CC BY
89
DOI:10.24411/0235-2451-2018-10309 УДК 632.3 635.21
ШИРОКОМАСШТАБНЫЙ СКРИНИНГ РНК-И ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ПАТОГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ПОМОЩИ ПЦР В МАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ*
П.А. ФРАНЦУЗОВ1, кандидат биологических наук, биохимик-исследователь (e-mail: frantsuzov@ genbitgroup.com)
М.М. НИКИТИН1, кандидат биологических наук, ведущий инженер-исследователь
А.М. МАЛЬКО2, доктор сельскохозяйственных наук, директор
A.В. ЖИВЫХ2, кандидат сельскохозяйственных наук, директор департамента
Н.В. СТАЦЮК3, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
B.Г. ДЖАВАХИЯ3, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
А.Г. ГОЛИКОВ1, доктор химических наук, зам. директора
1ООО «ГенБит», пр. Научный, 20, стр. 2, Москва, 117246, Российская Федерация
2Российский сельскохозяйственный центр, Орликов пер., 1/11, стр. 1, Москва, 107139, Российская Федерация
3Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, ул. Институт, вл. 5, р.п. Большие Вяземы, Одинцовский р-н, Московская обл., 143050, Российская Федерация
Резюме. Информация о фитосанитарном состоянии посадок картофеля в РФ, как правило, ограничена сведениями по отдельным патогенам или регионам. В работе оценивали потенциал применения ПЦР/ОТ-ПЦР микроматриц для одновременной диагностики вирусных, вироидных, бактериальных и оомицетных патогенов картофеля для массового скрининга возбудителей болезней. Исследование выполняли в 2015-2017 гг. на базе региональных филиалов Россельхозцентра по Калининградской, Ленинградской, Тверской, Московской, Костромской, Нижегородской, Самарской и Иркутской областям, Ставропольскому и Краснодарскому краям, а также Республике Татарстан с использованием микрочипового амплификатора AriaDNA и совместимых с ним микроматриц. Сбор образцов проводили по стандартной методике. Уровень инфицированности РНК-вирусами по результатам анализа листьев картофеля (n=580) составил 28,8 % с преобладанием вирусов PVS, PVY и PVM (соответственно 46,2, 45,7, и 34,7% отобщего числа инфицированных образцов). Уровень смешанных вирусных инфекций был равен 12,9 % (n=75) от общего количества образцов. В большинстве случаев такие инфекции представлены комбинацией двух вирусов (73,3 % от общего количества смешанных инфекций), прочие образцы были инфицированы сразу тремя или четырьмя вирусами (16,0 и 10,7 %, соответственно). В составе смешанных инфекций преобладали PVY, PVM и PVS. Среди образцов клубней (n=456) выявлено 19,1 % инфицированных ДНК-содержащими патогенами, в основном Phytophtora infestans, Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, P. atrosepticum (соответственно 35,6, 28,9, 18,9 и 13,3 % от общего числа инфицированных образцов). Смешанные бактериальные инфекции выявлены в 1 образце из Московской области (P. carotovorum subsp. carotovorum + P. atrosepticum) и 2 из Костромской (C. michiganensis subsp. sepedonicus + P. carotovorum subsp. carotovorum). Протестированный метод показал себя простым и информативным инструментом контроля фитосанитарной ситуации в отношении наиболее экономически значимых болезней картофеля.
Ключевые слова: ПЦР в реальном времени, матричный формат, вирусные патогены картофеля, бактериальные патогены картофеля, скрининг, фитосанитарный мониторинг. Для цитирования: Широкомасштабный скрининг РНК- и ДНК-содержащих патогенов картофеля при помощи ПЦР в матричном формате / П.А. Французов, М.М. Никитин, А.М. Малько и др. //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 3. С. 45-49. 001:10.24411/0235-2451-2018-10309.
