость гидролиза.
Фактически данные коэффициенты отражают влияние присутствия того или иного ингибитора в растворе на скорость гидролиза и активность трипсина вообще. Свободный член в данной таблице Ьэ = 0.02758 отражает константу скорости гидролиза индофенилацетата в присутствии неингибированного трипсина. Результаты расчетов представлены на гистограмме (рисунок 5).
Данные гистограммы показывают, что из фосфо-рорганических соединений наибольшую ингибирующую способность по отношению к трипсину проявляют амитон, диизопропилметилфосфонат, диизопропилцианофосфат, диизопропилхлорфосфат и хлорофос. Слабыми ингибиторами являются также ^этил-О-этилкарбамат и ^фе-нил-О-пентилкарбамат. Все указанные в таблице соеди-
нения усиливают дезактивацию трипсина и проявляют «резонансный» эффект при ингибировании ферментов.
Экспериментальная часть
Спектры в ближней ультрафиолетовой и видимой областях света записывали на спектрофотометре СФ-26 (диапазон измерений от 250 до 800 нм.). Обработка спектров и биохимических исследований производилась на персональном компьютере с использованием программ MS Excel и MicroCal Origin 8.
Для спектральных экспериментов использовали деионизованную воду, диоксан очищали по методу, описанному в [18].
N-фенил-О-пентилкарбамат. В реактор, снабженный мешалкой, помещали фенилизоцианат. Из капельной воронки небольшими порциями при постоянном перемешивании в колбу прибавляли амиловый спирт. Перемешивание продолжали до начала кристаллизации (25-30 мин). По окончании кристаллизации реакционную массу промывали горячим гексаном и высушивали осадок при температуре не выше 35 °С. Выход целевого продукта составил 95 % от теоретического. Аналогично были получены N-циклогексил-О-этилкарбамат и N-Бензил-О-этилкарбамат, их физико-химические характеристики соответствуют литературным данным.
N-этил-О-этилкарбамат и N-метил-О-этилкарбамат получены путем реакции этилового спирта с метил- и этилизоцианатами. Для получения последних воспользовались известной методикой, основанной на обменной реакции между неорганическими цианатами и соответствующими алкилирующими агентами [13, 14].
Диэтилфосфит и Диэтилцианфосфат синтезировали по известным методикам [15].
Диметил (1-гидрокси-2,2,2-трихлорэтил)фос-фонат (хлорофос) - в настоящей работе использовали стандартный образец (ВНИИХСЗР ГСО 7407-97 98.5 %).
Диалкилметилфосфонаты синтезированы по стандартной методике: заранее приготовленные триал-килфосфиты обрабатывались метилиодидом, взятым в 5-10-кратном избытке, после чего из реакционной массы фракционной перегонкой выделялся целевой компонент [16].
O,O-диэтил-S-диэтиламиноэтилтиофосфат
(амитон).
Первая стадия. В трехгорлую колбу поместили 25 г тиотреххлористого фосфора и 50 мл сухого бензола, раствор охлаждали до 0 °С и через капельную воронку при хорошем перемешивании в течение примерно 1 ч прибавляли к нему приготовленный заранее спиртовый раствор алкоголята натрия. Температуру реакционной массы поддерживали при этом не выше 10 °С. Затем охлаждение прекращали и перемешивали реакционную массу при комнатной температуре еще около 1 ч. Выпавший осадок хлористого натрия отфильтровывали на воронке Бюхне-ра, несколько раз промывали его небольшими порциями (по 10 мл) сухого бензола до получения бесцветного фильтрата. Фильтрат промывали один раз равным объемом воды и высушивали над хлоридом кальция. Растворитель отгоняли в небольшом вакууме, а остаток фракционировали, собирая фракцию 87-90 °С при 14-15 мм рт. ст. Полученный диэтилхлортиофосфат используется на следующей стадии получения целевого продукта.
Вторая стадия. В реакционную колбу помещали 17.6 г диэтилэтаноламина, 150 мл бензола и 2.3 г нарезанного мелкими кусочками металлического натрия. Смесь кипятили на водяной бане до полного растворения натрия, затем при комнатной температуре в течение 30 мин из капельной воронки прибавляли 19 г диэтилхлорти-офосфата. Полученную реакционную массу нагревали на кипящей водяной бане 4 ч. После охлаждения выпавший хлористый натрий отфильтровывали, промывали сухим бензолом (2 раза по 25 мл). От фильтрата отгоняли растворитель при небольшом вакууме и остаток выдержива-
ли на кипящей водяной бане в вакууме (10-20 мм рт. ст.) 2 ч. Кубовый остаток представляет собой тиоловую форму амитона. Выход продукта в виде желтоватого цвета малоподвижной жидкости около 80 %.
