CC BY
59
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 636:611.018.1:619:616.995.121
СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИЕ И ПЕПТИДЕРГИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ПЛЕРОЦЕРКОИДА Phyllobothrium caudatum (Cestoda, Tetraphyllidea). ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Н.Б. ТЕР ЕНИНА доктор биологических наук О.О. ТОЛСТЕНКОВ кандидат биологических наук
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН: e-mail: terenina_n@mail.ru М.К.С. ГУСТАФССОН доцент
Отдел биологии Университета г. Турку, Финляндия
Нейрональные сигнальные вещества - серотонин и нейропептид FMRFамид определены иммуноцито-химически в нервной системе плероцеркоида Phyllobothrium caudatum. Исследуемые нейромедиато-ры обнаружены в головных ганглиях, трёх комиссу-рах, связывающих их, продольных нервных стволах, комиссурах между ними. Наличие иннервации ботри-дий предполагает контроль сократительной активности мышц ботридий со стороны пептидергических и серотонинергических отделов нервной системы.
Ключевые слова: цестоды, нервная система, нейроме-диаторы, серотонин, нейропептиды.
В нервной системе цестод выявлен ряд нейромедиаторных веществ, включая серотонин, нейропептиды, холинергические элементы, катехолами-ны и другие нейротрансмиттеры [16]. Функциональное значение выявленных веществ, как предполагают, связано с регуляцией активности мышц тела, прикрепительных и репродуктивных органов паразитов. Среди исследованных цестод преобладают, главным образом, представители высших цестод отр. Cyclophyllidea, тогда как сведения о нейрональных сигнальных веществах у представителей других таксономических групп этого класса паразитических плоских червей довольно ограничены. В частности, это относится и к цестодам, принадлежащим к довольно большому отряду Tetraphyllidea, который, как считают, является самой примитивной группой цестод, паразитирующих в наиболее древних позвоночных - хрящевых рыбах [3].
В настоящей работе с целью расширения представлений о нервной системе цестод различных таксономических групп было проведено исследование серотонинергических и пептидергических компонентов в нервной системе представителя отряда Tetraphyllidea - плероцеркоида Phyllobothrium caudatum Zschokke and Heitz, 1914 (Phyllobothriidae). Исследованный представитель цестод паразитирует у рыб (Salmonidae), являющихся промысловыми объектами, в связи с чем всестороннее изучение этого паразита представляет дополнительный интерес.
Материалы и методы
Плероцеркоиды Ph. caudatum были извлечены из симы - Oncorhynchus masu (Salmonidae) (Приморский край, залив Восток, Японское море). Мате-
89
риал фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4) при 4 оС и затем сохраняли в 10%-ной сахарозе, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере.
Локализацию серотонинергических и РМИБамидергических нервных структур определяли иммуноцитохимически в соответствии с методом Coons et al. [8]. Образцы инкубировали в первичной антисыворотке (Incstar, USA, в разведении 1 : 500) 5 сут при температуре 4 °C; затем во вторичной антисыворотке (FITC, DAKO, в разведении 1 : 50) в течение последующих 5 сут.
Для исследования взаимоотношения выявляемых нейромедиаторов с мышечными элементами одновременно проводили также окраску мышечных волокон, используя связанный с флуорофором фаллоидин. Для окраски мышц применяли TRITC (тетраметилродамин изотиоцианат), меченный фал-лоидин (в разведении 1 : 200), во влажной камере в течение одного часа в темноте при температуре 4 °C в соответствии с методом, описанным Wahlberg [28].
Препараты исследовали с помощью Leica TCS SP1 конфокального сканирующего лазерного микроскопа.
Результаты и обсуждение
Иммунореактивность к серотонину обнаружена в сколексе Ph. caudatum в парных нервных образованиях, представляющих собой по всей вероятности церебральные ганглии. Каждая пара ганглиев включает три группы иммуно-реактивных к серотонину нервных клеток (размером около 40 х 60 мкм) и связана между собой поперечными тремя комиссурами, из которых средняя наиболее мощная. Между комиссурами имеются тонкие поперечные перегородки (рис. 1, А-Г). В средней части центральной комиссуры кольца находится довольно крупная серотоннергическая клетка (размером примерно 13 х 17 мкм), а вблизи кольца, расположенного в центре сколекса, видны несколько мелких иммунореактивных к серотонину нервных клеток размером 7 х 9 мкм.
Хорошо выраженные наружные и внутренние продольные мышцы идут вдоль тела плероцеркоида к ботридиям (рис. 2, А, Б). По краю ботридии проходят серотонинореактивные волокна, образуя кольцо, а внутри ботридии можно видеть сеть из тонких серотонинергических волокон (рис. 3). Многочисленные нервные волокна видны также в сколексе плероцеркоида (рис. 4).