Картофель - одна из основных сельскохозяйственных культур в России, ключевая с точки зрения обеспечения продовольственной безопасности. Ежегодные объемы его производства в нашей стране достигают 31-34 млн т, однако средняя урожайность этой культуры невысока и составляет 14-15 т/га [1]. Поскольку размножение семенного картофеля, как правило, осуществляется вегетативно, серьезную угрозу его качеству представляют патогены. Общие потери урожая, связанные с прямым воздействием вирусных и бактериальных патогенов, достигают 7 % и 14 % соответственно [2]. Использование резистентных сортов, незараженного семенного материала, грамотное и своевременное применение защитных препаратов, а также быстрых и точных методов контроля позволяют ограничить распространение патогенов и, следовательно, потери урожая.
Как правило, методы первичного контроля и мониторинга патогенов картофеля основываются на выявлении симптомов заболевания (изменение формы или окраски листьев, появление гнилей и др.), а также выделении и идентификации патогена (микроскопирование, фито-патологическое исследование). Такие методы требуют значительных затрат времени и не всегда обеспечивают необходимую точность. Кроме того, при их использовании заболевание практически всегда обнаруживается после распространения на значительной площади посевов, то есть они фактически малоприменимы для ранней диагностики или скрытой инфекции.
Широко распространенные сейчас лабораторные методы основаны на выявлении специфических биологических маркерных молекул фитопатогенов - белков (иммунологические методы) или нуклеиновых кислот (по-лимеразная цепная реакция - ПЦР, в том числе изотермическая амплификация). Количество анализов, проводимых во всем мире с использованием таких методов, как им-муноферментный анализ (ИФА) и ПЦР, достигает 10 млн в год [3]. Однако их применение требует значительных временных затрат, связанных с необходимостью доставки отобранных образцов в диагностическую лабораторию, накоплением определенного пула проб для постановки анализа и доведением результатов до производителя. При этом очень часто от отбора образцов до получения конечного результата проходит много времени, что затягивает сроки принятия решения о методах борьбы с выявленной инфекцией и снижает их эффективность.
Упомянутого недостатка лишены тест-системы на основе метода иммунохроматографии, позволяющие
*Исследование выполнено при частичной поддержке Российского Научного Фонда (разработка и валидация тест-систем для патогенов, проект № 16-16-04109).
проводить анализ непосредственно в поле буквально в течение 10-15 мин., причем без использования специального оборудования. Однако они обладают низкой, по сравнению с ПЦР, чувствительностью и специфичностью по отношению к некоторым грибным и бактериальным патогенам [4] и в большинстве случаев коммерчески доступны только в формате «один тест - один патоген»
[5]. Такие особенности иммунохроматографического метода не позволяют адаптировать его для быстрого и надежного анализа на присутствие спектра целевых патогенов и их комбинаций.
Изотермическая амплификация (LAMP) - еще один метод диагностики, позволяющий провести анализ быстро, с довольно высокой чувствительностью и с использованием относительно несложного оборудования, пригодного для применения в полевых лабораториях
[6]. Однако, несмотря на то, что тест-системы на основе LAMP разработаны для широкого спектра фитопатогенов, они также имеют ряд существенных недостатков: высокий риск контаминации, сложность дизайна требуемых праймеров и невозможность одновременной детекции нескольких патогенов в рамках одного анализа.
Таким образом, сейчас не существует коммерчески доступных тест-систем, позволяющих проводить высокоточную мультиплексную диагностику широкого спектра фитопатогенов вне стационарных лабораторий. Эту проблему можно решить путем разработки диагностических систем на основе ПЦР/ОТ-ПЦР-матриц с открытыми микрореакторами. Такая система включает в себя портативный амплификатор нуклеиновых кислот «AriaDNA» и совместимые с ним микроматрицы, содержащие 30 или 48 ячеек для проведения независимых ПЦР. Важная особенность ПЦР-матриц - нанесение в ячейки всех компонентов ПЦР-смеси (включая ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу) с последующей их лиофилизацией уже на этапе производства, что значительно упрощает процедуру проведения анализа [7]. Кроме того, ПЦР-матрицы обладают открытой конфигурацией, то есть существует возможность формирования набора тест-систем в их составе в соответствии с конкретной целью работы или пожеланиями заказчика.
