CC BY
26
УДК 595.789/582/599.001.4
шашечницы рода MELLICTA (lepidoptera,
nymphalidae)
европейской россии: изменчивость гениталий и молекулярная диагностика
М.Г. Буш
Впервые рассматривается внутривидовая (включая внутрипопуляционную) изменчивость каудального отростка вальвы - диагностического признака самцов шашечниц рода Mellicta Billberg, 1820 Европейской России и сопредельных территорий. Построены ряды вариантов данного признака для каждого вида (M. athalia, M. caucasogenita, M. britomartis, M. aurelia), а также установлены доли каждого типа строения каудального отростка в избранных популяциях. Впервые для ряда регионов установлена перспективность идентификации видов путем применения метода секвенирования гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (COI) митохон-дриальной ДНК.
Ключевые слова: Mellicta Billberg, 1820; гениталии самца, Европейская Россия, Черниговская обл., Крым, Кавказ, Челябинская обл., митохондриальная ДНК, ген COI.
Mellicta Billberg, 1820 - небольшой палеаркти-ческий род семейства Nymphalidae, включающий по разным оценкам до 18 видов. Он представляет собой одну из наиболее сложных для изучения групп дневных чешуекрылых. Статус и границы некоторых включаемых в этот род таксонов до сих пор неясны. Представители рода имеют настолько изменчивые окраску и рисунок крыла, что для надежной идентификации видов используют строение копулятивного аппарата самцов, но иногда возникают ситуации, когда видовую принадлежность особи сложно определить и по генитальным структурам. Очевидно, что на нынешнем этапе изучения группы необходимо уделять особое внимание внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости генитального аппарата. Мы начали исследования с представителей Mellicta, обитающих в Европейской России и на сопредельных территориях. Это Mellicta athalia (Rottemburg, 1775), M. caucasogenita (Verity, 1930), M. britomartis (Assmann, 1847) и M. aurelia (Nickerl, 1850). Виды заметно отличаются по строению копулятивного аппарата, однако изучению изменчивости их гениталий внимания практически не уделялось. Кроме того, заманчивым представлялось применение появившихся в последние годы молекулярно-генетических методов, которые используются для изучения филогенетических связей
и для видовой диагностики. В первую очередь это касалось разработанной в последние годы технологии ДНК-штрихкодирования для идентификации с помощью секвенирования нуклеотидной последовательности гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (COI) митохондриальной ДНК (Hebert et al., 2003). Было показано, что этот метод позволяет хорошо различать ряд видов подсемейства Melitaeinae (Wahlberg, Zimmermann, 2000; Leneveu, Chichvarkhin, Wahlberg, 2009). В работах рассматривались и названные выше четыре вида, но из других регионов.
Цель настоящей работы состояла в изучении изменчивости полового аппарата самцов шашечниц рода Mellicta Европейской России и сопредельных территорий, а также оценка применения метода секвенирования гена COI для систематики данных видов.
Обработку материала мы проводили в Научно-исследовательском Зоологическом музее МГУ и на кафедре энтомологии биологического факультета МГУ Секвенирование ДНК осуществлялось в Канадском центре ДНК-штрихкодирования Института биоразнообразия Университета штата Онтарио в Гуэлфе (Canadian Centre for DNA Barcoding Biodiversity Institute of Ontario University of Guelph) в рамках проекта «Barcode of Life».
Материал и методы
Сбор материала мы проводили в августе 2006 г. в окрестностях г. Теберда (Республика Карачаево-Черкесия), в июне 2007 г. в окрестностях дер. Лужки (Московская обл., Серпуховский р-н) и в окрестностях дер. Щербатовка (Волгоградская обл., Камышинский р-н), а также в июне 2008 г. в окрестностях г Бахчисарай (Крым). Кроме того, нами изучен материал из коллекций Зоологического музея МГУ, включая крупнейшую в стране бывшую частную коллекцию чешуекрылых А.В. Цветаева, где хранятся экземпляры из следующих регионов: различные районы Москвы и Московской обл. (Кузьминки, Петровско-Разумовское, Серпуховский и Егорьевский районы и др.), Псковская, Тверская, Тульская и Липецкая области, г. Седнев (Украина, Черниговская обл.), Воронежская, Самарская и Саратовская обл., г. Теберда (Республика Карачаево-Черкесия), различные районы Армении и Грузии; изучен также предоставленный коллегами материал из Челябинской обл.