Ш %
В Г
Рис.1. Иммунореактивность к серотонину в нервных структурах сколекса
Ph. caudatum:
А - общий вид (серотонинергические нервные элементы в сколексе и продольных нервных стволах); Б-Г - церебральные ганглии, комиссуры между ними
А Б
Рис. 2. Внешние и внутренние продольные мышечные волокна в сколексе плеро-
церкоида Ph. caudatum
Рис. 3. Кольцо из серотонинергических волокон на границе ботридии
Ph.caudatum
Рис. 4. Сеть из серотонинергических волокон в сколексе Ph. caudatum
От ганглиев вдоль тела проходят иммунореактивные к серотонину продольные нервные стволы, число которых достигает более 10 пар (рис. 5, А). Продольные нервные стволы связаны поперечными комиссурами. По ходу наиболее мощных двух главных нервных стволов расположены многочисленные иммунореактивные к серотонину клетки размером 12 х 15 мкм, отростки от которых идут к соседним стволам (рис. 1, А). В хвостовой части плероцеркоида продольные нервные стволы сходятся в виде пучка (рис. 5, Б).
А Б
Рис. 5. Серотонинергические продольные нервные стволы в теле (А) и хвостовой
части (Б) Ph. caudatum
Имунореактивность к нейропептиду FMRFамиду выявлена в сколексе в центральной нервной системе, в продольных нервных стволах, число которых составляет 5-6 пар, и поперечных комиссурах, связывающих их (рис. 6, А—В). Густую сеть из FMRFамидергических нервных волокон наблюдали в ботридиях плероцеркоида.
Имеющиеся в литературе анатомические данные о строении нервной системы цестод представителей отр. Tetraphyllidea - Ph. dohrnii и
Anthobothrium auriculatum (PhyПobothrиdae) [22-24] свидетельствуют, что мозг исследованных цестод включает пару двулопастных церебральных ганглиев, соединённых центральной медианной, а также более тонкими вентральной и дорзальной комиссурами. Отмечается также наличие интенсивной иннервации ботридий у исследованных видов.
В
Рис. 6. FMRFамидергические нервные элементы в сколексе (А), продольных нервных стволах (Б), в хвостовой части (В) Ph.caudatum
Нейрохимические данные свидетельствуют, что в нервной системе как взрослых, так и личинок цестод различных таксономических групп обнаружены серотонинергические, пептидергические и холинергические компоненты. Эти сведения имеются в отношении взрослых и личиночных форм цестод отр. Cyclophyllidea (взрослые стадии - Echinococcus granulosus [7, 25], Hymenolepis diminuta [21], Moniezia expansa [20], Microstomacanthus microskrjabin [4], личиночные стадии - E. multilocularis и E. granulosus (про-тосколексы) [5, 11, 15], H. diminuta (цистицеркоиды) [9], Mesocestoides corti (тетратиридии) [17-19, 26], отр. Pseudophyllidea (Triaenophorus nodulosus -процеркоид, плероцеркоид, взрослые стадии [2, 6], Diphyllobothrium dendriticum - процеркоид, плероцеркоид, взрослые формы [12, 13, 29], отр. Spatheobothriidea (взрослые стадии Cyathocephalus truncates) [27], отр. Caryophyllidea (Caryophyllaeus laticeps [1], отр. Protocephalidea -Proteocephalus exigius - процеркоид и взрослые [14].
Что касается цестод отр. Tetraphyllidea, то в литературе имеются данные о наличии серотонинергических и холинергических компонентов в нервной системе плероцеркоида и взрослой стадии Trilocularia acanthiaevulgaris [10]. Авторы отмечают, что в сколексе T. acanthiaevulgaris имеются парные ганглии, а также до 6 иммунореактивных к серотонину нервных клеток, связанных с центральным нервным кольцом. Вдоль тела у T. acanthiaevulgaris выявлено 5 пар продольных нервных стволов. Полученные нами данные в отношении плероцеркоида тетрафиллидной цестоды Ph. caudatum в основном согласуются с имеющимися в литературе сведениями о том, что серотонинер-гические и пептидергические структуры присутствуют в центральных и периферических отделах нервной системы цестод. В сколексе исследованного нами плероцеркоида Ph. caudatum мы также обнаружили наличие парных ганглиев, состоящих из трёх групп клеток, а также трёх связывающих ганглии комиссур. Вдоль тела Ph. caudatum нами выявлено до 10 пар иммуноре-активных к серотонину продольных нервных стволов. Кроме того, посредине центральной комиссуры, связывающей ганглии, нами выявлена серотонинер-гическая нервная клетка, которая отмечена также и у T. acanthiaevulgaris.