Цель исследования - оценка потенциала применения разработанных в ООО «ГенБит» ПЦР/ОТ-ПЦР микроматриц для диагностики вирусных, вироидных, бактериальных и оомицетных патогенов картофеля для массового скрининга возбудителей болезней картофеля.
Условия, материалы и методы. Исследование проводили в 2015-2017 гг. на базе 11 региональных филиалов ФГБУ «Россельхозцентр» по Калининградской, Ленинградской, Тверской, Московской, Костромской, Нижегородской, Самарской и Иркутской областям, Ставропольскому и Краснодарскому краям и Республике Татарстан. Образцы картофеля (зеленая масса или клубни для анализа на содержание РНК- и ДНК-патогенов соответственно) отбирали сотрудники филиалов «Рос-сельхозцентра» согласно стандартным рекомендациям [8]. Общее количество проанализированных образцов зеленой массы составило 580 шт., клубней - 456 шт. Анализы проводили в лабораториях соответствующих региональных филиалов «Россельхозцентра», за исключением образцов из Краснодарского края, которые исследовали в лаборатории филиала по Московской области. На начальных стадиях испытаний результаты, полученные с использованием ПЦР-матриц, сравнивали с результатами традиционных методов исследования (ИФА, иммунохроматография, микробиологические методы). Поскольку при таком сопоставлении не было
выявлено ложноотрицательных и ложноположительных результатов, далее контроль результатов ПЦР-анализа с помощью традиционных методов вели методом случайной выборки.
Для проведения исследования использовали апли-фикатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени «AriaDNA» (ООО «Люмэкс-Маркетинг», Россия) и совместимые с ним ПЦР-матрицы, разработанные совместно ООО «ГенБит» и Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии [9]:
Конфигурация ПЦР-матриц «Фитопатогены картофеля. ДНК», предназначенных для детекции Phytophthora infestans, Pectobacterium atrosepticum, P. carotovorum БиЬвр. carotovorum, Dickeya dianthicola, D. solani, Clavibacter michiganensis БиЬвр. sepedonicus и Ralstonia solanacearum, предполагает возможность одновременного анализа трех образцов на присутствие всех перечисленных патогенов.
ОТ-ПЦР-матрицы «Фитопатогены картофеля. РНК» предназначены для детекции следующих вирусов и ви-роидов картофеля: Y (ординарная РУУ° и некротическая РУУ™ формы), X (РУХ), А (РУА), Б (РУБ), М (РУМ), скру-чиваемости листьев ^ЯУ), метельчатости верхушки (РМТУ), вироида веретеновидности клубней картофеля (РБТУс1). Этап обратной транскрипции предшествовал ПЦР и осуществлялся в том же самом реакционном объеме (микрореакторе). Конфигурация этих ПЦР-матриц предполагает возможность одновременного анализа двух образцов на присутствие всех перечисленных патогенов.
Выделение и очистку нуклеиновых кислот из растительной ткани проводили с использованием наборов реактивов «Амплипрайм ДНК-сорб В» (ДНК) и «Ампли-прайм Рибо-СОРБ» (РНК) в соответствии с рекомендациями производителя (ООО «НекстБио», Россия). Образцы очищенных нуклеиновых кислот хранили при температуре -20 °С, размораживая непосредственно перед использованием. Перед нанесением образца в ячейки, матрицу устанавливали в держателе и покрывали ее поверхность герметизирующей жидкостью (минеральное масло) в объеме 620 мкл. Образцы выделенной ДНК или РНК смешивали с 10 %-ным концентратом буферного раствора, входящего в комплектацию ПЦР-матриц, в соотношении 1:9. Для отрицательных и положительных контрольных образцов вместо препарата нуклеиновой кислоты использовали деионизованную воду. По 1,2 мкл полученных образцов вносили в ячейки под слой герметизирующей жидкости в соответствии с конфигурацией используемой матрицы.