Препарирование генитального аппарата самцов проводили по стандартной методике: у каждого исследуемого экземпляра отделяли часть брюшка, несущую генитальный аппарат, и помещали для мацерирования на трое суток в 10%-й раствор КОН, затем препарат извлекали из щелочи, очищали от мышечных и жировых тканей, промывали последовательно в воде и в 75%-м этиловом спирте, помещали в блистер, наполненный глицерином, и подкалывали под соответствующий коллекционный экземпляр. Зарисовку препаратов осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа «МБС-1» с 8-кратным увеличением окуляра и 4-кратным - объектива. Зарисовывали каудальные отростки правой и левой вальвы в одном и том же ракурсе. Всего было зарисовано 588 каудальных отростков, из них: 294 - M. athalia, 80 - M. caucasogenita, 108 - M. britomartis и 106 - M. aurelia. Для оценки достоверности различий отдельных популяций по степени изменчивости использовали точный критерий Фишера. Расчеты точного 95%-го доверительного интервала проводили, основываясь на биномиальном распределении.
Для ДНК-анализа у каждого экземпляра отделяли по одной ноге и помещали в индивидуальную пробирку типа Eppendorf со спиртом (90%-й раствор), после чего отправляли на выделение и секвенирование ДНК в Канадский Центр ДНК-штрихкодирования. Выделение ДНК, амплифика-
ция фрагмента гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (COI) и его секвенирование проводили по стандартным методикам (Hebert et al., 2003) с использованием праймеров LepF1-LepR1 (Ivanova et al., 2006). Полученные последовательности фрагмента гена COI анализировали и выравнивали вручную с помощью программы BioEdit (Hall, 1999). В общей сложности были получены последовательности для 137 экземпляров представителей рода Mellicta из Московской и Волгоградской областей, а также из г. Теберда (Республика Карачаево-Черкесия). Последовательности фрагмента гена COI доступны на сайте Канадского центра ДНК-штрихкодирования (www.barcodinglife.org). Последовательности представителей рода Melitaea использовались в качестве внешней группы. Финальное выравнивание исследуемого фрагмента гена COI включало 621 пару нуклеотидов. Построение филогенетических дендрограмм осуществляли с помощью программы MEGA 4 (Tamura et al., 2007) с использованием дистанционного метода ближайшего соседа (NJ, Neighbour-Joining, по генетическим дистанциям Тамура-Неи (Tamura, Nei, 1993)) и кладистическо-го метода максимальной экономии (MP, Maximum Parsimony). Устойчивость полученных ветвлений дендрограммы проверяли методом бутстрэп-анализа (Boot-Strap), всего было проведено 1000 бутстрэп-реплик (Felsenstein, 1985).
Результаты и обсуждение
I. Внутривидовая изменчивость полового аппарата самцов: повидовой анализ
M. athalia
M. athalia - наиболее широко распространенный и часто встречающийся вид рода Mellicta. От других видов Mellicta Европейской России он отличается длинным, узким каудальным отростком вальвы, основной зубец которого загнут вверх (Львовский, Моргун, 2007; Higgins, 1955; Devyatkin, 2000). Внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы M. athalia уже рассматривалась нами в предыдущей работе (Буш, 2008), по сравнению с которой здесь для анализа используется большее количество экземпляров.
Нами обнаружено, что внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы у M. athalia довольно велика. Всего нами выделен 31 тип строения каудального отростка (рис. 1). Выяснилось, что тип строения, который приводится в качестве
Рис. 1. Внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы M. athalia Европейской России и
сопредельных территорий
основного в определителях (Львовский, Моргун, 2007; Higgins, 1955; Devyatkin, 2000; Lafranchis, 2004), тип d нашей системы, представлен в 55,7% случаев (доверительный интервал 49,9-61,5%). Кроме того, относительно часто встречается каудальный отросток, отличающийся от основного типа раздвоенным боковым зубцом. Встречаемость данного типа (l) составила 14,3% (доверительный интервал 10,5-18,8%). Остальные типы встречаются в 5,1% случаев (доверительный интервал 2,8-8,2%) и реже, часто в единичных случаях.