Индофенилацетат был синтезирован по методу Крамера [17]. Суть метода заключается в синтезе индо-фенолята натрия и в его дальнейшем ацилировании.
Заключение
Анализ полученных данных кинетического эксперимента и результатов многофакторного эксперимента позволил оценить степень ингибирования трипсина при воздействии нескольких ингибиторов. Кроме того, получено уравнение регрессии, которое дает количественную характеристику влияния каждого из ингибиторов на скорость гидролиза хромогенного субстрата.
Отличие констант спонтанного гидролиза и констант гидролиза индофенилацетата чистыми ферментами доказывает возможность использования данного вещества в качестве хромогенного субстрата для определения степени дезактивации (или, наоборот, каталитической активности) АХЭ и трипсина. Данное свойство может быть использовано для экспресс-оценки активности трипсина и протеаз вообще (например, указанной выше гранулоцитарной эластазы, являющейся звеном первичного иммунного ответа организма человека). Преимуществом индофенилацетата в данном случае можно назвать возможность фиксации изменения окраски в видимом диапазоне спектра (при использовании достаточно больших концентраций субстрата) и использование в качестве реагента только одного соединения в отличие от стандартных индикаторных систем, где требуется использование субстрата и индикатора, меняющего свою окраску в ответ на появление продуктов гидролиза субстрата.
Литература
1. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева Е.Л. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов / Химическая физика. 2003. Т. 22. № 2. С. 21-40.
2. Лошадкин Н.А., Голденков В.А., Дикий В.В. Случаи массовых заболеваний «неясной этиологии»: токсикологические аспекты. Роль малых доз физиологически активных веществ // Рос. хим. журн. 2002. Т. XLVI. № 6. С. 46-57.
3. Бресткин А.П., Годовиков Н.Н. Комбинированный вид ингибирования холинэстераз фосфороргани-ческими соединениями // Успехи химии. 1978. Т. XLVII. С. 1609-1627.
4. Шантроха А.В. [и др.] Анализ продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ гибридными методами // Рос. хим. журн. 2007. Т. LI. № 2. С. 121-126.
5. Nancy B. Munro [et al.].The Sources, Fate, and Toxicity of Chemical Warfare Agent Degradation Products // Environmental Health Perspectives. 1999. Vol. 107 (12). P. 923-973;
6. URL: http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ ehc64.htm#SubSectionNumber:1.1.6
7. Старостина В.К., Дегтева С.А. Холинэстера-за: методы анализа и диагностическое значение. Новосибирск : «Вектор-Бест», 2008. 35 с.
8. Kramer David N. [et al.].A Study of the Physical and Chemical Properties of the Esters of Indophenols // J. Org. Chem. 1959. Vol. 24 (11). Р. 1742-1750;
9. Castro Guillermo R. Enzymatic activities of proteases dissolved in organic solvents // Enzyme and Microbial Technology. 1999. Vol. 25 (8, 9). Р. 689-694;
10. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки М.: Мир, 1976. 364 с.
11. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Оптимизация эксперимента в химии и химической технологии. М. Высш. шк., 1978. 213с.
12. Новицкий П.В., Зограф И.А. Оценка погрешностей результатов измерений. Л.: Энергоатомиздат, 1991. 303 с.
13. Горбатенко В.И. Изоцианаты. Методы синтеза и физико-химические свойства алкил-, арил- и гетерилизо-цианатов: справочник. Киев: Наукова думка, 1987. 445 с.;
14. Саундерс Дж.Х., Фриш К.К. Химия полиуретанов / пер. с англ. под ред. д.х.н. С.Г. Энтелиса. М.: Химия, 1968. 470 с.;
15. Плец В.М. Органические соединения фосфора / под ред. А.Е. Арбузова. М.: ГИОП, 1940. 403 с.
16. Нифантьев Э.Е. Химия элементоорганичес-ких соединений. М., 1980. 85 с.
17. Химические реактивы и препараты (методы получения). Составитель Левина Р.М. Выпуск 2. М.: ГНТИ, 1961. 115 с.
[18] Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир, 1976. 541 с.