ПЦР-анализ проводили в следующем режиме: первичная денатурация (120 с, 94 °С) и 45 циклов ПЦР (денатурация - 5 с, 94 °С, отжиг и элонгация - 25 с, 60 °С). В случае РНК-содержащих патогенов, программа анализа предусматривала предварительный этап обратной транскрипции (20 мин., 37 °С), проводимый в том же реакционном объеме перед началом ПЦР. Измерение интенсивности флуоресценции осуществляли в автоматическом режиме в конце каждой стадии отжига/ элонгации. Флуоресцентный сигнал в микрореакторах, содержащих тест-системы, специфичные для РБТУС, РУУ°, РУБ, РМТУ, РУА, Clavibacter michiganensis БиЬвр. sepedonicus, P. atrosepticum, P. carotovorum БиЬвр. carotovorum и D. solani, регистрировали по каналу 1 ^АМ); в микрореакторах, содержащих тест-системы, специфичные для PLRV, PУYntn, РУХ, P. infestans, D. dianthicola, R. solanacearum и внутреннего контрольного образца - по каналу 2 (ЯОХ). Регистрацию флуорес-
PSTVd PVM 0,7%
Рис. 1. Частота выявления бактериальных/оомицетных патогенов картофеля в проанализированных образцах: Rs - Ralstonia solanacearum, Pa - Pectobacterium atrosepticum: Pcc - Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum, Cms - Clavibactermichiganensis subsp sepedonicus; Pi - Phytophthora infestans, Ds - Dickeya solani.
центного сигнала, подсчет значения пороговых циклов и анализ результатов осуществляли автоматически с помощью программного обеспечения «AriaDNA» (ООО «Люмэкс-Маркетинг», Россия).
Результат анализа по каждому из патогенов считали положительным при одновременном соблюдении следующих условий:
значение порогового цикла для соответствующего положительного контрольного образца и внутреннего контрольного образца не превышало 35;
для соответствующего отрицательного контрольного образца флуоресцентный сигнал не превышал порогового уровня;
значение порогового цикла для исследуемого образца в соответствующем микрореакторе не превышало 35.
Результаты и обсуждение. ДНК-содержащие патогены картофеля. Наиболее часто выявляли два ДНК-содержащих патогена - P. infestans - 35,6 % всех зараженных образцов, или 7,0 % от общего числа проб и C. michiganensis subsp. sepedonicus - 28,9 %, или 5,3 % соответственно (рис.
1, табл. 1). В то же время бактерии рода Dickeya (D. Solani) обнаружили только в одном образце из Костромской области, возбудитель D. dianthicola - не найден.
Таблица 1. Встречаемость бактериальных/оомицетных патогенов картофеля в инфицированных образцах
и Иркутской областях (5 и 4 патогена соответственно). Наибольшее количество инфицированных образцов было выявлено в Тверской и Ленинградской областях и Республике Татарстан (53,9; 52,9 и 50,0 % соответственно от общего количества проанализированных образцов), наименьшее - в Нижегородской области (8,5 %, только P. infestans).
Смешанные бактериальные инфекции выявлены лишь в трех образцах - одном из Московской области (Я carotovorum subsp. carotovorum + P. atrosepticum) и двух из Костромской (C. michiganensis subsp. sepedonicus + P. carotovorum subsp. carotovorum).
РНК-содержащие патогены картофеля. Наиболее часто выявляемыми оказались вирусы PVS - 46,2 % всех инфицированных образцов, или 6,7 % от общего числа проб, PVYo - 45,7 %, или 4,7 % соответственно (рис. 2, табл. 2). PLRV и РМ^ были обнаружены только в двух образцах каждый (1,2 % от общего числа инфицированных проб), причем исключительно в составе смешанных инфекций.
PVA
0,2% PVX ~0,3%
Смешанные инфекции 12,9%
Рис.
разцах.