Для сравнения степени изменчивости данного признака в разных популяциях мы взяли три, представленные наибольшими выборками, популяции: из окрестностей дер. Лужки Серпуховского р-на Московской обл. (78 каудальных отростков), из окрестностей с. Метлино Каслинского р-на Челябинской обл. (71 отросток) и из окрестностей дер. Щербатовка Камышинского р-на Волгоградской обл. (33 отростка). Оказалось, что материал из дер. Щербатовка представлен пятью типами. Основной тип строения каудального отростка (тип d) заметно преобладает - встречается в 75,7% случаев (доверительный интервал 57,7-88,9%), остальные типы встречаются в 9% случаев и реже (доверительный
интервал 1,9-24,3%). Отклонения этих типов от основного незначительны: они отличаются либо отсутствием зубца (тип а), либо наличием дополнительного зубца (типы е, /), либо раздвоенным боковым зубцом (тип /). В популяции из дер. Лужки (Московская обл., Серпуховский р-н), напротив, диапазон изменчивости высок. Всего было выделено 13 основных типов строения каудального отростка вальвы. Ряд изменчивости в данной популяции сопровождается как небольшими отклонениями от основного типа d - наличием дополнительного зубца и/или видоизменением имеющегося зубца у типа d (рис. 1, типы a, b, d, e, f, g, j, l), так и более существенными (типы m, n, p); наиболее заметно отклоняется от основного тип х. Основной тип (тип d) встречается в 50% случаев (доверительный интервал 38,4-61,5%). Довольно часто (в 17% случаев) встречается тип / (доверительный интервал 10,1-28,2%). Остальные типы встречаются редко - в 6,4% случаев и реже (доверительный интервал 2,1-14,3%), но их довольно много. Согласно точному критерию Фишера, доля основного типа в популяции из окрестностей дер. Щербатовка значимо выше (p = 0,0128), чем в популяции из окрестностей дер. Лужки.
В популяции из окрестностей с. Метлино (Челябинская обл., Каслинский р-н) было выделено 12 типов строения каудального отростка вальвы. Основной тип (тип d) представлен в 66,2% случаев (доверительный интервал 53,9-77,0%), тип l (с раздвоенным боковым зубцом) был встречен в 9,8% случаев (доверительный интервал 4,0-19,2 %), остальные типы встречаются в 5,6% случаев (доверительный интервал 1,5-13,8%) и реже. В ряду изменчивости присутствуют небольшие отклонения от основного типа (рис. 1, типы d, e, j, c, f, l), средние отклонения (рис. 1, типы sa, s) и более значительные отклонения (см. рис. 1, типы pa, w, y, ua). Доля основного типа строения каудального отростка в данной популяции достоверно не отличается от двух других, однако отличия от популяции из Московской обл. близки к достоверным (p = 0,0487, что при сравнении двух популяций являлось бы достоверным, но поскольку мы сравниваем три популяции, то необходимо учитывать поправку Бонферрони - 0,05/число сравнений). На основании полученных результатов можно сделать вывод, что наиболее высокой изменчивостью обладает популяция из окрестностей дер. Лужки. В популяции из окрестностей с. Метлино также встречается довольно много различных типов строения каудально-го отростка вальвы, но основной тип значительно преобладает, а следовательно, изменчивость в этой популяции ниже, чем в предыдущей.
Самой низкой степенью изменчивости обладает популяция из окрестностей дер. Щербатовка, которую, кстати, нередко относят к подвиду lucífuga. Для интерпретации этих результатов можно выдвинуть следующие гипотезы. Популяция из Волгоградской обл. является изолированной, поскольку обитает в балке, которая представляет собой находящийся в степи овраг с лесом, и бабочки не вылетают за его пределы. Вследствие такой изоляции генетическое разнообразие в популяции невелико, и изменчивость полового аппарата, которая определяется генетически, низка. Наряду с M. athalia в овраге встречаются другие близкие виды (M. aurelia и M. britomartis). Как известно, одним из презиго-тических репродуктивно изолирующих механизмов двух близких видов является несовместимость генитального аппарата. Каудальный отросток, вероятно, предназначен для сцепления копулятивных аппаратов самца и самки во время спаривания. По всей видимости в таких популяциях отбор шел на снижение изменчивости строения каудального от-
ростка во избежание межвидовых скрещиваний. В Московской и Челябинской областях M. athalia встречается на довольно обширных территориях, где имеет место поток генов из соседних популяций, вследствие чего изменчивость там довольно высока. Более высокую изменчивость популяции из Московской обл., по сравнению с Челябинской, можно объяснить тем, что в Серпуховском р-не Московской обл. из представителей рода Mellicta обитает только M. athalia, риск межвидового скрещивания отсутствует, и изменчивость в результате более высокая, а в Челябинской обл. вместе с M. athalia летает M. britomartis. Остальные популяции представлены слишком малыми выборками, и мы учитывали данные по этим популяциям лишь при сравнении общей картины.
