CC BY
122
УДК 633:11:632.4:582.288
Штаммы Bacillus subtilis, ингибирующие развитие токсиногенных грибов на зерне пшеницы
О.А. МОНАСТЫРСКИЙ, Е.В. КУЗНЕЦОВА, Н.Н. АЛЯБЬЕВА
e-mail: [email protected]
С началом XXI века в мире интенсифицировались исследования по поиску и отбору биоагентов - микроорганизмов и их метаболитов для создания на их основе защитных препаратов - как ответ на прогрессирующее поражение сельскохозяйственных культур токсино-образующими видами фитопато-генных плесневых грибов.
Особую тревогу вызывает поражение зерна злаковых культур в колосе и при хранении токсинообра-зующими штаммами видов рр. Fu-sarium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Mucor. Зараженное растение расходует на процессы де-токсикации до 40 % всех энергетических затрат. Отобранные и включенные в рецептуры биопрепаратов биоагенты успешно конкурируют с целевой патогенной микрофлорой, угнетая ее развитие, и де-токсицируют патогенные метаболиты. Однако со временем промышленные биоагенты теряют свою защитную активность, и необходимо отбирать и вводить в рецептуры новые штаммы. Предыдущие исследования показывают, что наиболее агрессивные в отношении плесневых грибов штаммы выделяются из природных популяций.
Природными антагонистами экономически значимых токсино-образующих видов грибов, особенно фузариев, поражающих зерно злаковых растений, являют-
ся бактерии семейств Pseudo-monaceae и Bacillaceae [7].
Микробиологические препараты, полученные на основе этих видов, защищают растения пшеницы от фузариоза колоса и накопления в зерне дезоксиниваленола [4, 5, 6]. У бактерий рода Pseudomonas с повышенным эффектом защиты от грибных фитопатогенов отмечена высокая способность ксинтезу антигрибных метаболитов: эк-зоферментов и антибиотиков.
Испытание широкого спектра видов бактерий других семейств позволило выявить обладающих высокой антигрибной активностью, например, из рр. Enterobacter и Mycobacterium. Биопрепараты, основанные на живых культурах Arthrobacter и Azotobacter, внесенные с семенами, существенно уменьшали колонизацию корней кукурузы F. verticillioides и подавляли у него синтез фумони-зина В1 [7].
На основе штаммов этого вида были созданы защитные биопрепараты Бацелл*, Моноспорин*, Алирин-Б и Гамаир, обладающие способностью вырабатывать по-лиеновые антибиотики, органические кислоты, гидролитические ферменты, подавляющие развитие фитопатогенных грибов и бактерий. Наиболее широкое научно-производственное применение в качестве основы защитных биопрепаратов получили бациллы Bacillus subtilis.
* Препарат в России не зарегистрирован.
В наших исследованиях, помимо идентификации эффективных in vitro штаммов этой бактерии-антагониста, в полевых условиях на искусственном инфекционном фоне изучалась их способность подавлять развитие фузариоза колоса (ФК) и накопление в урожае фуза-риотоксинов. Исследовалось влияние обработок растений биопрепаратами на основе бацилл на иммунный статус растений пшеницы. В частности, определялся уровень накопления фунгистатических веществ, а также активность ферментов фенольного обмена растительной клетки, поскольку они играют важную роль в формировании иммунного ответа растений пшеницы на внедрение патогенных грибов.
Спорообразующие микроорганизмы выделяли из образцов растений пшеницы и злаковых сорных растений залежей, отобранных в северной зоне Краснодарского края. Образцы (20 г) отбирали на посевах пшеницы в хозяйствах с низким уровнем развития ФК.
Смывы с поверхности надземной части растений центрифугировали при 6000 об/мин с последующей пастеризацией при 70 °С в течение 1 мин. Осадки ресуспенди-ровали в физиологическом растворе и высевали на МПА (г/л: пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; агар - 15). Среду инкубировали в термостате 18-24 ч (t = 28 °С), микроорганизмы окрашивали по Граму и микроскопиро-вали при увеличении х900. Колонии отвивали на скошенный агар. Грамположительные микроорганизмы, образующие эндоспоры, использовали в дальнейшей работе. Биохимические свойства для целей идентификации изучали у микроорганизмов, проявляющих антагонистическую активность в отношении Fusarium graminearum.
Способность к гидролизу крахмала и гиппурата, а также подвижность оценивали в аэробных условиях [2].
Из отобранных образцов растений выделено 284 штамма подвижных спорообразующих микроорганизмов, отнесенных нами к р. Bacillus.
