CC BY
36
Биохимия И ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА
И животных
СИНЕРГИЗМ ДЕЙСТВИЯ ТИОРИДАЗИНА И ГАНГЛИОЗИДОВ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯ КРЫСЫ
МОЗГА
В. П. Иванова
Известно, что препараты фенотиазинового ряда широко применяются в психиатрической практике при лечении шизофрении, органических психозах, маниакально-депрессивных состояниях и других заболеваниях. Практика применения этих препаратов показывает, что они обладают токсическими свойствами, вы-
структурными компонентами мембран всех типов клеток млекопитающих, включая нервные клетки, и могут участвовать в регуляции различных клеточных функций, таких, как пролиферация, дифференциация и регенерация [14; 23]. Немало фактов указывает на то, что
U
ганглиозиды оказывают протекторное деи-
зывая ряд побочных эффектов, основными из ствие при окислительном повреждении раз-
которых являются экстрапирамидные расстройства. Общепринятым является мнение о реализации эффекта фенотиазинов через дофаминовые рецепторы. Вместе с тем имеются данные, противоречащие этому утверждению: внутрижелудочковое введение тиорида-зина не оказывает влияния на дофамин-инду-цированную локомоцию и не увеличивает содержания в мозге некоторых метаболитов дофамина [9].
В последнее время изучаются окислительные свойства фенотиазинов. Сообщалось, что фенотиазины увеличивают уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) больных при их длительном приеме [10]. При этом наиболее активный из фенотиазинов ридазин —
тио-
личных типов клеток, например, уменьшая дегенеративные процессы в нейронах, обработанных токсическими дозами глутамата и каината [12]. Сообщалось также о способности некоторых типов ганглиозидов ингибиро-вать накопление конечных продуктов ПОЛ и инактивировать свободные радикалы при окислительном стрессе [5; 16; 21].
Учитывая способность ганглиозидов влиять на свободнорадикальные процессы, в настоящей работе исследовали, с одной стороны, динамику накопления продуктов ПОЛ (ТБК-реактивных продуктов и диеновых коньюга-тов) в синаптосомальной и миелиновой фракциях мозга крысы при введении тиоридазина; с другой — влияние на эти показатели препарата экзогенных ганглиозидов на фоне введе-
вызывает трехкратное увеличе- ния животным тиоридазина.
ние продуктов ПОЛ в миелиновой фракции мозга крысы с одновременным ингибировани-ем активности таких'ферментов, как Ыа+, К+-АТФаза и 5]-нуклеотидаза [18].
Ганглиозиды (гликосфинголипиды, содержащие сиаловые кислоты) являются типичными
Материал и методы.
Эксперименты выполнены на 76 крысах-самцах линии Wistar весом 140 г. Животные были разбиты на три группы. Первой группе вводили тиоридазин (Sigma, США), второй —
© В. П. Иванова, 2008
ганглиозиды совместно с тиоридазином. Тио- стно, что фенотиазины являются липофильны-ридазин вводили внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора в дозе 10 мг / кг в течение 14 дней. Ганглиозиды в дозе 50 мг / кг в том же объеме физиологического раствора вводили внутрибрюшинно четырехкратно: два раза до начала введения тио-ридазина и затем два раза на фоне его введения с интервалом в семь дней. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в том же объеме и по той же схеме.
Синаптосомальные и миелиновые фракции выделяли из мозга крыс по методу [13]. Липи-ды из мембран экстрагировали по методу Фолча [11]. Уровень содержания продуктов ПОЛ определяли спектрофотометрически по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивные продукты), а также по максимуму поглощения при л = 232 нм (диеновые конью-гаты) [15]. Ганглиозиды выделяли из ткани мозга быка по методу Фолча. В опытах использовали очищенную суммарную фракцию ганглиозидов GM1, GDI a, GDlb, GTlb.
Результаты экспериментов обрабатывали статистически по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение.
Из данных, представленных на рисунке, видно, что тиоридазин стимулирует накопление как первичных (диеновые коньюгаты), так и вторичных (малоновый диальдегид (МДА)) продуктов ПОЛ в субклеточных фракциях мозга крысы. При этом в миелиновой фрак-
ции под действием тиоридазина увеличивалось содержание как диеновых коньюгатов, так и МДА, соответственно на 25 % (Р < 0,01) и 185 % (Р < 0,05) по сравнению с
соответствующими контрольными значениями. В то же время в синаптосомах мозга выявлено достоверное увеличение накопления только ТБК-реактивных продуктов. Полученные нами данные не противоречат литературным, согласно которым, как уже отмечалось выше, у больных, длительно принимающих фенотиазины, увеличивается уровень продуктов
ПОЛ в ЦСЖ [10].