M. caucasogenita
M. caucasogenita является видом, наиболее близким к M. athalia, и ранее считался его кавказской формой (Verity, 1940). От M. athalia отличается тем, что основной зубец каудального отростка загнут не вверх (как у M. athalia), а немного вниз или вовсе не загнут (Devyatkin, 2000).
Всего нами выделено 17 основных типов строения каудального отростка вальвы у M. caucasogenita (рис. 2), тогда как у M. athalia их было выделено 31. По всей видимости это связано с меньшей по объему выборкой (294 каудальных отростка вальвы у M. athalia и 80 у M. caucasogenita). Почти все выделенные типы соответствуют таковым у M. athalia, исключениями являются два типа - ba и ij (рис. 2). В изученном материале с Кавказа (Армения, Грузия, г. Теберда) у M. caucasogenita, как и у M. athalia, наиболее часто встречается тип d. Однако здесь он встречается менее чем в половине случаев (38,7%, доверительный интервал 28,050,3%). Согласно точному критерию Фишера, доля основного зубца у M. caucasogenita значимо ниже (p = 0,0080), чем у M. athalia. Остальные типы встречаются в 8,7% случаев (доверительный интервал 3,5-17,2%) и реже. Среди выделенных типов строения каудального отростка вальвы большинство имеют незначительные отклонения от основного типа (a, ba, d. f, e, g, i, ij, c, l), однако встречаются экземпляры и с более значительными отклонениями (o, n, r, t), наиболее заметно отклонение у типа w -разделенный натрое боковой зубец. Мы не можем оценивать частоту встречаемости отдельных типов каудального отростка в разных популяциях из-за
Рис. 2. Внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы М. caucasogenita из популяций с Кавказа
небольших выборок, за исключением популяции из Армении (39 отростков). Материал, полученный в Армении, согласуется с общей картиной - основной тип представлен в 38,4% случаев (доверительный интервал 23,3-55,3%). Достаточно часто встречается более простой тип - тип а, который представлен в 17,9% случаев (доверительный интервал 7,5-33,5%). Остальные встречаются в 10,2% случаев (доверительный интервал 2,8-24,2%) и реже.
М. britomartis
М. britomartis существенно отличается от двух предыдущих строением каудального отростка вальвы. В отличие от М. аЛаЫа и М. caucasogenita, для М. britomartis характерны более короткие и широкие каудальные отростки, имеющие более сложное строение (Львовский, Моргун, 2007; Higgins, 1955; Devyatkin, 2000). У этого вида, как правило, большее количество зубцов, расположенных на каудальном отростке вальвы, чем у М. athalia и М. сaucasogenita, он имеет тенденцию к увеличению числа зубцов на верхней стороне основного (самого большого) зубца каудального отростка вальвы, а также на боковом зубце.
У М. britomartis было выделено 50 типов строения каудального отростка вальвы (рис. 3), что намного выше, чем у М. athalia и М. caucasogenita. Однако некоторые типы по количеству и расположению зубцов соответствуют таковым у двух данных видов. Как показало изучение материала из Европейской России и сопредельных территорий, у М. britomartis, в отличие от двух предыдущих видов,
нет основного типа строения каудального отростка, частота встречаемости которого значительно преобладает. Большинство типов строения встречается менее чем в 3,7% случаев (доверительный интервал 1,0-9,2%), часто у единичных экземпляров. Наиболее часто встречается тип п (10,1% случаев, доверительный интервал 5,1-17,4%). Типы, имеющие наиболее сложное строение, встречаются единично. Мы предприняли попытку объединить типы, имеющие одинаковое количество зубцов, вне зависимости от их расположения, сократив таким образом количество типов. Такие объединенные типы мы назвали условными. Всего было выделено 10 условных типов строения каудального отростка вальвы, содержащих от 3 до 12 зубцов. Наиболее часто встречаются три типа: с пятью (21,3%, доверительный интервал 14-30,2%), шестью (24%, доверительный интервал 16,3-33,2%) и семью (22,2%, доверительный интервал 14,7-31,2%) зубцами; остальные типы встречаются в 9,2% случаев (доверительный интервал 4,5-16,3%) и реже. Мы сравнили две популяции, представленные наибольшими выборками, - из Самарской обл. (42 каудальных отростка) и из Челябинской обл. (46 каудальных отростков). Выборки из других популяций (Саратовская, Волгоградская и Московская области) мы отдельно не рассматривали из-за недостаточного объема материала, однако они были включены в общий анализ. В каждой из сравниваемых популяций представлено 9 условных типов строения каудального отростка вальвы. Согласно точному критерию Фишера, доля каудального отростка с шестью зубцами в популяции из
Рис. 3. Внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы M. britomartis Европейской
России и сопредельных территорий
Челябинской обл. значимо выше (p = 0,0298), чем в популяции из Самарской обл., доли двух других преобладающих типов в сравниваемых популяциях, согласно данному критерию, значимо не отличаются. Однако, учитывая условность сравниваемых типов отростка, говорить о какой-либо тенденции преждевременно.
