CC BY
53
симбиогенетика
УДК 575:576.6.7!
© о. П. онищук,
Н. И. Воробьев, Н. А. Проворов, Б. В. Симаров
Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург, Пушкин
симбиотическая активность ризобии люцерны ^топн^ов/им мешоп) с генетическими модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот
ВВЕДЕНИЕ
у ризобий люцерны (Sinorhizobium meШoti) инактивация генов транспорта дикарбоновых кислот (структурный ген сукцинат-пермеазы dctA и его транскрипционные регуляторы dctBD, nifA, ШгА) приводит к полной или частичной утрате ^-фиксирующей активности, а амплификация данных генов — к ее повышению. В результате этого существенно возрастает накопление в люцерне азота и углерода, однако масса растений увеличивается в меньшей степени, что связано с неполной передачей азота в надземные органы. Факторный анализ показал, что амплификация генов dctABD существенно влияет на эти показатели симбиотической эффективности во всех проведенных опытах, тогда как влияние dctA, nifA и ШгА зависит от сорта растений и условий их вегетации.
' ключевые слова: клубеньковые бактерии; люцерна; симбиотическая азотфиксация; эффективность симбиоза; дикарбоновые кислоты; амплификация генов; факторный анализ.
Поступила в редакцию 24.02.2009 Принята к публикации 25.05.2009
Генетическое улучшение бобово-ризобиального симбиоза требует направленного конструирования штаммов ризобий, обладающих повышенной активностью ^-фиксации и обеспечивающих возрастание продуктивности растений (Sesstich et al., 2002; Rengel, 2002; Симаров и др., 1990). Оно может быть достигнуто путем интенсификации метаболических процессов, лимитирующих фиксацию азота, либо его вовлечения в развитие растений (Тихонович, Проворов, 2007). «Узким местом» биохимической системы симбиоза является обеспечение нитрогеназы энергией, в котором основную роль играет транспорт в бактероиды дикарбоновых кислот (Дк) — сукцината, фумарата и малата, катаболизируемых в цикле Кребса (Sharypova et al., 1992; Fisher, 1994). Этот транспорт контролируется сукцинат-пермеазой DctA, синтез которой зависит от специфичных для гена dctA транскрипционных регуляторов DctBD и от неспецифичных регуляторов NifA и NtrA, вовлеченных также в регуляцию генов нитрогеназы (Jording et al., 1994). У ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) активация транспорта ДК может быть достигнута путем амплификации контролирующих его генов, благодаря которой возрастает нитрогеназная активность бактерий и накопление в растениях азота, однако при этом их масса меняется незначительно (Rastogi et al., 1992; Bosworth et al., 1994; McClung, 2000). В настоящей работе мы показали, что одним из препятствий к ее повышению является неполная передача фиксированного азота в надземные органы, интенсивность которой зависит от генотипа растений. Это препятствие может быть преодолено путем одновременной амплификации генов dctABD, тогда как влияние на симбиотическую активность дополнительных копий генов dctA, ntrA и nifA зависят от сорта люцерны и условий опыта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с модификациями системы транспорта ДК предоставлены А. Пюлером и Т. Энгелке (отдел генетики, Билефельдский университет, Германия). Они включают мутанты со встройками транспозона Tn5 в гены транспорта ДК: RMS37, RMS938 (dctA::Tn5), RMS420, RMS11, RMS31 (dctB::Tn5), RMB5, RMB6 (dctB::Tn5-20), RMD1, RMD2 (dctD::Tn5-20), RMS36 (ntrA::Tn5). Для получения рекомбинантов с дополнительными копиями этих генов использовали интегративные (на основе плазмиды pSUP205) или репликативные (на основе плазмид pWKR6I и pML123) векторы (табл. 1). Рекомбинанты RMS11-121, RMS31-121, RMS938-121 по-