2. Частота выявления вирусных патогенов картофеля в проанализированных об-
Бактериальный патоген
Phytophthora infestans Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
Pectobacterium atrosepticum Ralstonia solanacearum Dickeya solani
Dickeya dianthicola_
Доля образцов, %
35,6 28,9
18,9 13,3 2,2 1,1 0
Наибольшую географическую распространенность имели Р^0 (9 регионов), PVS (8 регионов) и PVM (9 регионов). Самое большое разнообразие вирусных патогенов было отмечено в Нижегородской (6 вирусов и PSTVd), Иркутской (6 вирусов, включая две формы PVY, и PSTVd) и Ленинградской (6 вирусов, включая две формы PVY) областях. Наибольший уровень зараженности вирусными патогенами (более 50 % образцов) был зарегистрирован в шести регионах (Тверская, Нижегородская, Ленинградская, Иркутская, Самарская области и Республика
Таблица 2. Встречаемость вирусных патогенов картофеля в инфицированных образцах
Наиболее широкое географическое распространение имел P. carotovorum subsp. сarotovorum (7 из 10 обследованных регионов). Самое высокое разнообразие ДНК-содержащих патогенов наблюдали в Костромской
Вирусный патоген Доля образцов, % Вирусный патоген Доля образцов, %
PVS 46,2 PVA 6,4
PVYO 45,7 PSTVd 2,9
PVM 34,7 PLRV 1,2
PVYntn 12,1 PMTV 1,2
PVX 8,7
Татарстан). Основной вклад в уровень заражения в этих регионах вносили вирусы PVYo (Ленинградская, Тверская, Нижегородская области и Республика Татарстан), PVS (Иркутская, Самарская области и Республика Татарстан) и PVM (Нижегородская и Тверская области). Наименьший уровень вирусной инфекции наблюдали в Калининградской области и Краснодарском крае (3,1 % и 5,3 % проанализированных образцов соответственно).
Поскольку ПЦР-матрицы обеспечивают возможность одновременной детекции нескольких патогенов, их использование позволяет выявлять смешанную инфекцию. Если в случае с ДНК-содержащими патогенами были выявлены лишь единичные образцы со смешанными бактериальными инфекциями, то в отношении вирусных инфекций число таких проб достигло 12,9 %. Наиболее часто встречавшимися комбинациями вирусов были + PVS и PVM + PVS (22,7 и 17,3 % от общего количества образцов со смешанной вирусной инфекцией соответственно). В основном смешанные вирусные инфекции были представлены комбинацией двух разных вирусов (73,3 %); комбинации трех и четырех вирусов были обнаружены в 16,0 и 10,7 % случаев соответственно. В составе смешанных инфекций чаще всего присутствовали РУ/°, PVM и PVS, реже всего - PLRV, РМ^ и PSTVd (табл. 3).
Таблица 3. Представленность вирусных и виро-идных патогенов картофеля в образцах со смешанной вирусной инфекцией (п=75)
Патоген Доля образцов, % Патоген Доля образцов, %
РУУ0 69,3 РУА 14,7
РУМ 57,3 PLRУ 2,7
РУБ 54,7 РМТУ 2,7
РУХ 17,3 РБТУС 1,3
руушп 17,3
Контроль болезней картофеля требует применения методов, обеспечивающих постоянный мониторинг фи-тосанитарной ситуации в регионах интереса. Особенно важна возможность его осуществления в странах, имеющих большую площадь и располагающихся в нескольких климатических зонах. Своевременное выявление и идентификация картофельных патогенов дает возможность с одной стороны принимать оперативные меры по борьбе с их распространением и минимизировать потери урожая, с другой - увеличивать эффективность контроля за распространением и накоплением возбудителей в семенном материале. С этой точки зрения эффективными видятся мероприятия по скринингу сетевой структурой, включающей региональные лаборатории, имеющие средства и возможности ПЦР-диагностики по единому стандарту. Реализация контроля и мониторинга в таком формате даст возможность стандартизовать условия проведения анализов и централизованно собирать и анализировать поступающую информацию.