M. aurelia
Основное отличие M. aurelia от остальных представителей рода Me//icta Европейской России и сопредельных территорий состоит в редукции зубцов ункуса. Строение каудального отростка вальвы M. aurelia напоминает таковое у M. britomartis, однако обычно он шире, и его основной зубец имеет более изогнутую форму (Львовский, Моргун, 2007;
Higgins, 1955; Devyatkin, 2000). Всего было выделено 29 типов строения данной структуры (рис. 4). У M. aurelia, как и у M. britomartis, нельзя выделить основной тип строения каудального отростка вальвы, максимальная частота встречаемости не превышает 13,2% (доверительный интервал 7,4-21,1%). Здесь, как и в случае с M. britomartis, мы объединили типы строения каудального отростка вальвы с одинаковым количеством зубцов, всего было выделено 9 условных типов строения каудаль-ного отростка с числом зубцов от 2 до 10. Чаще всего встречаются отростки с шестью (34,9%, доверительный интервал 25,9-44,7%) и пятью (29,2%, доверительный интервал 20,8-38,8%) зубцами, реже с четырьмя зубцами (17,9%, доверительный интервал 11,1-26,5%), остальные типы отростков встре-
Рис. 4. Внутривидовая изменчивость каудального отростка вальвы M. aurelia Европейской России и сопредельных территорий
чаются в 9,4% случаев (доверительный интервал 4,6-16,6%) и реже. Для изучения изменчивости в разных популяциях мы сравнили три выборки: из Московской обл. (26 отростков), Волгоградской обл. (32 отростка) и Крыма (32 отростка); популяции из Крыма иногда рассматривают как подвид petricola (Некрутенко, 1985). Также была исследована выборка из окрестностей г. Теберда (подвид albimacula), но ввиду небольшого объема она была включена только в общий анализ.
В популяции из Московской обл. было выделено 6 типов строения каудального отростка вальвы, из Волгоградской - 7, из Крыма - 5. В каждой популяции преобладают отростки с пятью и шестью зубцами. Согласно точному критерию Фишера, доли этих типов в каждой популяции друг от друга до-
стоверно не отличаются. В популяции из Крыма также довольно часто встречаются отростки с четырьмя зубцами, но, согласно точному критерию Фишера, доля данного условного типа достоверно не отличается от двух других.
II. Сравнительный анализ внутривидовой изменчивости полового аппарата самцов рода Mellicta Европейской России и сопредельных территорий
На основании полученных результатов по внутривидовой изменчивости видов рода Mellicta Европейской России и сопредельных территорий можно заключить, что в целом все четыре вида имеют довольно высокую изменчивость полового аппарата самцов. Наименьшую изменчивость имеют
M. athalia и M. caucasogenita, для каждого из этих видов можно выделить основной тип строения кау-дального отростка вальвы, который встречается значительно чаще, чем остальные. Основной тип строения каудального отростка у M. caucasogenita (тип d) соответствует по числу и расположению зубцов таковому у M. athalia. Ранее M. caucasogenita считали кавказской формой M. athalia (Verity, 1940). Отличия в строении их половых аппаратов совсем небольшие - у M. athalia каудальный отросток вальвы загнут вверх, у M. caucasogenita - немного вниз. Этот признак является довольно надежным для видовой диагностики. У M. britomartis строение каудального отростка вальвы усложняется. Данный вид обладает наибольшей изменчивостью среди четырех изученных. Здесь ярко выражена тенденция к образованию многочисленных зубцов, иногда разветвляющихся. Однако встречаются экземпляры с малым количеством зубцов, соответствующие по их числу и расположению таковым у M. athalia. Никулеску (Niculescu, 1964, цит. по: Свиридов, 1981) утверждает, что M. britomartis и M. athalia - конспецифичные виды. По его мнению, M. britomartis не имеет надежных признаков и не достиг еще видового статуса. По нашим данным (как и по данным большинства авторов), M. britomartis существенно отличается от M. athalia строением каудального отростка вальвы. Он имеет более ши-
рокие каудальные отростки вальвы с загнутым вниз основным зубцом, тогда как каудальные отростки у M. athalia довольно узкие, и основной зубец загнут вверх. Вид M. aurelia пошел по пути редукции зубцов ункуса и надежно отличается этим признаком от остальных. Строение каудального отростка вальвы у него напоминает таковое у M. britomartis, но тенденции к увеличению числа зубцов на верхней стороне основного зубца почти не выражено (хотя иногда попадаются экземпляры с большим числом данных структур), и изменчивость ниже.