таблица 1
Векторы, использованные для введения генов транспорта дикарбоновых кислот в клубеньковые бактерии люцерны (Sinorhizobium теШоН)
Векторы* Исходные плазмиды или космиды Дополнительные гены Размеры вставок, т. п. н. Маркеры **
pRmSC121 (И) pSUP205 dctABD 40 Tcr
pRmSC121H6 (Р) pWKR6I dctABD 6 Tcr
pRmSC121SH2 (Р) pMLrn dctA 2.1 Gmr
pRmSC102HB4 (И) pSUP205 ntrA З.Б Tcr
pWKR56IHH5 (Р) pWKR6I nifA Б Tcr
* И — интегративные (космидные), Р — репликативные (плазмидные) векторы (Simon et al., 1983; Klipp et al., 1986; Labes et al., 1990). ** Устойчивость к тетрациклину (Tcr) — 5 г/л или к гентамицину (Gmr) — 50 г/л
таблица 2
матрица генетических изменений, полученных у рекомбинантов Sinorhizobium теШоИ при введении дополнительных генов транспорта дикарбоновых кислот в штамм Rm2011
Штаммы Введенные векторы Копийность генов, в баллах *
dctABD dctA nifA ntrA
Rm2011(«дикий тип») отсутствуют 1 1 1 1
2011-121 pRmSC121 З З 1 1
2G11-121H6 pRmSC121H6 4 4 1 1
2011-121SH2 pRmSC121SH2 1 З 1 1
2011-121HB4 pRmSC102HB4 1 1 1 2
2011-121ННБ pWKR56IHH5 1 1 1
2011-121/121SH2 pRmSC121 + pRmSC121SH2 З Б 1 1
2011-H6/SH2 pRmSC121H6 + pRmSC121SH2 4 6 1 1
2011-SH2/HB4 pRmSC121SH2 + pRmSC102HB4 1 З 1 2
2011^Н2/ННБ pRmSC121SH2 + pWKR56IHH5 1 З З 1
* Для каждого гена наличие исходной копии, имевшейся в штамме «дикого типа», оценивали в 1 балл, добавление копии в составе интегративного вектора оценивали в 1 балл, его добавление в составе репликативного вектора — в 3 балла
лучены путем введения вектора pRmSC121 (dctABD) в мутанты RMS11, RMS31, RMS938, соответственно. Генотипы рекомбинантов, полученных при введении дополнительных копий генов транспорта ДК в штамм Rm2011 «дикого типа», указаны в таблице 2 (Engelke et al., 1989; Jording et al., 1992). Ризобии выращивали на твердой агари-зованной (2 %) среде 79 (Федоров, Симаров, 1987).
Семена люцерны изменчивой (Medicago varia, сорт Зайкевича) получены из отдела кормовых культур ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова, семена люцерны посевной (M. sativa, сорт Du Puits) — из отдела генетики Билефельдского университета.
Стерильные микровегетационные опыты проводили, выращивая люцерну в микробиологических пробирках (60 мл) на вермикулите с безазотной средой Красильникова-Кореняко в течение 30 суток до стадии образования 3—4 листьев (Федоров и др., 1986). Эффективность симбиоза определяли по массе растений, а также по содержанию в ней азота и углерода, которые анализировали с помощью элементного анализатора Carlo Erba Analyzer, Model 1106. В стерильных вегетационных опытах люцерну выращивали в стеклянных цилиндрах (850—900 мл) в течение 50 суток
до стадии бутонизации и раннего цветения (вермикулит, питательные среды и бактериальные инокулюмы использовали в 10-кратных, по сравнению с микровегетационны-ми опытами, количествах). Содержание в растениях азота определяли с использованием системы Kjeltec Auto 1030 Analyzer. В обоих типах опытов Nj-фиксирующая активность индуцируется в клубеньках люцерны на 20—22-е сутки, и ее продолжительность в микровегетационных опытах составляла 8—10 суток, в вегетационном опыте 28—30 суток. Для статистической обработки данных использовали методы дисперсионного и корреляционного анализа, а также t-критерий Стьюдента (Лакин, 1980).