ми легкоокисляющимися соединениями, характеризующимися достаточно высокой подвижностью в липидном бислое мембраны. Проникая в липидную фазу, фенотиазины могут окисляться до свободных радикалов, которые, в свою очередь, могут запускать процессы ПОЛ или пролонгировать эти процессы.
Изменение количества ненасыщенных связей в жирнокислотных остатках фосфолипи-дов, происходящее в результате перекисного окисления, может приводить к структурным изменениям фазового состояния липидного бислоя, что не может не влиять на функциональную активность мембранных белков и клетки в целом. Известно, что накопление в мембранах продуктов ПОЛ изменяет физические свойства липидного бислоя, увеличивая его ригидность [7; 8]. Обнаруженное ранее ингибирование тиоридазином активности мембранно-связанных ферментов (Ыа+, К+-АТФазы и б'-нуклеотидазы [18]) может быть обусловлено изменением свойств липидного окружения белковых молекул.
По мнению ряда исследователей, ганглиозиды могут ингибировать процессы ПОЛ, индуцированного внешними стимулами [2]. В связи с этим изучали влияние ганглиозидов на интенсивность процессов ПОЛ в субклеточных фракциях мозга на фоне введения животным тиоридазина. Как видно из рисунка, ганглиозиды не только не предотвращали накопление продуктов ПОЛ (диеновых коньюгатов, МДА), вызванное введением тиоридазина, но, напротив, даже усиливали эти процессы. Особенно заметно увеличивалось содержание диеновых коньюгатов в миелиновой фракции мозга крысы при совместном введении тиоридазина и ганглиозидов по сравнению с мембранами мозга животных, получающих только тиоридазин.
Отсутствие защитного эффекта ганглиозидов, выявленного на модели тиоридазин-инду-цированного накопления продуктов ПОЛ в мембранах миелина и синаптосом мозга, может быть результатом следующих процессов.
Способность фенотиазинов, в том числе и Поскольку молекулы тиоридазина являются
тиоридазина, вызывать окислительную деструкцию миелиновых и синаптосомальных мембран мозга крысы может быть связана с прямым воздействием препаратов на остатки жирных кислот молекул фосфолипидов. Изве-
более компактными и более липофильными, чем молекулы ганглиозидов, они могут проникать в липидный бислой быстрее, чем ганглиозиды; к тому же тиоридазин обладает более высокой • реакционной способностью. Иначе
Серия «Биологические науки»
85
А %
250 -
200 -
150 -
100 -
50 -
0
миелин
1 2
м иелин
синаптосомы
1 2
1 2
синаптосомы
1 2
диеновые коньюгаты
малоновыи ди альдегид
Рисунок
л Действие тиоридазина и ганглиозидов на уровень диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в миелине и синаптосомах мозга крысы
По оси ординат — уровень ПОЛ (в относительных величинах отклонения от контрольных значений). По оси абсцисс — продукты ПОЛ, накапливающиеся в организме животных после инокуляции им тиоридазина (1) или суммарной фракции ганглиозидов совместно с тиоридазином (2) (более подробно см. Материал и методы). * Р < 0,05 ** Р < 0,01 по сравнению с соответствующими
контрольными значениями
говоря, молекулы ганглиозидов не успевают проявить свои «защитные» свойства. С другой стороны, обнаруженный нами синергизм действия тиоридазина и ганглиозидов может быть связан с усиливающим эффектом ганглиозидов на продукцию активных форм кислорода (АФК) клетками микроглии, которые, как известно, обладают выраженной фагоцитарной функцией [5]. АФК, в свою очередь, могут вызывать окислительную деструкцию липидов, что в конечном счете и приводит к еще большей стимуляции процессов ПОЛ при совместном действии тиоридазина и ганглиозидов. Это предположение косвенно подтверждается данными о том, что моносиалоганг-лиозид вМ1 стимулирует образование АФК, индуцированное форбол-12-миристат-13-ацета-том, нейтрофилами человека и перитонеаль-ными макрофагами мыши [4].