Внутривидовая изменчивость может существенно различаться в разных популяциях. Основными факторами отбора могут служить межвидовые взаимоотношения, условия обитания и др. Так, на примере M. athalia показано, что в изолированной популяции, где к тому же обитают близкие виды, изменчивость достоверно ниже. У нас недостаточно материала по M. caucasogenita, чтобы проводить такие сравнения. M. britomartis и M. aurelia имеют более сложное строение полового аппарата, и их изменчивость велика сама по себе.
III. Результаты анализа последовательностей гена Coi митохондриальной ДНК
Полученные нами данные по применению фрагмента гена COI для исследований систематических взаимоотношений и молекулярной идентификации
100/100 Г AVS186
Г Mellicta athalia
63/60 1—AVS150
97/85 loo/loo68 Mellicta caucasogenita
1UU/1UUI—AVS167
94/78
100/100
г
AVS171
Mellicta britomartis
AVS012
100/100
AVS039
Mellicta aurelia
100/100
0.005
AVS038 AVS159
avso76 Melitaea diamina
AVS160
Г.
Рис. 5. Филогенетические связи между европейскими видами рода Mellicta по данным анализа 621 п.н. фрагмента гена первой субъединицы цитохром ооксидазы (COI). Над косой чертой показаны значения бут-стрэп поддержки узлов дендро-граммы для схемы, полученной с помощью дистанционного метода ближайшего соседа (Neighbour Joining); а под косой чертой - для схемы, полученной с помощью метода максимальной экономии (Maximum Parsimony)
представителей Melitaeinae носят предварительный характер, более полный анализ наших данных по этой проблеме будет опубликован в отдельной статье. В этой работе мы рассмотрим лишь применимость исследованного фрагмента гена COI митохон-дриальной ДНК к диагностике четырех европейских видов рода Mellicta. Согласно нашим данным (рис. 5), все четыре исследованных нами вида данного рода группируются в самостоятельные, хорошо обособленные друг от друга клады.
Филогенетический анализ с помощью методов ближайшего соседа (NJ) и максимальной экономии (MP) позволил получить дендрограммы с идентичной топологией. На рис. 5 показана схема филогенетических связей между исследованными видами рода Mellicta. Как видно из рисунка, все бутстрэп-поддержки являются достоверными (более 50%). В таблице показаны значения скорректированных генетических дистанций между исследованными видами. Использованный нами вид Melitaea diamina (в качестве внешней по отношению к роду Mellicta группы) интересен тем, что по строению генитального аппарата он отнесен к роду Melitaea, а по окраске крыльев больше напоминает виды Mellicta. Ранее была показана тесная связь между M. diamina и родом Mellicta, по данным анализа мтДНК-маркеров (Wahlberg, Zimmermann, 2000).
Согласно нашим данным, генетические дистанции между видами рода Mellicta (значения p составляют от 2,32 до 5,22%) незначительно перекрываются со значениями дистанций между M. diamina и представителями Mellicta (значения p составляют от 4,98 до 6,14%). Однако четыре исследованных вида рода Mellicta образуют надежную монофилетическую группу по отношению к M. diamina (BS = 94/78% для данных анализов NJ/MP соответственно). При этом M. aurelia занимает наи-
более обособленное положение, в то время как M. britomartis, M. caucasogenita и M. athalia образуют достаточно компактную достоверно монофилетиче-скую группу (BS = 97/85% для данных анализов NJ/MP соответственно). Анализ некоррелированных генетических дистанций также подтверждает обособленность M. aurelia, которая оказывается весьма значительно отстоящей от всех остальных видов рода (значения p составляют от от 3,98 до 5,22%), в то время как дистанции между видами M. britomartis, M. caucasogenita и M. athalia заметно меньше (значения p составляют от от 2,32 до 3,07%). Таким образом, анализ мтДНК хорошо согласуется с морфологической специфичностью M. aurelia, отличающейся от остальных видов Mellicta редукцией зубцов ункуса.
