CC BY
13VETERINARY SCIENCES
SEROLOGICAL DIAGNOSTIC OF REOVIRUS AND METAPNEUMOVIRUS INFECTIONS IN
POULTRY
Ivleva O.
Assistant (post-graduate student) of Infectology, Quality and Safety Department of AIC, Luhansk National
Agrarian University (Kharkiv) Ukraine
Ryabinin S.
Scientific fellow, feed quality laboratory and veterinary safety ofpoultry products, State Research Station of Poultry Industry of the National Academy of Agrarian Sciences, Kharkiv, Ukraine
Nalyvaiko L.
Doctor of Veterinary Sciences, Senior Researcher, Head of Infectology Department, Quality and Safety of
AIC Products, Luhansk National Agrarian University (Kharkiv) Ukraine
СЕРОЛОГ1ЧНА Д1АГНОСТИКА РЕОВ1РУСНО1 ТА МЕТАПНЕВМОВ1РУСНО1 1НФЕКЦ1Й
ПТИЦ1
Ивлева О.В.
ассистент (аспирант) кафедры инфектологии, качества и безопасности продукции АПК, Луганский национальный аграрный университет (г. Харьков), Украина
Рябинин С. В
научный сотрудник, лаборатории качества кормов и ветеринарной безопасности продукции птицеводства, Государственная исследовательская станция птицеводства Национальной академии аграрных
наук, г.. Харьков, Украина Наливайко Л. И.
доктор ветеринарных наук, старшый научный сотрудник, заведующий кафедры инфектологии, качества и безопасности продукции АПК, Луганский национальный аграный университет
(г. Харьков), Украина
Abstract
Rapid and quality diagnostic is crucial for successful reovirus and metapneumovirus infections control. Therefore, we have developed a technology for domestic production of an ELISA test-system for the diagnostic of these two infections. Two methods for the purification and concentration of ARV and MPV infections antigens were tested. The comparative analysis of the purified antigens suitability for the sensitization of ELISA plates was conducted. Stable antigen was obtained using ultrasound.
Аннотация
Для успешной борьбы з реовирусной (АРВ) и метапневмовирусной (МПВ) инфекциями необходима быстрая и качественная диагностика. Поэтому нами была разработана технология отечественной ИФА тест-системы для двух инфекций. Испытано два метода очистки и концентрирования антигенов АРВ и МПВ инфекций птицы. Проведен сравнительный анализ очистки антигенов при сенсибилизации их на планшете. Стабильный антиген был получен при использовании ультразвука.
Keywords: reovirus, metapneumovirus, infection, poultry, diagnostic, purification and concentration, ELISA
Ключевые слова: реовирус, метапневмовирус, инфекция, птица, диагностика, очистка и концентрирование, ИФА-метод.
В последнее время импорт высокопродуктивных кроссов птицы в Украине привел к распространению в фермерских хозяйствах ранее неизвестных вирусных болезней птицы - метапневмовирусной и реовирусной инфекций. Последняя влияет иммуно-депрессивно на птицу, и ее часто диагностируют совместно с другими патогенами болезней, которые вызывают патологические изменения у птицы. Не исключено смешанное течение МПВ и АРВ инфекций, которые вызывают респираторно-желу-дочные заболевания, а их течение в субклинической, латентной и ассоциированной формах затрудняет проведение лабораторно-диагностических и профилактических мероприятий.
Реовирусная инфекция - высококонтагиозное заболевания молодняка сельскохозяйственной и си-нантропной птицы всех видов и направлений продуктивности, которая протекает в латентно-перси-стентный форме и характеризуется респираторными и кишечными заболеваниями.
Метапневмовирусна инфекция - респираторное заболевание, характеризующееся назальными выделениями, насморком, тяжелым дыханием, которое сопровождается хрипами, воспалением верхних дыхательных путей и инфраорбитальных синусов [1, с. 281].
Заболевание АРВИ впервые было зарегистрировано в 1972 году, а МПВИ - 2008 году у индюков, завезенных в страну из Европы [2, с. 41; 3,с. 41; 4,
с. 28; 5, с. 37]. Течение инфекционных болезней в скрытой или ассоциированной формах затрудняло проведение как диагностических, так и профилактических мероприятий.
Для контроля напряженности иммунитета против двух инфекций у привитой птицы лаборатории ветеринарной медицины используют зарегистрированные в Украине диагностические ИФА-наборы фирм «BioChek» (Нидерланды) и «IDEXX» (США) [6, с. 282; 7, 129], стоимость которых в Украине достигает 20 тыс. грн и более. Отечественные же диагностические тест-системы - отсутствуют.
В 2012 году в Институте птицеводства НААН Украины была разработана тест-система на основе ИФА метода с использованием отечественного штамма, изолированного от цыплят-бройлеров [8, с. 203]. Учитывая очевидную перспективность данного метода, разработка отечественной ИФА тест-системы для выявления антител к метапневмови-русу птицы в сыворотках крови кур и индеек на сегодня является актуальной.
Материалы и методы исследований. В исследованиях были использованы местные штаммы: Br-06 реовируса (выделен в ИП НААН от цыплят-бройлеров в 2006 г.), и PVT-09/B метапневмови-руса (выделен от индюков). Штаммы идентифицированы во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (г. Владимир, РФ) и хранятся в отделе профилактики болезней птицы ИП НААН в лиофильно высушенном состоянии при температуре минус 20 °С. Использовали штаммы с инфекционным титром 6,0 lg ТЦД50/см3 (реовирус) и 4,33 lg ТЦД 50/см3 (метапенвмовирус).