Анализ данных, полученных в отношении представителей цестод отр. Tetraphyllidea, а именно, T. acanthiaevulgaris и Ph. caudatum, показывает, что у обоих исследованных видов выявлена интенсивная иннервация ботридий нервными волокнами, а внутри ботридий обнаружен нервный плексус. Эти данные предполагают, что прикрепительная функция ботридий цестод находится под контролем серотонинергических, пептидергических, а также холи-нергических нервных структур. В центральной части сколекса в области апикальной присоски, нами обнаружен ряд мелких иммунореактивных к серото-нину нервных клеток, функция которых, вероятно, связана с регуляцией мышц присоски. У обеих видов обнаружены многочисленные комиссуры между продольными нервными стволами. Размеры иммунореактивных к серотонину клеток примерно одинаковые. Данные о наличии БМКРамидергических структур в нервной системе тетрафиллидных цестод в литературе отсутствуют и получены нами впервые.
Таким образом, полученные данные и литературный анализ свидетельствуют о том, что нейрональные сигнальные вещества - серотонин и нейропеп-тид БМИБамид присутствуют в нервной системе личинок и взрослых цестод различных таксономических групп, включая цестод отр. Tetraphyllidea.
Работа частично поддержана грантами Президента - РФ НШ - 2706.2012.4, МК-1093.2011.4 и РФФИ № 12-04-01051-а.
Литература
1. Бисерова Н.М. Нервная система цестод и амфилинид: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2004. - 43 с.
2. Бисерова Н.М., Корнева Ж.В. Онтогенетическое развитие нервной системы цестод и амфилинид // Зоология беспозвоночных. - 2006. - Т. 3, Вып. 2. - С. 157-184.
3. Шульц Р.С., Гвоздев Е.В. Основы общей гельминтологии. Т. I. - 492 с.
4. Поспехова Н.А., Шишов Б.А. Серотонинергические элементы нервной системы Microstomaganthus microskrjabini (Cestoda: Hymenolepididae) // Матер. науч. конф. «Простые нервные системы». - Казань, 1985. - С. 66-68.
5. Теренина Н.Б., Толстенков О.О., Густафссон М.К.С. Echinococcus multilocularis: аминергические, пептидергические, нитроксидергические элементы в нервной системе // Тр. Центра паразитол. ИПЭЭ РАН. - 2010. - Т. 46. - С. 270-276.
6. Biserova N., Terenina N., Gustafsson M., Reuter M. The nervous system of the pike tapeworm. An Immunocytochemical, ultrastructural and spectrofluorimetric study of Triaenophorus nodulosus (Cestoda: Pseudophyllidae) // Invertebrate Biology. - 1996. - V. 115, № 4. - P. 273-285.
7. Brownlee D.J.A., Fairweather I., Johnston C.F., Rogan M.T. Immunocytochemical localization of serotonin (5-HT) in the nervous system of the hydatid organism, Echinococcus granulosus (Cestoda, Cyclophyllidea) // Parasitology. - 1994. - V. 109. - P. 233-241.
8. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies of antibody production. I. // A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study for the hyperimmune rabbit // J. Exper. Med. - 1955. - V. 102. - P. 49-60.
9. Fairweather I., Macartney G.A., Johnston C.F. et al. Immunocytochemical demonstration of 5-hydroxytryptamine (serotonin) and vertebrate neuropeptides in the nervous system of excysted cysticercoid larvae of the rat tapeworm, Hymenolepis diminuta (Cestoda, Cyclophyllidea) // Parasitol. Res. - 1988. - V. 74, № 4. - P. 371-379.
10. Fairweather I., Mahendrasingam S., Johnston C.F. et al. An ontogenetic study of the cholinergic and serotoninergic nervous systems in Trilocularia acanthiaevulgaris (Cestoda, Tetraphyllidea) // Parasitol. Res. -1990. - V. 76. - P. 487-496.
11. Fairweather I., Mcmullan M.T., Johnston C.F. et al. Serotoninergic and peptidergic nerve elements in the protoscolex of Echinococcus granulosus (Cestoda, Cyclophyllidea) // Parasitol. Res. - 1994. - V. 80. - P. 649-656.
12. Gustafsson M.K.S., Wikgren M.C. Peptidergic and aminergic neurons in adults Diphyllobothrium dendriticum, Nitzsh, 1824, (Cestoda, Pseudophyllidea) // Z. Parasitenkd. - 1981. - V. 64. - P. 124-134.
13. Gustafsson M.K.S., Wikgren M.C., Karhi T.J., Schot L.P.C. Immunocytochemical demonstration of neuropeptides and serotonin in the tapeworm Diphyllobothrium dendriticum // Cell Tissue Res. - 1985. - V. 240, № 2. -P. 255-260.