Необходимо отметить, что наряду с сообщениями о способности некоторых типов ганглиозидов подавлять образование конечных продуктов (МДА) в ходе индуцированного
ПОЛ имеются факты, свидетельствующие об отсутствии у них этого эффекта. Так, ганглио-зид GM1, согласно одним данным, ингибирует индуцированное ПОЛ [3], согласно другим, не влияет на этот процесс [19]. Кроме того, проявление или отсутствие протекторного действия ганглиозидов зависело не только от типа исследованного ганглиозида, но и от дозы этих липидов, использованных для пре-динкубации с клетками или клеточными мембранами. Например, установлено, что ганглио-зид GD3 при низких концентрациях стимулировал у гладкомышечных клеток аорты генерацию супероксид-аниона, а при высоких дозах ингибировал этот процесс [6]. Ранее нами было показано, что ганглиозиды GM1, GDI а, GDlb и GTlb не препятствовали накоплению продуктов ПОЛ (МДА) в зернистых клетках мозжечка в условиях токсического действия глутамата [1]. Подобную неоднозначность в действии ганглиозидов многие авторы связывают с их свойством к самоагрегации в водных растворах и формированию мицелл, фор-
ма и размеры которых зависят от количества остатков сиаловых кислот и места их связывания с галактозным остатком [17; 20; 22]. Существует мнение, что отрицательный заряд ганглиозидов, обусловленный наличием остатков сиаловых кислот, играет определяющую роль в протекторном действии этих липидов при окислительном стрессе. Предполагается, что ганглиозиды действуют как хелаторы ионов железа или представляют собой ловушки для свободных радикалов [19].
Заключение. Полученные нами данные показывают, что тиоридазин, относящийся к лекарственным препаратам фенотиазинового ряда, вызывает накопление продуктов ПОЛ в синаптосомальных и миелиновых мембранах
мозга крысы. Возможно, токсическое действие тиоридазина при его длительном применении связано с накоплением продуктов ПОЛ в нервной ткани, прямо или опосредованно влияющих на функции клеточной мембраны.
Кроме того, результаты работы еще раз на- \ поминают о необходимости соблюдения осторожности при выборе лекарственных препаратов для одновременного их использования в ходе лечения того или иного заболевания, поскольку вероятность проявления нежелатель-
* %
ного побочного эффекта лекарственного препарата возрастает с увеличением числа фар- | мацевтических средств, принимаемых пациентом одновременно.
БИЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Влияние ганглиозидов на интенсивность процессов перекисного окисления липидов и структурные изменения нейрональной мембраны, вызванные токсическими дозами глутамата / В. П. Иванова, Н. А. Андреева, А. М. Дупин, А. Н. Ерин, И. В. Викторов // Цитология. 2000. № 4. С. 367—371.
2. Ганглиозид-зависимый фактор, ингибирующий перекисное окисление липидов в синаптосомах / Ю. Ю. Тюрина, В. А. Тюрин, Н. Ф. Аврова, В. Е. Каган / / Бюл. эксперим. биол. мед. 1990. № 6. С. 553—555.
3. Защитное действие ганглизидов против нейротоксического эффекта глутамата. Роль свободно-радикальных процессов / Н. Ф. Аврова, И. В. Викторов, В. А. Тюрин, Н. А. Андреева, В. С. Гончар, И. О. Захарова, В. П. Иванова, Ю. Ю. Тюрина, Т. В. Соколова / / Нейрохимия. 1996. № 2. С 103—109.
4. Модуляция сверхмалыми концентрациями ганглиозида GM1 окислительного взрыва в макрофагах мыши и нейтрофилах человека / Н. Ф. Аврова, В. П. Иванова, В. А. Тюрин, И. А. Гамалей, И. В. Клюбин, И. А. Щепеткин, Е. В. Борунов, Ю. Ю. Тюрина / / Бюл. эксперим. биол. мед. 1994. № 1. С. 44—46.
5. Ройтбак А. И. Глия и ее роль в нервной деятельности. / А. И. Ройтбак. СПб. : Наука, 1993. 352с.
6. Bhunia А. К. GD3 recruits reactive oxygen species to induce cell proliferation and apoptosis in human aortic smooth muscle cells / A. K. Bhunia, G. Schwarzmann, S. Chatterjee //J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 19. P. 16396—16402.
7. Chen J. J. Alterations in mitochondrial membrane fluidity by lipid peroxidation products / J. J. Chen, B. P. Yu // Free Radic. Biol. Med. 1994. V. 17, № 5. P. 411—416.
8. Choe M. Lipid peroxidation contributes to age-related membrane rigidity / M. Choe, C. Jackson, B. P. Yu // Free Radic. Biol. Med. 1995. V. 18, № 6. P. 977—984.
9. Effects of thioridazine and its metabolites on dopaminergic function: drug metabolism as a determinant of the antidopaminergic action of thioridazine /С. D. Kilts, D. L. Knight, R. B. Mailman,
E. Widerlov, G. R. Breese //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1984. V.231, № 2. P. 334—342.
10. Evidence of enhanced lipid peroxidation in the cerebrospinal fluid of patients taking phenothiazines / H. S. Pall, A. C. Williams, D. R. Blake, J. Lunec // Lancet. 1987. V. 2, № 8559. P. 596—599.