В целом система, основанная на результатах анализа последовательностей гена COI, согласуется с традиционной системой рода Mellicta. Три близких вида - M. britomartis, M. caucasogenita и M. athalia - объединяются в одну группу, филогенетические связи внутри которой разрешены не абсолютно. Последнее свидетельствует о том, что, возможно, дифференциация этой видовой группы происходила в относительно сжатые с точки зрения эволюции сроки. Наиболее близки друг другу сестринские виды M. athalia и M. caucasogenita, что согласуется с их значительным морфологическим сходством. Однако как заметные генетические дистанции, так и умеренные значения бустрэп-поддержки (p = 2,32%; BS = 63/60% для данных анализов NJ/MP соответственно) определенно указывают на видовую самостоятельность M. caucasogenita - генетическая дистанция между этими сестринскими видами лишь ненамного меньше уровня обособленности морфологически заметно отличающегося вида M. britomartis (p = 2,74-3,07%). Таким образом, данные анализа
Скорректированные генетические р-дистанции между европейскими видами рода МеШ&а и внешней группой ('МеШаеа (Пчш'шч) ( %). Полужирным шрифтом на диагонали для представителей МеШ&а показаны внутригрупповые генетические дистанции, под диагональю - межвидовые сравнения
Вид 1 2 3 4 5
1. M. diamina -
2. M. aurelia 6,14 0,00
3. M. athalia 6,14 4,48 0,33
4. M. britomartis 5,89 5,22 3,07 0,50
5. M. caucasogenita 4,98 3,98 2,32 2,74 0,33
мтДНК убедительно подтверждают видовой статус M. caucasogenita.
В нашей предыдущей работе (Буш, 2008) топология дендрограммы, основанной на данных анализа нуклеотидных последовательностей гена COI, несколько отличается от полученной нами в настоящей работе. В предыдущей работе M. britomartis заняла положение между M. athalia и M. caucasogenita, что явственно не согласуется с данными морфологии (отметим, что значения бутстрэп-поддержки этого ветвления были малодостоверными, так что данный узел дендрограммы следовало рассматривать как трихотомию). Как выяснилось, в проведенный нами ранее анализ была включена сомнительная последовательность, по-видимому представляющая собой последовательность ядерного псевдогена COI (что предполагает, например, смещение частот нуклео-тидного состава). Исключение ее из анализа привело к восстановлению топологии, согласующейся как с результатами анализа морфологических данных, так и с результатами предыдущих исследований по данной группе (Wahlberg, Zimmermann, 2000; Leneveu, Chichvarkhin, Wahlberg, 2009).
Таким образом, результаты анализа фрагмента гена COI предполагают видовой статус всех исследованных форм рода Mellicta. По-видимому, данный фрагмент мтДНК позволяет надежно различать близкие виды рода Mellicta, что делает метод ДНК-идентификации весьма перспективным в связи со сложностью диагностики многих Melitaeinae. В дальнейшем данный метод можно применять и к тем видам, чей видовой статус пока неясен, что, возможно, позволит решить ряд спорных вопросов систематики рода.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Буш М.Г. Внутривидовая изменчивость полового аппарата самцов M. athalia (Rott.) на территории европейской части России // Биосфера Земли: прошлое, настоящее и будущее. Матер. конф. молодых ученых, 21-25 апреля 2008 г. / ИЭРиЖ УрО РАН. Екатеринбург, 2008. С. 41-48
Львовский А.Л., Моргун, Д.В. Булавоусые чешуекрылые Восточной Европы. М., 2007. 443 с.
Некрутенко Ю.П. Булавоусые чешуекрылые Крыма: Определитель. Киев, 1985. 152 с.
Свиридов A.B. Фауна булавоусых чешуекрылых (Lepidoptera, Rhopalocera) Зейского государственного заповедника и окрестностей // Биологические ресурсы территории в зоне строительства БАМ. М., 1981.С. С. 46-84
Devyatkin A.L. Genus Mellicta Billberg, 1820 // Guide to the butterflies of Russia and adjacent territories. Vol. 2. Sofia;Moscow, 2000. P. 76-82.