Микроскопию вирусов проводили электронным микроскопом ПЭМ - 125К при ускоряющем напряжении 75 kV, имеющий в своем составе систему съемки и анализа изображения САИ - 01А на основе CCD камеры DX - 2 в Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).
Электронная микроскопия осуществлялась методом негативного контрастирования [2].
Результаты исследований. Разработка ИФА тест-системы для двух инфекций (МПВ и АРВ) осуществлялась по одной схеме. Так, с целью освобождения от клеточного дебриса, вирусы замораживали на стенках роллерных флаконов при -20 °С с последующим оттаиванием при 4 °С, трижды. В дальнейшем их инактивировали этиленимином в концентрации 0,1% в течение 24 часов при температуре 37,5 °С. Дальнейшая очистка и концентрирование проводили по двум методикам:
Первая методика. Предварительная очистка проводилось с использованием хлороформа (20% от общего объема) и низкоскоростного центрифугирования (2000 g 15-20 минут). Далее супернатант обрабатывали 7% полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000), осадок собирали центрифугированием и ресуспен-зировали в TSE - буфере. На завершающем этапе вирус осаждали через раствор 30% - й сахарозы при 70000 g в ультрацентрифуге течение 3 годин, полученный осадок ресуспензировали в TSE - буфере.
Вторая методика отличалась от первой тем, что на этапе предварительной очистки использовали обработку вируссодержащего материала 7% полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000), после чего материал обрабатывали ультразвуком (22 кГц).
Завершающий этап очистки вируса не отличался от первой методики. Полученные антигены сенсибилизировали на планшеты в концентрации 0,02-0,05 мг/мл и проводили непрямой вариант ИФА с положительными референтными сыворотками титр которых составлял не ниже 1: 3200 (АРВ) и 1: 3000 (МПВ), что указывает на достаточную активность антигена. В специфических гетерологиче-ских сыворотках, входящих в состав коммерческих наборов фирмы BioChek и «Синко» ВНИИЗЖ (для определения антител к инфекционному бронхиту кур, синдрому снижения яйценоскости, микоплаз-мозу, ньюкаслской болезни, болезни Гамборо) не выявлено положительных и сомнительных титров к изучаемым инфекциям, и указывает на специфичность полученных антигенов по отношению к гомологичным антителам.
Оценка стабильности антигенов, очищенных двумя методами, при хранении на планшетах, показала различные результаты. Проверку проводили через каждые 7 дней в течение 10 недель в условиях искусственного старения при 37° С. Активность изучаемых антигенов - очищенного и концентрированного с использованием ультразвука, в течение исследуемого периода не снижалась. При использовании в качестве антигена для сенсибилизации планшетов препарата, полученного путем очистки хлороформом, уже после 4-й недели хранения наблюдали значительное снижение активности в ИФА. С помощью программы Statistica (Correlation matrices) построена калибровочная кривая и выведено уравнение линейной регрессии для расчета логарифмического значения титров сывороток и формула расчета титров антител в сыворотках кур при тестировании их в одном разведении. Формула расчета титров антител в сыворотках птицы при тестировании их в одном разведении равна: для АРВИ - Lg T = 3,5135 + 1,0377 * lg (S / P400) для МПВИ - Lg T = 3,7981 + 0,8524 * lg ( S / P400).
Благодаря разработанной тест-системы ИФА для определения антител к АРВИ и МПВИ можно проводить эпизоотологический мониторинг данных заболеваний и контроль поствакцинального иммунитета. Реакция является количественной и простой в использовании. Исследованные сыворотки предварительно прошли тестирование в ИФА набором фирмы «BioChek» (Нидерланды). По сравнению с зарубежными аналогами отечественный ИФА-диагностикум будет дешевле в 4 раза.
Вывод. При очистке антигенов реовирусной и метапневмовирусной инфекций птицы при использовании ультразвука получены высокостабильные препараты концентрированных антигенов, которые были пригодны для конструирования наборов ИФА с целью выявления антител к возбудителям АРВИ и МПВИ в сыворотках крови кур и индеек.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ:
1. Борисова И. А., Старов С.К. Пневмовирус-ная инфекция птиц. Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2006. Т. 4. С. 281-296.
2. Абдильазиз Ф. Изучение биологических свойств реовирусов, выделенных от кур и индеек. Ветеринария. Республиканский межведомственный тематический научный сборник. выпуск 59. Киев «Урожай», 1984. С.41-43.
3. Герман 1.В., В. В. Герман. Вивчення вiруле-нтних властивостей авiреовiрусiв, iзольованих ввд курей-несучок, бройлерiв та гусенят. Ветеринарна медицина Украни, 2002. №7. С.37-38.
4. Алиев А. С. Реовирусная инфекция птиц. Ветеринария с/х животных, 2005. №12. С.28-32.
5. Nalivayko L.I., Nikolaenko Yu.Yu., Bondarenko A.L., Ryabeka D.A. Yepizootologichne obstezhennya ptakhivnichikh gospodarstv Ukraini shchodo metapnevmovirusnoi' infektsii' . Veterinarna meditsina Ukraini, 2011. № 1. Р. 9-11.
6. Chettle N. J., Wyeth P.J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rinotracheestis. Br. Vet. J., 1988. 144. Р. 282-287.
7. Hung J.L., Liam C.K., Ming H.L. Development of an ELISA for detection of antibodies to avian reovirus in chickens. Journal of Virological Methods, 2002. P. 129-138.
8. Рябшш С. В. Очищення та концентрування антигену реовiрусноi шфекцп птищ для конструювання дiагностикуму 1ФА. Проблеми зоошженери та ветеринарно! медицини. Харыв, 2011. №23. С.203 -205.