Скрининг этих штаммов позволил выявить 19 культур, антагонистических в отношении F. grami-nearum. Их культуральные и биохимические свойства в целях идентификации были изучены более подробно. Необходимо отметить, что все культуры бацилл с антагонистическими свойствами в отношении возбудителя ФК были выделены из филлоплана озимой пшеницы. На плотных питательных средах все без исключения бактерии образовывали желтоватые R-колонии, осуществляли гидролиз крахмала, но не гиппурата, что позволило отнести их к виду B. subtilis.
Антагонистические свойства выделенных микроорганизмов оценивали, помещая диски фильтровальной бумаги (d = 5 мм), пропитанной суточной культуральной жидкостью тестируемого микроорганизма, на среду Чапека, предварительно засеянную гомогена-том мицелия F. graminearum. Зоны задержки роста гриба (в мм) измеряли через 36-72 ч инкубации пластин в термостате при 28 °С. Эффективность препаратов на основе вновь выделенных микроорганизмов оценивали на растениях пшеницы сорта Батько на рандомизированных делянках в 5-кратной повторности.
Микробиопрепараты представляли собой культуральную жидкость 48-часовой культуры тестируемого микроорганизма (штаммы B. subtilis 94, 105, 118, 139), которую перед нанесением на расте-
ние разводили 1:100. Для иноку-лирования колосьев пшеницы суспензией конидий использовали 7-10-суточные культуры гриба Г. дга-т'твагит, выращенного на карто-фельно-глюкозном агаре. Плотность суспензий конидий определяли в камере Горяева. Она составляла 1,1 х108 спор/мл.
В период цветения пшеницы колосья обрабатывали микробиопрепаратами, а через 4 ч заражали суспензией конидий Г. дгат'твагит. При этом инфекционная нагрузка составляла 1,5х107спор/колос. Инокуляцию пшеницы проводили в вечернее время в безветренную погоду под выпавшую росу. Иноку-лированные колосья по 10-15 шт. изолировали полиэтиленовыми изоляторами на 24 ч для создания влажной камеры. Учет интенсивности их поражения проводили на 26-е сутки после инокуляции по шкале СЭВ [1]. Определение содержания трихотеценов проводили на 45-е сутки после инокуляции на спектрофлуориметре фирмы Хитачи под ультрафиолетом, сравнивая их со стандартными растворами ДОН.
В качестве эталона был взят штамм В. виШНв, полученный из коллекции Института промышленных микроорганизмов.
Антагонистическая активность в отношении фитопатогенного гриба была выявлена только у четырех штаммов В. ви^Шв - 94, 105, 139,
Влияние обработок препаратами I
фузариоза колоса (%) и накоплен
118 (зоны задержки составили соответственно 36, 34, 33 и 32 мм, у эталонного штамма - 24 мм).
В опытах на вегетирующих растениях развитие болезни и накопление ДОН в урожае растений, обработанных биопрепаратами на основе штаммов B. subtilis 94, 105, 118, 139, отличались от варианта, в котором использовали эталонный штамм B. subtilis ИПМ 215 (табл. 1).
Степень поражения колоса оценивали на 9-е сутки после инокуляции растений. Развитие фузарио-за колоса в зависимости от штамма B. subtilis варьировало от 56 до 75 % (в необработанном контроле - 82 %). Штаммы 118 и 139 сдерживали развитие болезни на уровне эталона. Обработка микробиопрепаратами на основе штаммов 94, 105 и 118 снижала накопление токсина на 23-36 % по отношению к контролю.
Для определения уровня накопления фунгитоксичных соединений аналитические пробы отбирали рандомизированно, срезая колосья с прилегающей частью стебля (~10 см) на 2; 14 и 26-е сутки после заражения.
Навеску(10 г)растительного материала измельчали, гомогенизировали и получали сухой экстракт соединений. Хроматографические пластины пропитывали карто-фельно-глюкозной средой, опрыскивали суспензией мицелия F. gra-
Таблица 1 аммов Bacillus subtilis на развитие фунгитоксичных веществ и ДОН
Штамм Поражение колоса (%) Фунгитоксичные вещества (% к контролю) Содержание ДОН (мг/кг)
ИПМ 215 (эталон) 69 107 6,4±1,2
94 56 115 5,8±0,7
105 60 118 5,2±1,1
118 72 102 5,9± 1,0
139 75 104 6,2±0,8
Контроль (без обработок) 82 100 8,1±1,2
Доверительный интервал при Р = 0,95
Таблица 2
Влияние обработок препаратами штаммов Bacillus subtilis на активность ферментов фенольного обмена растений пшеницы сорта Батько
Активность белка (мкг/мг)
3-глюкозидаза ß-галактозидаза фенилаланинаммиаклиаза
ИПМ 215 (эталон) 32,5±3,4 15,7± 1,8 306,5±16,9
94 37,3±3,8 15,2±1,4 327,9±18,1
105 35,2±2,7 16,4±1,5 315,6±16,4
118 29,2±4,5 11,3±1,8 212,8±16,7
139 29,4±4,8 14,2±3,7 299,1±18,3
Контроль (без обработок) 28,7±2,5 10,8±1,2 233,6±10,8
Доверительный интервал при Р = 0,95
minearum, затем инкубировали во влажной камере в течение 4 суток при 28 °С. Поверхность пластины зарастала серо-малиновым налетом мицелия гриба. Места нанесения фунгитоксичных соединений не зарастали или зарастали в меньшей степени. Площадь зон ингибирования роста гриба, по величине которой судили о фунги-токсичной активности вещества, оценивали в квадратных сантиметрах.