Внутривидовая изменчивость полового аппарата самцов видов рода Mellicta в Европейской России и сопредельных территориях довольно велика, наиболее показательным в этом отношении является строение каудального отростка вальвы.
Степень изменчивости гениталий самцов рода Mellicta может отличаться в разных популяциях. Изменчивость на внутрипопуляционном уровне может определяться межпопуляционными взаимоотношениями и условиями обитания, как это было продемонстрировано на M. athalia. Метод секвенирования гена COI является надежным для идентификации изученных видов.
Система рода Mellicta Европейской России и сопредельных территорий, основанная на молекулярных данных, согласуется с системой, основанной на данных морфологии, в первую очередь на некоторых структурах генитального аппарата самцов.
Автор приносит глубокую благодарность научным руководителям своей дипломной работы, по материалам которой была написана данная статья: А.В. Свиридову и А.Л. Девяткину; А.В. Борисенко (Dr. Alex Borisenko), Полу Эберу (Dr. Paul D.N. Hebert), Меган Мильтон (Megan Milton) за осуществление молекулярной части данной работы в рамках проекта «Barcode of Life»; Н. А. Пояркову за помощь в осуществлении участия в проекте «Barcode of Life» и за помощь в обработке молекулярных данных; Ю.А. Ловцовой за фотографирование образцов для проекта «Barcode of Life»; Е.Ю. Захаровой за предоставление материала из Челябинской обл., а также С.Н. Лысенкову за помощь в статистической обработке данных.
Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. P. 783-791.
Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. Vol. 41. P. 95-98.
Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball Sh. L., Waard de J. R. Biological identifications through DNA barcodes // Proc. R. Soc. London B. 2003. Vol. 270. P. 313-321.
Higgins L.G. A descriptive catalogue of the genus Mellicta Billberg (Lepidoptera: Nymphalidae) and its species, with supplementary notes on the genera Melitaea and Euphydryas // Trans. R. Ent. Soc. London. 1955. Vol. 106. 131 p.
Ivanova N.V., deWaard J., Hebert P.D.N. An inexpensive, automation-friendly protocol for recovering high-quality DNA // Molecular Ecology Notes. 2006. Vol. 6. P. 998-1002.
Lafranchis T. Butterflies of Europe: New Field Guide and Key. 2004. Diatheo. 351 p.
Leneveu J., Chichvarkhin A., Wahlberg N. Varying rates of diversification in the genus Melitaea (Lepidoptera: Nymphalidae) during the past 20 million years // The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society. 2009. Vol. 97. P. 346-361.
Niculescu E.V. 1964. Étude morphologique et systématique sur le genre Melitaea F. (Lep. Nymphalidae). Bull. de la Soc. entomol. de Mulhouse, jan.-févr. P. 1-17.
Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0
// Molecular Biology and Evolution. 2007. Vol. 24. P. 1596. (Publication PDF at http://www.kumarlab.net/publications).
Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. 1993. Vol. 10. P. 512-526.
Verity R. Revision of the athalia group of the genus Melitaea. Trans. R. Ent. Soc. L., P: 591-706.
Wahlberg N., Zimmermann M. Pattern of Phylogenetic Relationships among Members of the Tribe Melitaeini (Lepidoptera: Nymphalidae) Inferred from Mitochondrial DNA Sequences // Cladistics. 2000. Vol. 16. P. 347-363.
Поступила в редакцию 25.03.11
GENUS MELLICTA (LEPIDOPTERA, NYMPHALIDAE) oF EUROPEAN RUSSIA: VARIABILITY oF GENITAL STRUCTURES AND MOLECULAR DIAGNOSTICS
M.G. Bush
For the first time intraspecific and intrapopulational variability of species diagnostic character -posterior valve process in male Mellicta Billberg, 1820 butterflies from European Russia and adjacent territories is considered. Series of character variants are constructed for each species (M. athalia, M. caucasogenita, M. britomartis, M. aurelia); furthermore, percentage rates for each posterior process structure morphotype in certain populations are estimated. Application of COI partial sequences (mtDNA) for species identification is discussed.
Key words: Mellicta Billberg, 1820; male genitalia, European Russia, Chernigov region, Crimea, Caucasus, Chelyabinsk region, mitochondrial DNA, COI gene.
Сведения об авторе: Буш Маргарита Григорьевна - аспирант кафедры энтомологии биологического факультета МГУ (bush_zbs@mail.ru).