14. Gustafsson M.K.S., Hans-Peter Fagerholm, Halton D. W. et al. Neuropeptides and serotonin in the Cestode, Proteocephalus exiguus: An Immunocytochemical Study // Intern. J. Parasitol. - 1995. - V. 25, № 6. - P. 673682.
15. Gustafsson M.K.S., Terenina N.B., Bessonov A.S. et al. The aminergic and peptidergic nervous system in Echinococcus multilocularis protoscolex // Proc. of ICOPA X. - Vancouver, Canada, 2002. - P. 369-373.
16. Halton D.W., Maule A.G. Flatworm nerve-muscle: structural and functional analysis // Can. J. Zoology. - 2004. - V. 82. - P. 316-333.
17. Hart J.L. Studies on the nervous system of tetrathyridia (Cestoda: Mesocestoides) // J. Parasitol. - 1967. - V. 53, № 5. - P. 1032-1039.
18. Hrckova G., Halton D.W., Maule A.G. et al. Neuropeptide F-immunoreactivity in the tetrathyridium of Mesocestoides corti (Cestoda: Cyclophyllidea) // Parasitol. Res. - 1993. - V. 79. - P. 690-695.
19. Hrckova G., Halton D.W., Maule A.G. et al. 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) - immunoreactivity in the nervous system of Mesocestoides corti tetrathyridia (Cestoda: Cyclophyllidea) // J. Parasitol. - 1994. - V. 80, № 1. - P. 144-148.
20. Maule A.G., Halton D.W., Shaw C., Johnston C.F. The cholinergic, sero-toninergic and peptidergic components of the nervous system of Moniezia expansa (Cestoda, Cyclophyllidea) // Parasitology. - 1993. - V. 106. - P. 429-440.
21. McKay D.M., Fairweather I., Johnston C.F. et al. Immunocytochemical and radioimmunometrical demonstration of serotonin- and neuropeptide-immunoreactivities in the adult rat tapeworm, Hymenolepis diminuta (Cestoda, Cyclophyllidea) // Parasitology. - 1991. - V. 103, № 2. - P. 275-289.
22. Rees G. The anatomy of Acanthobothrium coronatum (Rud) (Cestoda) from Raja batis L. // Parasitology. - 1943. - V. 35, № 1/2. P. 1-10.
23. Rees G. The anatomy of Phyllobothrium dohrnii (OERLEY) from Hexantus griseus (GMELIN) // Parasitology. - 1946. - V. 37. - P. 163-171.
24. Rees G. Nerve cells in Acanthobothrium coronatum (Rud) (Cestoda:Tetraphyllidea) // Parasitology. - 1966 - V. 56. - P. 45-54.
25. Shield J.M. Dipilidium caninum, Echinococcus granulosus and Hydatigera taeniaeformis: histochemical identification of cholinesterases // Exp. Parasitol. - 1967. - V. 25. - P. 217-231.
26. TereninaN.B., GustafssonM.K.S., ReuterM. Serotonin, reserpine and motility in Mesocestoides tetrathyridia. An experimental spectrofluorimetry and im-munocytochemistry study // Parasitol. Res. - 1995. - V. 81. - P. 677-683.
27. Terenina N.B., Poddubnaya L.G., Tolstenkov O.O., Gustafsson M.K. An immunocytochemical, histochemical and ultrastructural study of the nervous system of the tapeworm Cyathocephalus truncatus (Cestoda, Spathebothriidea) // Parasitol. Res. - 2009. - V.104, № 2. - P. 267-75.
28. Wahlberg M.H. The distribution of F-actin during the development of Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda) // Cell and Tissue Res. - 1998. -V. 291. -P.561-570.
29. Wikgren M.C. The nervous system of early larval stages of the cestode Diphyllobothrium dendriticum // Acta Zoologica. - 1986. - V. 67, № 3. - P. 155163.
Serotoninergic and peptidergic components in the nervous system of Phyllobothrium caudatum Zschokke and Heitz, 1914 (Cestoda, Tetraphyllidea)
plerocercoid.
N.B. Terenina, O.O. Tolstenkov, M.K.S. Gustafsson
The neuronal signal compounds - serotonin and neuropeptide FMRFamide were detected in the nervous system of Phyllobothrium caudatum plerocercoid by immunocytochermically. Neurotransmitters investigated were revealed in the brain ganglia, brain commissures, longitudinal nerve chords and commissures between them. The presence of bothridia innervation suggests the control of muscle activity of bothridia by serotoninergic and peptidergic components of nerve system.
Keywords: cestodes, nervous system, neuromediators, serotonin, neuropep-tides.