Для определения активности ферментов фенольного обмена биологические пробы, состоящие из колоса и прилегающей части стебля, отбирали на вторые сутки после заражения и выделяли из них белки. Концентрацию белков определяли по методу Лоури. Полученный белковый раствор использовали в качестве источника ферментной активности. Активность р-глюкозидазы и р-галакто-зидазы оценивали по способности белкового препарата расщеплять пара-нитрофенольное производное соответствующего глико-зида. Реакцию вели при 37 °С и рН среды 5,0 в течение 15-30 мин.
Оценивали также активность фермента фенилаланинаммиак-лиазы, выделенной из гомогенизированного растительного материала.
Инкубационная смесь (3 мл) содержала 10 мг белка и 25 мкМ L-фенилаланина. Инкубацию вели
2 ч при 37 °С. Образование коричной кислоты регистрировали фо-тометрированием опытного варианта при 270 нм.
Полученные данные по фунги-токсичной активности растительных образцов и активности ферментов фенольного обмена после обработки растений пшеницы сорта Батько бактериальными препаратами представлены в таблице 2.
Из них следует, что лишь два выделенных штамма B. subtШs - 94 и 105 - могут быть использованы для получения микробиопрепаратов, сдерживающих развитие ФК. Препараты на их основе повышали активность ферментов фенольного обмена р-глюкозидаз, р-га-лактозидаз и фенилаланинамми-аклиазы на 30, 50 и 40 % соответственно и способствовали накоплению фунгитоксичных соединений.
Изучение механизмов воздействия бактерий на клетки защищаемых растений и гифы гриба позволит сделать эти средства защиты высокоэффективными. Работы в этом направлении нами проводятся. В частности, установлено, что синтезируемые бациллами фунгитоксичные соединения проникают внутрь клеток растений и гиф грибов, но не в зерно, что позволяет использовать их для защиты от фузариоза хранящегося зерна пшеницы.
ЛИТЕРАТУРА
1. БабаянцЛ. и др. Методы селекции и оценки устойчивости пшеницы и ячменя к болезням в странах - членах СЭВ. -Одесса-Прага, 1988, с. 208-221.
2. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. - М.: Мир, 1980, 495 с.
3. Методические указания по микологическому исследованию фузариозного зерна пшеницы. - М.: ВНИИВСГЭ, 1989, стр. 64.
4. Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. - Л.: Колос, 1970, 204 с.
5. Сидоров И.А. и др. Факторы устойчивости растений к фузариозу колоса // Защита и карантин растений, 2001, № 11, с. 16-17.
6. Сидоров И.А. и др. Влияние сиде-рофорпродуцирующих псевдомонад на развитие грибных болезней озимой пшеницы / Тезисы докл. 2-й Всероссийской научн.-практ. конф. «Агротехнический метод в защите растений от вредных организмов», Краснодар, 2002, с. 113-114.
7. Khan N.I. et al. Field testing of antagonists of Fusarium head blight incited by Gibberella zeae // Biological Control, 2004, № 3, р. 245-255.
Аннотация. Природные популяции Bacillus subtilis, выделенные с филло-плана растений пшеницы, содержат штаммы, обладающие высокой защитной активностью против фузариоза колоса и хранящегося зерна пшеницы. На их основе созданы защитные биопрепараты.
Ключевые слова. Растения пшеницы, филлоплан, бациллы, фунгистатич-ная и фунгицидная активность, фузари-оз колоса, биопрепараты, защита, ферменты фенольного обмена.
Abstract. Natural populations of Bacillus subtilis, isolated from phylloplane of wheat plants contain strains with high protective activity against Fusarium head blight of wheat and wheat stored grain. Protective biological preparations have been developed on their bases.
Keywords. Wheat plants, phylloplane, bacilli, fungistatic and fungicide activity, Fusarium head blight, biopreparations, protection, enzymes of phenol exchange.
Всероссийский НИИ биологической защиты растений