Уровень влияния амплификации генов dctABD, dctA, nifA, ntrA на показатели симбиотической эффективности определяли с помощью многомерной статистики — факторного анализа (Дубров и др., 1998). При этом вычисляли факторные нагрузки для Min-вектора в многомерном пространстве, координатные оси которого характеризуют количества копий генов транспорта ДК (матрица дана в таблице 2), а также параметры эффективности симбиоза — массу растений, содержание в них азота и углерода (направление Min-вектора в многомерном пространстве соответству-
таблица 3
Симбиотическая эффективность штаммов Sinorhizobium теШоИ с модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот (микровегетационный опыт № 1 с люцерной сорта Du Puits)
Штаммы Генотипы штаммов (их азотфиксирующая активность)1 М Азот в надземной части растений Углерод в надземной части растений
N% N б общ отклонение от штамма Rm2011, %2 С% Собщ отклонение от штамма Rm2011, %2
Rm2011 Дикий тип (Fix+) 20,8 2,91 605 0 36,5 7,6 0
RMS11 - dctB (Fix+/-) 20,4 2,75 561 - 7,3 36,1 7,4 - 2,6
RMS31 - dctB (Fix+/-) 14,2 2,57 365 - 39,7* 34,8 4,9 - 35,5*
RMS37 — dctA (Fix-) 13,7 0,94 129 - 78,7* 34,4 4,7 - 38,2*
RMS938 — dctA (Fix-) 14,8 0,95 141 * ,7 СО 7 - 35,1 5,2 - 31,6*
RMS36 - ntrA (Fix-) 13,5 0,87 117 - 80,7* 34,0 4,6 - 39,5*
RMS420 - dctA (Fix-) 17,2 0,74 127 - 79,1* 36,5 6,3 - 17,1*
RMS-B5 - dctB (Fix+/-) 14,3 2,15 307 - 49,3* 39,8 5,6 - 26,3*
RMS-B6 - dctB (Fix+/-) 14,2 2,29 325 - 46,3* 37,2 5,3 * ,3 о° 3 -
RMS-D1 - dctD (Fix+/-) 17,5 2,85 499 - 17,5* 38,3 6,7 - 11,8
RMS-D2 - dctD (Fix+/-) 17,6 2,61 459 - 24,1* 36,5 6,4 - 15,6*
RMS11-121 + dctABD - dctB (Fix+) 18,3 3,02 553 - 8,6 33,9 6,2 - 18,4*
RMS31-121 + dctABD - dctB (Fix+> 15,7 2,31 362 - 40,2* 39,1 6,1 - 19,7*
RMS938-121 + dctABD - dctA (Fix+) 20,4 2,56 522 - 13,7 37,6 7,7 + 1,3
2011-121 + dctABD (Fix+) 21,3 4,48 954 + 57,7* 50,0 10,7 + 40,8*
2011-121H6 + dctABD (Fix+) 20,4 4,40 898 + 48,4* 50,6 10,3 + 35,5*
2011-121SH2 + dctA (Fix+) 19,3 3,95 762 + 26,0* 47,9 9,2 + 21,1*
2011-121HB4 + ntrA (Fix+) 19,2 4,59 900 + 48,8* 49,7 9,5 + 25,0*
2011-121HH5 + nifA (Fix+) 24,2 3,00 726 + 20,0* 46,2 11,2 + 47,4*
2011-121/121SH2 + dctABDA (Fix+) 21,3 3,64 775 + 28,1* 45,2 9,6 + 26,3*
2011-H6/SH2 + dctABDA (Fix+) 19,8 3,68 729 + 20,5* 48,8 9,7 + 27,6*
2011-SH2/HB4 + dctA + ntrA (Fix+) 21,8 3,58 780 + 28,9* 47,4 10,4 + 36,8*
2011-SH2/HH5 + dctA + nifA (Fix+) 20,9 3,39 709 + 17,2* 47,4 9,9 + 30,3*
Контроль Без инокуляции 12,2 1,50 183 - 69,8* 45,2 5,5 - 27,6*
M — сухая масса надземной части растений (мг/пробирку), N% — концентрация азота, Чобщ — накопление азота (мкг/пробирку), С% — концентрация углерода, Собщ — накопление углерода (мг/пробирку). 1 — Знак « + » перед обозначениями генов показывает присутствие дополнительных копий, знак « — » — инактивацию генов в результате Тп5-мутаций. Нитрогеназная активность (измеренная с помощью ацетиленового метода; Hardy et al., 1968): Fix+ — соответствует уровню родительского штамма; Fix+/- — снижена по сравнению с родительским штаммом (P0 < 0,05); Fix- — отсутствует. 2 — Отклонения, отмеченные звездочками, статистически значимы (величины НСР0 05 составили: для M — 2,55 мг/пробирку, для Чоб1„ — 96,5 мкг/пробирку, для Собщ — 1,06 мг/пробирку)
ет минимальной дисперсии проекций на него параметров эффективности симбиоза). Абсолютные значения факторных нагрузок (вычисляемых как значения косинусов углов между Мт-вектором и осью, характеризующей число копий одного из генов) находятся в диапазоне 0...1 (чем выше эти значения, тем более значимо влияние амплификации гена, рассчитанное на одну дополнительную копию).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В микровегетационном опыте (мВо) № 1 была изучена активность симбиоза с люцерной (сорт Du Ри^) для
трех групп штаммов: 1) 10 Тп5-мутантов по генам транспорта ДК (dctABD, пігЛ); 2) 9 рекомбинантов, полученных при введении дополнительных копий генов dctABD, dctA, ш/А, пМ в штамм «дикого типа» Нт2011; 3) 3 рекомбинантов, полученных при введении генов dctABD в мутанты по генам dctA или dctB. Результаты опыта показали (табл. 3), что мутанты по генам транспорта ДК обладали либо полной утратой симбиотической эффективности (инсерции Тп5 в гены dctA или п^А), либо ее резким снижением (инсерции Тп5 в гены dctB или dctD), что согласуется с ранее опубликованными данными (Engelke et а1., 1989; Логі^ et аі., 1992, 1994).