11. Folch J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues / J. Folch, M. Lees, G. Sloane-Stenley // J. Biol. Chem. 1957. V. 226, № 4. P. 497—509.
12. Gangliosides prevent glutamate and kainate neurotoxicity in primary neuronal cultures of neonatal rat cerebellum and cortex / M. Favaron, H. Manev, H. Alho, M. Bertolino, B. Ferret, A. Guidotti, E. Costa / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85, № 4. P. 7351—7355.
13. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fraction in high purity /
F. Hajos // Brain Res. 1975. V. 93, № 3. P. 485—489.
14. Hakamori S. Gangliosides and glycosphingoli pids as modulators of cell growth, adhesion and transmembrane signaling / S. Hakamori, Y. Igarashi // Adv. Lipid Res. 1993. V. 25, P. 147—162.
ия «Биологические науки»
87
15. Porter N. A. Cyclic peroxides and the thiobarbituric assay / N.A. Porter, J. Nixon, I. Ranidas / / Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 441, № 3. P. 506—512.
16. Reduction of myocardial ischemic reperfusion injury by sialylated glycosphingolipids, gangliosides / N. Maulik, D. K. Das, M. Gogineni, G. A. Cordis, N. Avrova, N. Denisova //J. Cardiovasc. Pharmacol. 1993. V. 22, № LP. 74—81.
17. Schwarzmann G. Uptake and metabolism of exogenous glycosphingolipids by cultured cells /
G. Schwarzmann // Semin. Cell Dev. Biol. 2001. V. 12, № 2. P. 163—171.
18. Thioridazine induces lipid peroxidation in myelin of rat brain / G. S. Dhaunsi, B. Singh, A. K. Singh, D. A. Kirschner, I. Singh // Neuropharmacology. 1993. V. 32, № 2. P. 157—167.
19. Trisialoganglioside GTlb prevents increase in sperm membrane molecular ordering induced by in vitro lipid peroxidation / M. Gavella, M. Kveder,V. Lipovac,R. Rakos,G. Pifat //J. Androl. 2005. V. 26, No 6. P. 724—731.
20. Ulrich-Bett B. Micellar properties of glycosphingolipids in aqueous media / B. Ulrich-Bett,
H. Wiegandt // J. Lipid Res. 1984. V. 25, № 11. P. 1233—1245.
21. Yamamoto H. A. Ganglioside GTlb and melatonin inhibit brain mitochondrial DNA damage and seizures induced by kainic acid in mice / H. A. Yamamoto, P. V. Mochanan // Brain Res. 2003. V. 21,
№ 1. P. 100—106.
22. Yokoyama S. Inhibition effects of gangliosides GM1, GDla and GTlb on base-catalyzed isomerization of prostaglandin A2 / S. Yokoyama, T. Takeda, M. Abe // Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2001. V. 20, № 4. P. 361—368.
23. Zeller С. B. Gangliosides as modulators of cell function / С. B. Zeller, R. B. Marchase // Am. J. Physiol. 1992. V. 262, № 6. P. C1341—C1355.
Поступила 04.02.08.
СОРБЦИЯ СВИНЦА БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ
1 АЛЬБУМИНОМ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
\
t
\
j М. Е. Маркова,
| Е. А. Радецкая,
/
М. А. Боровкова, И. С. Круликовский, В. Т. Демарин,
В. Ф. Урьяш
Как известно, сывороточный альбумин крови животных и человека относится к транспортным белкам [7]. Он также может эффективно взаимодействовать с металлами [6]. Поэтому представляет научный интерес и имеет практическое значение изучение сорбции бычьим сывороточным альбумином (БСА) такого распространенного токсиканта как свинец.
Для исследования процесса сорбции свинца из раствора его соли БСА рспользовали методику, описанную в работах Е. А. Степано-
1 © М. Е. Маркова, Е. А. Радецкая, М. А. Боровкова, И. С. Круликовский, В. Т. Демарин, В. Ф. Урьяш, 2008 '
вой и В. Ф. Урьяша [3-5; 9; 11] и применявшуюся для исследования процесса сорбции свинца и кадмия биологически активными веществами, выделенными из растительного сырья. Она заключается в том, что in vitro создаются условия, моделирующие процессы переваривания пищи в желудке и кишечнике человека. Указанная методика не могла в первоначальном виде применяться для БСА, поэтому необходимо было ее модернизировать. Итак, цель настоящего заключалась в разработке методики приготовления образцов