Сейчас в литературе отсутствуют сведения по систематическому мониторингу основных заболеваний картофеля в России, что связано с использованием в регионах преимущественно трудоемких визуальных и микробиологических методов исследований и сложностью идентификации некоторых патогенов (особенно вирусной природы). Появление и внедрение в широкую практику более современных диагностических методов (ИФА, им-мунохроматография, ПЦР) не привело к принципиальным изменениям. Большинство появляющихся публикаций посвящено либо мониторингу отдельных патогенов или их групп, либо исследованию фитосанитарного состояния
картофельных посадок в каком-либо отдельном регионе. Для некоторых патогенов последние имеющиеся сведения устарели на 15-20 лет. Например, масштабный мониторинг PSTVd в России проводили в 1990-е годы [10]. Комплексные исследования вирусных инфекций в последние годы осуществляли в северо-западных регионах России [11], Астраханской области [12] и Дальнем Востоке [13]. Обширный скрининг вирусных заболеваний картофеля при помощи иммунохроматографических методов проводит ФГБУ «Россельхозцентр»: в 2013 г. исследование включало диагностику РУГ[14], а в 2014 г. - РУГ и PVX [15].
Наши результаты не противоречат ранее опубликованным сведениям о доминировании РУ/°, PVS и PVM в части регионов европейской части России, полученным разными исследователями в разные годы [11, 12, 15]. Однако, в отличие от указанных авторов, использованная унифицированная методика скрининга с использованием ОТ-ПЦР матриц позволила получить информацию по гораздо более широкому спектру вирусов, а также уникальные данные по частоте смешанных вирусных инфекций и их составу.
Количество публикаций, посвященных бактериальным патогенам картофеля и их распространению в России, также сравнительно невелико. В основном они описывают возбудителей черной ножки и мягкой гнили картофеля (01аквуа ер., Р. carotovorum, Р. аКовврИоит). Так, анализ 430 пораженных бактериозами образцов картофеля, собранных в 2008-2010 гг. в различных регионах России, выявил присутствие О. dianthiаola и О. во!ап1 в среднем в 3,6 % случаев [16]. Повторное исследование в 2013 г. показало увеличение уровня зараженности этими патогенами до 4-36 % в зависимости от региона. Также была опубликована информация о значительном (до 23-50 %) уровне об-семененности семенного картофеля С. miаhiganвnвiв БиЬвр. ввpвdoniаuв в южных регионах России [17]. Однако поскольку эти результаты основаны на анализе исключительно образцов клубней с видимыми признаками поражения болезнетворными микроорганизмами (то есть из выборки были изначально исключены здоровые образцы), они не позволяют судить о распространенности перечисленных патогенов.
По нашим данным, встречаемость патогенов рода 0iаkвya в исследованных регионах в целом весьма невысока (единственный образец), как и встречаемость С. miаhiganвnвiв БиЬвр. ввpвdoniаuв (5,3 % от общего количества образцов); при этом следует отметить, что встречаемость последнего патогена в выборке образцов с выявленной инфекцией составляет 27,7 %, что вполне согласуется с данными ранее упомянутых авторов. Кроме того, наше исследование подтверждает сведения об относительно широком распространении в регионах России С. miаhiganвnвiв БиЬвр. ввpвdoniаuв, Р. atroввptiаum и Р. аarotovorum БиЬвр. аarotovorum [16, 17].
Выводы. Выполненная работа представляет собой первое масштабное скрининговое исследование широкого спектра патогенов картофеля в ряде российских регионов, проведенное с использованием стандартизованного метода ПЦР в реальном времени в матричном формате. Анализ более тысячи образцов позволил получить подробную информацию о фитосанитарной ситуации в конкретных регионах, распространенности 17 исследованных патогенов в различных географических зонах и - впервые - о присутствующих на полях смешанных вирусных и бактериальных инфекциях (12,9 и 0,7 % соответственно). Выявлены доминирующие РНК-патогены - PVS, РУГо, PVM (соответственно 46,2,
45,7 и 34,7 % от общего числа инфицированных образцов) и ДНК-патогены - P. infestans, C. michiganensis subsp. sepedonicus, P. carotovorum subsp. carotovorum, P. atrosepticum (соответственно 35,6, 28,9, 18,9 и 13,3 % от общего числа инфицированных образцов). Результаты скрининга дополняют и расширяют информацию, полученную другими исследователями. В целом метод ПЦР в реальном времени в формате микроматриц представляет собой простой, эффективный и удобный
инструмент для скрининга и комплексного наблюдения одновременно за широким спектром фитопатогенов, в том числе в форме смешанных инфекций. Использование этого метода в структурах, имеющих сеть лабораторий в различных географических регионах, в течение длительного периода времени позволит не только наблюдать за фитосанитарной ситуацией, но и контролировать эффективность проводимых мероприятий по борьбе с болезнями сельскохозяйственных культур.