Таблица 4
Продуктивность и элементный состав различных сортов люцерны при взаимодействии со штаммами Sinorhizobium теШоН, несущими дополнительные копии генов транспорта дикарбоновых кислот (микровегетационный опыт № 2)
Признаки 1 Надземная часть Корни
Сорт Зайкевича Сорт Du Puits Сорт Зайкевича Сорт Du Puits
Отклонения (%) при инокуляции штаммом Яш2011 по сравнению с контролем
МИ + 31,4* + 36,0* - 41,9* - 61,6*
N% + 63,6* + 69,1* - 5,2 + 70,5*
+ 115,2* + 130,0* - 45,5* - 35,5*
С% - 7,7 - 9,7 - 31,9* + 17,8*
Сб общ + 23,4* + 23,3* - 60,0* - 54,4*
Отклонения (%) при сравнении рекомбинантов с родительским штаммом Яш2011
МИ + 9,5* + 15,3* - 8,5 + 54,3*
N% + 1,5 - 5,5 + 33,7* + 2,3
N«*„ + 10,9* + 8,7 + 23,6* + 57,5*
С% - 7,4 - 0,5 + 19,0* - 2,4
Сб общ + 1,3 + 14,2* + 9,0 + 53,6*
Абсолютные значения массы растений (мг на пробирку)
МК 10,5 10,0 8,7 11,2
МИ (Rm2011) 13,8 13,6 5,1 4,3
1 МИ — масса инокулированных растений, МК — масса контрольных (не инокулированных) растений (К%, Мобщ, С%, Собщ : см. табл. 3). * Отклонения статистически значимы (Р0 < 0,05)
У рекомбинантов, полученных путем введения дополнительных копий генов транспорта ДК в штамм «дикого типа» (Нш2011), наблюдали повышение эффективности симбиоза с люцерной (табл. 3). Оно наиболее четко проявлялось при анализе общего накопления азота (средняя прибавка по группе из 9 рекомбинантов +32,8 %) и углерода (средняя прибавка +32,3 %), тогда как масса растений достоверно повышалась по сравнению с родителем Нш2011 только при инокуляции штаммом 2011 — 121НН5 (на 16,4 %). Рекомбинанты, полученные при введении генов dctABD в Тп5-мутанты по dct-генам, обладали такой же, либо сниженной, по сравнению со штаммом «дикого типа» симбиотической активностью, хотя по сравнению с мутантами-реципиентами введенных генов наблюдали ее достоверное повышение.
Более детальное изучение рекомбинантов, полученных при введении генов транспорта ДК в штамм «дикого типа», было проведено на двух неродственных сортах люцерны: Зайкевича (Medicago иапа) и Du Ри^ (М. sativa), для которых в МВО № 2 влияние инокуляции на массу и элементный (С/^ состав определяли раздельно для корней и надземной части. Оказалось (табл. 4), что при образовании эффективного симбиоза (достоверные прибавки при инокуляции штаммом Нш2011 по сравнению со стерильным контролем) у обоих сортов люцерны возрастает надземная масса, а также
накопление в ней азота и углерода. Однако в надземной части концентрация повышалась только для азота, что может быть связано с интенсивным оттоком углерода в клубеньки. Для обоих сортов наблюдали снижение массы корней, причем у сорта Du Ри^ удельное содержание в них азота резко возрастало, а у сорта Зайкевича — не изменялось. Очевидно, что при образовании эффективного симбиоза растения сорта Зайкевича полностью передают фиксированный азот в надземную часть, тогда как у сорта Du Ри^ значительная часть азота остается в корнях, что повышает концентрацию в них углерода (у сорта Зайкевича она снижается).
При повышении эффективности симбиоза, связанном с активацией сукцинат-пермеазной системы (сравнение рекомбинантов с исходным штаммом Нш2011), у обоих сортов возрастает масса надземной части растений и накопление в ней азота. Однако это повышение невелико и сопровождается накоплением дополнительно фиксируемого азота в корнях (31 % от его количества у сорта Зайкевича, 62 % — у сорта Du Ри^). У сорта Du Ри^ при этом возрастает масса корней, что требует затрат углерода, ограничивающих развитие надземной части растений.
Корреляционный анализ показал (табл. 5), что в МВО № 1 масса инокулированных растений тесно связана с общим накоплением и концентрациями в них азота
Таблица 5
коэффициенты корреляции, полученные при сопоставлении симбиотических признаков люцерны, инокулированной генетически модифицированными штаммами Sinorhizobium теШоН в микровегетационных опытах (мВо)
Сопоставляемые признаки (обозначены как в табл. 3) МВО № 1 (сорт Эи РиНэ, надземная часть) MBO № 2
Целые растения Надземная часть Корни
сорт Зайкевича сорт Du Puits сорт Зайкевича сорт Du Puits сорт Зайкевича сорт Du Puits
М — N % + 0,71** 0 - 0,37 - 0,31 - 0,20 + 0,15 - 0,11
М — С % + 0,68** - 0,18 - 0,21 - 0,29 - 0,17 + 0,06 + 0,08
М — N б обш + 0,84** + 0,65* + 0,90*** + 0,57 + 0,81** + 0,85** + 0,98***
М — Сб обш + 0,92*** + 0,75** + 0,95*** + 0,66* + 0,85** + 0,90*** + 0,99***
№% — С % + 0,83** + 0,94*** + 0,91*** + 0,93*** + 0,92*** + 0,95*** + 0,52
N б — С б обш обш + 0,92*** + 0,96*** + 0,84** + 0,94*** + 0,97*** + 0,99*** + 0,98***
Уровни значимости коэффициентов корреляции: * — Р0 < 0,05; ** — Р0 < 0,01; *** — Р0 < 0,001
Таблица 6
Симбиотическая активность штаммов Sinorhizobium теШой, содержащих дополнительные копии генов транспорта дикарбоновых кислот, в стерильном вегетационном опыте на люцерне сорта Du Puits
Штаммы M N % N б обш
2011-121 63,9 1,95 1246*
2011-121Н6 89,7* 1,90 1704*
2011-12^Н2 76,9 2,23 1714*
2011-121/12^Н2 * СО 8 2,47 2062*
2011-НбДН2 63,0 2,13 1342*
2011-121НВ4 * <n" 8 2,03 1669*
2011^Н2/НВ4 61,5 2,55 1568*
2011-121НН5 55,6 2,01 1118*
2011^Н2/НН5 59,4 2,44 1449*
Ят2011 («дикий тип») 59,9 1,52 910
Контроль без инокуляции 32,5 0,97 315
Надземная масса растений, М указана в г/сосуд; общее накопление в ней азота, ^бщ — в мг/сосуд (*превышение над штаммом Ят2011 достоверно; величины НСР0 05 составили: для М — 20,24 г/сосуд, для ^бш — 200,2 мг/сосуд)
и углерода, которые также коррелируют между собой. В МВО № 2 корреляции массы растений с концентрациями в них азота и углерода отсутствуют, хотя корреляции между другими признаками остаются высокими. Это различие может быть связано с тем, что в МВО № 2 между штаммами отсутствовали контрастные различия по симбиотическим признакам, что увеличивало вклад случайных факторов в их варьирование.
Повышенная симбиотическая активность рекомбинантов с дополнительными копиями генов транспорта ДК была подтверждена в вегетационном опыте (Во), где люцерна сорта Du РиНэ развивалась в течение 50 суток (табл. 6). В этом опыте, как и в МВО, масса надземной части растений возрастала в меньшей степени, чем удельное содержание и общее накопление в ней азота. Однако в ВО прибавки по этим признакам были значительно выше, чем в МВО (рис. 1), что может быть связа-
но с гораздо большей продолжительностью симбиотической азотфиксации.
Использование метода факторного анализа показало (табл. 7), что в МВО № 1 и № 2 с сортом Du Рийэ совместная амплификация структурного гена сукцинат-пермеазы dctA и специфичных для него регуляторов dctBD демонстрирует наибольший уровень влияния на параметры симбиотической эффективности (о чем говорят высокие величины факторной нагрузки для dctABD), по сравнению с отдельной амплификацией гена dctA или его неспецифичных регуляторов nifA и ШгА. В ВО с сортом Du РиНэ факторные нагрузки для генов dctA и dctABD одинаково высоки, а для неспецифичных регуляторов nifA и они ниже, чем в МВО. В МВО № 2 с сортом Зайкевича уровни влияния генов транспорта ДК на эффективность симбиоза оказались такими же, как в ВО с сортом Du Рийэ.