Литература.
1. Российский статистический ежегодник. М.: Росстат, 2015. 728 с.
2. Oerke E.-C. Crop losses to pests // Journal of Agricultural Science. 2006. Vol. 144. Pp. 31-43.
3. From single to multiplex detection of plant pathogens: pUMA, a new concept of multiplex detection using microarrays / P.J.M. Bonants, C.D. Shoen, M. Szemes, etc.//PhytopathologyPolonica. 2005. Vol. 35. Pp. 29-47.
4. Nezhad A.S. Future of portable devices for plant pathogen diagnosis // Lab on a Chip. 2014. Vol. 14. Pp. 2887-28904.
5. Posthuma-Trumpie G.A., Korf J., van Amerongen A. Lateral flow(immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal. Bioanal. Chem. 2009. Vol. 393. Pp. 569-582.
6. Rapid detection of wheat yellow mosaic virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification / Z.Y. Zhang, X.J. Liu, D.W. Li, etc. // Virology Journal. 2011. Vol. 8. Article ID 550 [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC3260119/(дата обращения: 15.12.2018).
7. Microchip analytic system for multiplex analysis by real-time polymerase chain reaction with reagents immobilized in microreactors / D.V. Navolotskii, A.V. Perchik, I.A. Mark'yanov, etc. //Applied Biochemistry and Microbiology. 2011. Vol. 47. Pp. 221-227.
8. Шуровенков Ю. Б. Рекомендации по учету и выявлению вредителей и болезней сельскохозяйственных растений. Воронеж: ВНИИЗР, 1984. 273 c.
9. Matrix approach to the simultaneous detection of multiple potato pathogens by real-time PCR / M.M. Nikitin, N.V. Statsyuk, P.A. Frantsuzov, etc. // Journal of Applied Microbiology. 2018. Vol. 124 (3). Pp. 797-809.
10. Mozhaeva, K.A., Girsova, N.V., Kastalyeva, T.B. Main causes of potato spindle tuber viroid distribution in seed potato in Russia in 1990s // Journal of Russian Phytopathological Society. 2003. Vol. 4 (1). Pp. 39-42.
11. Фоминых Т.С., Иванова Г.П., Макаренко Е.В. Проблемы вирусных болезней в современном картофелеводстве/Научное обеспечение развития АПК в условиях импортозамещения: материалы конференции (26-28 января 2017 г., Санкт-Петербург, Россия). 2017. С. 169-173.
12. Шляхов В.А., Григорян Л.Н. Идентификация вирусных болезней картофеля методом ПЦР-диагностики на территории Астраханской области //Живые и биокосные системы. 2017. Т. 21. Статья 6. uRL: http://www.jbks.ru/archive/issue-21/article-6/ (дата обращения: 12.01.2018).
13. Гнутова Р.В., Можаева К.А. Вирусные и вироидные болезни картофеля на Дальнем Востоке и методы их диагностики в семеноводстве // Известия ТСХА. 2010. № 2. С. 35-43.
14. Говоров Д., Живых А. Применение инновационных методов фитосанитарного мониторинга специалистами филиалов ФГБУ «Россельхозцентр» // Международный сельскохозяйственный журнал. 2014. № 5. С. 14-17.
15. Мониторинг бактериальных и вирусных болезней сельскохозяйственных культур/Д.Н. Говоров, А.В. Живых, Е.С. Новоселов и др. // Защита и карантин растений. 2015. № 7. С. 35-37.