Таблица 7
уровни влияния амплификации генов транспорта дикарбоновых кислот на показатели эффективности симбиоза Sinorhizobium теШой с разными сортами люцерны
Гены Bеличины факторных нагрузок*
сорт Du Puits сорт Зайкевича
MBO № 1 MBO № 2 BO MBO № 2
dctABD 0,72а 0,65а 0,63а 0,65а
dctA 0,39b 0,38b 0,65а 0,58а
nifA 0,29b 0,34b 0,17c 0,21c
ntrA 0,32b 0,32b 0,17c 0,20c
* Величины факторных нагрузок характеризуют уровень влияния одной дополнительной копии гена, введенной в бактерии, на признаки симбиотической эффективности (значения, отмеченные разными буквами, достоверно различаются как в пределах одного опыта, так для одного и того же гена в разных опытах)
Рис. 1. Симбиотическая активность рекомбинантов
Sinorhizobium теШой, полученных при введении дополнительных генов транспорта дикарбоновых кислот в штамм Ят2011
ОБСУЖДЕНИЕ
Повышение эффективности симбиотической азотфиксации требует оптимизации метаболических микробно-растительных отношений, для которых характерно образование интегрированной системы азотно-углеродного обмена партнеров (Проворов, Долгих, 2006). Узким местом в функционировании этой системы является снабжение бактероидов энергетическими субстратами, которые поступают от хозяина в форме ДК посредством бактериальной
сукцинат-пермеазы DctA, синтез которой активируется специфичными (DctBD) и неспецифичными (NifA, NtrA) транскрипционными регуляторами (Jording et al., 1994). Ранее было показано, что повышение активности сукцинат-пермеазы, связанное с амплификацией генов транспорта ДК, увеличивает азотфик-сирующую активность ризобий и накопление азота в растениях, однако возрастание их массы весьма ограничено (Rastogi et al., 1992; Bosworth et al., 1994; McClung, 2000). В данной работе мы показали, что причиной этого ограничения может быть низкая активность передачи продуктов азотфиксации из корней в надземную часть растений (табл. 4).
Ранее при анализе полиморфизма клубеньковых бактерий и бобовых растений было установлено, что нитро-геназная активность клубеньков зависит в равной степени от генотипов партнеров, тогда как эффективность симбиоза определяется главным образом генотипом хозяина (Проворов, Симаров, 1992). Результаты настоящей работы показали, что решающая роль генотипов хозяина в определении эффективности симбиоза может быть связана с их варьированием по активности передачи азота из корней в надземную часть. При сравнении двух сортов люцерны (Зайкевича — Medicago varia и Du Puits — M. sativa) по массе и азотнакоплению достоверные корреляции между этими показателями наблюдаются только для надземной части (г = +0,61... +0,87; P0 = 0,01—0,05), однако для корней такая связь отсутствует. По-видимому, генетические различия сортов по симбиотической активности определяются особенностями биохимических процессов, происходящих в корнях (образование транспортных форм азота или их перенос из клеток ^-фиксирующей зоны клубенька в проводящие пучки).
Представленные нами данные показывают, что повышение азотфиксирующей активности ризобий может вызывать рост продуктивности растений только тогда,
когда оно сопряжено со стимуляцией фотосинтеза, благодаря чему в симбиосистеме поддерживается оптимальный баланс азота и углерода (Bethlenfalvay et al., 1978; Streeter, 1995). B исследованной нами генетической системе причиной усиления фотосинтеза может быть также ускоренное поглошение ДК бактероидами, связанное с активизацией их сукцинат-пермеазной системы. Bbira-кие коэффициенты корреляции между количествами в растениях азота и углерода (+0,84... +0,99), а также их концентрациями (+0,52. +0,95) указывают на то, что при образовании эффективного симбиоза между партнерами устанавливаются положительные обратные связи, основанные на обмене продуктами азотфиксации и фотосинтеза.
Продолжение работ по конструированию высокоактивных штаммов ризобий требует количественной характеристики эффектов амплификации генов транспорта ДК на проявление симбиотической эффективности. Факторный анализ полученных данных показал, что в наиболее благоприятных для симбиоза условиях (вегетационный опыт с сортом Du Puits, где продолжительность азотфиксации составила 28-30 суток) эффекты амплификации генов dctA и dctABD одинаково высоки: уровни их влияния в 3,7-3,8 раза выше, чем для неспецифичных транскрипционных регуляторов nifA и ntrA. B менее благоприятных условиях (микровегетационный опыт с сортом Du Puits, где продолжительность азотфиксации 8-10 суток) эффекты амплификации сохраняются для dctABD, но снижаются для dctA и повышаются для nifA и ntrA. Можно предположить, что в неблагоприятных для симбиоза условиях азотфиксация лимитирована активацией синтеза сукцинат-пермеазы DctA, осушествляемой на уровне транскрипции структурного гена различными типами регуляторов. B благоприятных же условиях азотфиксируюшая активность бактероидов ограничена интенсивностью работы уже сформировавшейся перме-азной системы, в связи с чем для повышения этой активности достаточно амплификации только гена dctA. Эти предположения подтверждаются результатами испытания штаммов на растениях сорта Зайкевича, который менее ограничен в усвоении фиксированного азота, чем сорт Du Puits: факторные нагрузки для изученных генов в микровегетационном опыте для сорта Зайкевича такие же, как в вегетационном опыте для сорта Du Puits (табл. 7).
Таким образом, симбиотическая эффективность штаммов, обладаюших повышенной активностью транспорта ДК, зависит от генотипа не только самих бактерий, но и растений-хозяев, а также от условий их вегетации. Очевидно, что наибольшая эффективность симбиоза может быть достигнута при создании комплементарных сочетаний генотипов партнеров, при которых высокая азотфиксируюшая активность бактерий сочетается со способностью растений адекватно использовать дополнительный азот для своего развития.
Авторы признательны А. Пюлеру, Т. Энгелке и Д. Джординг (отдел генетики Билефельдского университета, Германия) за предоставление штаммов Sinorhizobium meliloti с генетическими модификациями системы транспорта ДК и за обсуждение результатов их изучения. Работа поддержана РФФИ (грант 09-04-00907а).
Литература
1. Дубров А. М., Мхитарян В. С., Трошин Л. И., 1998. Многомерные статистические методы. Финансы и статистика. Москва. 352 с.
2. Лакин Г. Ф., 1980. Биометрия. Высшая школа. Москва. 293 с.
3. Проворов Н. А., Долгих Е. А., 2006. Метаболическая интеграция организмов в системах симбиоза // Журн. общ. биологии. Т. 67. № 6. C. 403—422.
4. Проворов Н. А., Симаров Б. В., 1992. Генетический полиморфизм бобовых культур по способности к симбиозу с клубеньковыми бактериями // Генетика. Т. 28. № 6. C. 5-14.
5. Симаров Б. В., Аронштам А. А., Новикова Н. И., Проворов Н. А., Баженова О. В., Шарыпова Л. А., 1990. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий. Л.: Агропромиздат. 192 с.
6. Тихонович И. А., Проворов Н. А., 2007. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем // Успехи соврем. биол. Т. 127. № 4. С. 339-357.
7. Федоров С. Н., Симаров Б. В., 1987. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizobium meliloti под действием УФ-лучей // С.-х. биология. № 9. С. 44-49.
8. Федоров С. Н., Фокина И. Г., Симаров Б. В., 1986. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) в лабораторных условиях // С.-х. биология. № 1. С. 112-118.
9. Bethlenfalvay G. I., Abu-Shakra S. S., Phillips D. A., 1978. Interdependence of nitrogen nutrition and photosynthesis in Pisum sativum L. II. Host plant response to nitrogen fixation by Rhizobium strains // Plant Physiol. Vol. 62. P. 131-133.
10.Bosworth A. H., Williams M. K., Albrecht K. A. et al., 1994. Alfalfa yield response to inoculation with the recombinant strains of Rhizobium meliloti with an extra copy of dctABD and/or modified nifA expression // Appl. Environ. Microbiol. Vol. 60. N 10. P. 3815-3832.
11.Engelke T., JordingD., Kapp D., PuhlerA., 1989. Identification and sequence analysis of the Rhizobium meliloti dctA gene encoding the C4-dicarboxylate carrier // J. Bacteriol. Vol. 171. P. 5551-5560.
12. Fisher H. M., 1994. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia // Microbiol. Rev. Vol. 58. P 352-386.
13.Hardy R. W. F., Holsten R. D., Jackson E., Burns R. S., 1968. C2H2—C2H4 assay for N2-fixation: laboratory and field evaluation // Plant Physiol. Vol. 43 (Suppl.). P. 9-13.
14.Jording D., Sharma P. K., Schmidt R., Engelke T., Uhde C., Puhler A., 1992. Regulatory aspects of the C4-dicarboxylate transport in Rhizobium meliloti: transcriptional activation and dependence on effective symbiosis // J. Plant Physiol. Vol. 141. P. 18-27.
15. Jording D., Uhde C., Schmidt R., Puhler A., 1994. The C4-dicarboxylate transport system of Rhizobium me-liloti and its role in nitrogen fixation during symbiosis with alfalfa (Medicago sativa) // Experientia. Vol. 5. N 10. P. 874-883.
16.Klipp W., Masepohl B., Puhler A., 1986. Identification and mapping of nitrogen fixation genes of Rhodobacter capsulatus: duplication of nifA-nifB region // J. Bacte-riol. Vol. 170. P. 693-699.