16. Распространение в России черной ножки картофеля, вызываемой бактериями р. Dickeya/ А.Н. Игнатов, А.Н. Карлов, Ф.С. Джалилов и др. // Защита и карантин растений. 2014. № 11. С. 41-43.
17. Игнатов А.Н., Егорова М.С., Ходыкина М.В. Распространение бактериальных и фитоплазменных болезней растений в России // Защита и карантин растений. 2015. № 5. С. 6-9.
LARGE-SCALE SCREENING OF RNA- AND DNA-CONTAINING POTATO PATHOGENS USING PCR
IN A MATRIX FORMAT
P.A. Frantsuzov1, M.M. Nikitin1, A.M. Mal'ko2, A.B. Zhivykh2, N.V. Statsyuk3, V.G. Dzhavakhiya3, A.G. Golikov1
1OOO «GenBit», pr. Nauchnyi, 20, str. 2, Moskva, 117246, Russian Federation
2Russian Agricultural Center, Orlikovper., 1/11, str. 1, Moskva, 107139, Russian Federation
3All-Russian Research Institute of Phytopathology, ul. Institut, vl. 5, r.p. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii r-n, Moskovskaya obl., 143050, Russian Federation
Abstract. Information about the phytosanitary state of potato fields in Russia is rather limited and includes either data on single pathogens or detailed data for separate regions. In this study we evaluated a potential of PCR/RT-PCR micromatrices, intended for simultaneous detection of a range of viral, bacterial, and oomycetal potato pathogens, for a wide-scale screening of the target pathogens. The study was carried out in 2015-2017 at the regional branches of the Russian Agricultural Center ("Rosselkhoztsentr") in Kaliningrad, Leningrad, Tver, Moscow, Kostroma, Nizhny Novgorod, Samara and Irkutsk regions, Stavropol and Krasnodar Krais, as well as in the Republic of Tatarstan using an "AriaDNA" microchip amplifier and compatible microarrays. Samples were collected according to standard methods. The level of infection with RNA-viruses, according to the analysis of potato leaves (n = 580), was 28.8%, with the prevalence of PVS, PVYo and PVM viruses (46.2, 45.7, and 34.7% of the total number of infected samples, respectively). The level of mixed viral infections was 12.9% (n = 75) of the total number of samples. In the most cases, such infections were represented by a combination of two different viruses (73.3% of the total number of infected samples), while the rest of samples were infected by three or four viruses (16.0 and 10.7%, respectively). The mixed infections were dominated by PVYo, PVM, and PVS. Among the tuber samples (n = 456), it was revealed 19.1% of tubers, infected with DNA-containing pathogens, mainly Phytophthora infestans, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, and P. atrosepticum (35.6, 28.9, 18.9, and 13.3% of the total number of infected samples, respectively). Mixed bacterial infections were detected in one sample from Moscow region (P. carotovorum subsp. carotovorum + P. atrosepticum) and two samples from Kostroma region (C. michiganensis subsp. sepedonicus + P. carotovorum subsp. carotovorum). The tested technology represents a simple and informative tool to control a phytosanitary situation in relation to the most important potato pathogens.
Keywords: real-time PCR, matrix format, potato viral diseases, potato bacterial diseases, screening, phytosanitary monitoring. Author Details: P.A. Frantsuzov, Cand. Sc. (Biol.), research biochemist (e-mail: frantsuzov@genbitgroup.com); M.M. Nikitin, Cand. Sc. (Biol.), leading research engineer; A.M. Mal'ko, D. Sc. (Agr.), director; A.V. Zhivykh, Cand. Sc. (Agr.), director of division; N.V. Statsyuk, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; V.G. Dzhavakhiya, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; A.G. Golikov, D. Sc. (Chem.), deputy director.
For citation: Frantsuzov P.A., Nikitin M.M., Mal'ko A.M., Zhivykh A.B., Statsyuk N.V., Dzhavakhiya V.G., Golikov A.G. Large-Scale Screening of RNA- and DNA-containing Potato Pathogens Using PCR in a Matrix Format. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 3. Pp. 45-49 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10309.