17.Labes M., Puhler A., Simon R., 1990. A new family of RSF1010-derived expression of lac-fusion broad-host-range vectors for gram-negative bacteria // Gene. Vol. 89. P. 37-46.
18.McClung G., 2000. Commercialization of a genetically modified symbiotic nitrogen fixer, Sinorhizobium me-liloti // Mitt. Biol. Bundesanst. Land Forstwirtsch. Vol. 380. P. 100-106.
19.Rastogi V., Labes M., Finan T., Watson R., 1992. Over-expression of the dctA gene in Rhizobium meli-loti: effect on transport of C4 dicarboxylates and symbiotic nitrogen fixation // Canad. J. Microbiol. Vol. 38. P. 555-562.
20. Rengel Z., 2002. Breeding for better symbiosis // Plant and Soil. Vol. 245. P. 147-162.
21. Sessitsch A., Howieson J. G., Perret X., Antoun H., Martinez-Romero E., 2002. Advances in Rhizobium research // Crit. Rev. Plant Sci. Vol. 21. P. 323—378.
22. Sharypova L. A., Pretorius-Guth I.-M, Simarov B. V., Puhler A., 1992. Genetic improvement of Rhizobium strains // The Nitrogen Fixation and its Research in China / Ed. Hong G. F. Springer-Verlag. Berlin. P. 266-285.
23. Simon R, Priefer U., Puhler A., 1983. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria // Biotechnol. Vol. 1. P. 784-791.
24. Streeter J. G., 1995. Integration of plant and microbial metabolism in nitrogen fixing systems // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications / Eds. Tikhonovich
I. A., Provorov N. A., Romanov V. I., Newton W. E. Klu-wer Acad. Publ. Dordrecht, Boston, London. P. 67-76.
Symbiotic activity of the alfalfa rhizobia (Sinorhizobium meliloti) strains with the genetically modified transport of dicarboxylic acids
O. P. Onishchuk, N. I. Vorobyov, N. A. Provorov, B. V. Simarov
' SuMMARY: Inactivation of genes involved in the dicarbyxylic acid transport in alfalfa rhizobia, Sinorhizobium meliloti (structural gene of succinate permease dctA and its transcriptional regulators dctBD, nifA, ntrA) resulted in the full or partial loss of N2-fixing activity while amplifications of these genes — in its improvement. It lead to the marked increases of N and C accumulation in alfalfa while its shoot mass was increased by a much lesser degree due to the incomplete N translocation from the roots. Factorial analysis suggested that dctABD amplification was important for improving the symbiotic efficiency in all trials while the effects of dctA, nifA and ntrA amplifications depend on the plant genotypes and growth conditions.
' key woRDS: nodule bacteria; alfalfa; symbiotic nitrogen fixation; efficiency of symbiosis; dicarboxylic acids; gene amplification; factorial analysis.
' Информация об авторах
Онищук Ольга Петровна — к. б. н., старший научный сотрудник. Государственное научное учреждение Bсероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии.
Шоссе Подбельского, д. 3, Санкт-Петербург, Пушкин-8, 196608. E-mail: olony@yandex.ru
Воробьев Школай Иванович — к. техн. н., руководитель группы биоинформатики и математического моделирования. Государственное научное учреждение Bсероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии. Шоссе Подбельского, д. 3, Санкт-Петербург, Пушкин-8, 196608. E-mail: provorov@newmail.ru
Проворов Школай Александрович — к. б. н., старший научный сотрудник. Государственное научное учреждение Bсероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии. Шоссе Подбельского, д. 3, Санкт-Петербург, Пушкин-8, 196608. E-mail: provorov@newmail.ru
Cuмаров Борис Васильевич — д. б. н., заведуюший лабораторией. Государственное научное учреждение Bсероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии. Шоссе Подбельского, д. 3, Санкт-Петербург, Пушкин-8, 196608. E-mail: genet@yandex.ru
Onishuk Olga Petrovna — Candidate of Biological Sciences. Russia Research Institute for Agricultural Microbiology,
Podbelsky Chaussee 3, St. Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia E-mail: olony@yandex.ru
Vorobyov Nikolay Ivanovich — Candidate of Technical Sciences, Head of the Group of Bioinformatics and Mathematical Simulation.
Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelsky Chaussee 3, St. Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia.
E-mail: provorov@newmail.ru
Provorov Nikolay Alexandrovich — Candidate of Biological Sciences. Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelsky Chaussee 3, St. Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia.
E-mail: provorov@newmail.ru
Simarov Boris Vasilievieh — Doctor of Biological Sciences, Head of the Laboratory. Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Podbelsky Chaussee 3, St. Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia E-mail: genet@yandex.ru
