CC BY
18
УДК / UDC 634.722:632.111.8:[546.23+631.811.98]
СЕЛЕН И КИНЕТИН КАК МОДИФИКАТОРЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ СМОРОДИНЫ КРАСНОЙ В УСЛОВИЯХ ГИПЕРТЕРМИИ
SELENIUM AND KINETIN AS A MODIFICATOR OF ANTIOXIDANT SYSTEM OF CURRENT RED IN HYPERTHERMIA CONDITIONS
Прудников П.С.*, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Prudnikov P.S., Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher Кривушина Д. А., аспирант Krivushina D.A., Postgraduate Student Голяева О.Д., кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник Golyaeva O.D., Candidate of Agricultural Sciences, Leading Researcher ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орловская область, Россия Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel Region, Russia
*E-mail: prudnicov@inbox.ru
Высокотемпературный стресс является одним из значимых абиотических факторов, влияющих на продуктивность растений. Под влиянием гипертермии изменяется скорость химических реакций, происходит интенсификация свободно-радикальных процессов, отмечается изменение структуры белковых молекул, увеличивается проницаемость мембран, нарушается взаимодействие между липидами и белками, комплементарными цепями нуклеиновых кислот, гормонами и их рецепторами. Выживаемость организма зависит от эффективности его защитных систем. Антиоксидантная система является ключевой в защите растений от неблагоприятных факторов среды. Из-за увеличения частоты и напряженности абиотических стрессоров возникает необходимость в мобилизации активности антиоксидантной системы. Цель работы заключалась в изучении действия антиоксиданта селена и регулятора роста кинетина на активность антиоксидантной системы смородины красной и интенсивность перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ) при действии гипертермии. Объектом исследования служил сорт смородины красной Дана из генетической коллекции ФГБНУ ВНИИСПК. Показано, что селен и кинетин при их совместном и раздельном применении в условиях гипертермии интенсифицируют активность фермента каталазы в 1,46-2,36 раза, против 1,36 в контроле. На фоне более высокой активности каталазы по сравнению с контролем, в вариантах с обработками под влиянием стресса, отмечено незначительное увеличение уровня антиоксиданта пролина на 7,6-20,7%, тогда как в контроле на 41,0%. Пролин накапливается под воздействием стресса, для нейтрализации активных форм кислорода. Одна из причин его накопления - недостаточная активность ферментных систем. Изменения активности антиоксидантной системы под влиянием обработок в условиях гипертермии снизили уровень накопления пероксида водорода в 1,2-1,5 раза и сдерживали развитие ПОЛ. Таким образом, показано, что на фоне модификации антиоксидантной активности под воздействием кинетина и селена в условиях гипертермии, отмечается снижение в клетках и тканях листа уровня активных форм кислорода и их негативного действия на липопероксидацию мембран.
Ключевые слова: смородина красная, селен, кинетин, пролин, перекисное окисление липидов, перекись водорода, каталаза.
High-temperature stress is one of the significant abiotic factors affecting plant productivity. Under the influence of hyperthermia, the rate of chemical reactions changes, the intensification of free-radical processes occurs, the change in the structure of protein molecules is noted, the permeability of membranes increases, the interaction between lipids and proteins,
complementary chains of nucleic acids, hormones and their receptors are disturbed. The survival of an organism depends on the effectiveness of its protective systems. Antioxidant system is the main system in protecting plants from adverse environmental factors. Due to the increase in the frequency and intensity of abiotic stressors, a need to mobilize the activity of the antioxidant system arises. The aim of the work was investigation of selenium antioxidant and kinetin growth regulator effect on the activity of red currant antioxidant system and the intensity of membrane lipid peroxidation (LPO) under the action of hyperthermia. The object of study was a red currant variety Dana from the genetic collection of the Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding. It is shown that selenium and kinetin in their combined and separate use in hyperthermia intensify the activity of the catalase enzyme in 1.46-2.36 times, against 1.36 in controls. On the background of a higher catalase activity compared to the control, in the variants with treatments under the influence of stress, a slight increase in the level of the antioxidant proline was noted by 7.6-20.7%, whereas in the control by 41.0%. Proline is accumulated under the influence of stress, to neutralize reactive oxygen species. One of the reasons for its accumulation is insufficient activity of enzyme systems. The changes in the activity of the antioxidant system under the influence of treatments in hyperthermia reduced the level of hydrogen peroxide accumulation in 1.2-1.5 times and hampered the PML development. Thus, it is shown that on the background of modification of antioxidant activity under the influence of kinetin and selenium in hyperthermia there is a decrease in the level of reactive oxygen forms in the cells and tissues of the leaf and their negative effect on membrane lipoperoxidation.
Key words: red currant, selenium, kinetin, proline, lipid peroxidation, hydrogen peroxide, catalase.
Введение. Устойчивость растений к факторам стресса представляет собой комплекс адаптивных реакций, выработанных в процессе эволюции в результате приспособления организма к изменяющимся условиям среды [1, 2]. Высокотемпературный стресс или гипертермия является одним из значимых абиотических факторов, влияющих на урожайность сельскохозяйственных культур. Повышение температуры особенно опасно для растений при сильной освещенности. Гипертермия воздействует на скорость диффузии и тем самым влияет на скорость химических реакций, вызывает изменение структуры белковых молекул, увеличивает проницаемость мембран, нарушает взаимодействие между липидами и белками, комплементарными цепями нуклеиновых кислот, гормонами и их рецепторами и т.д. [3]. В настоящее время особое внимание уделяется вопросу интенсивности образования и нейтрализации активных форм кислорода посредством функционирования антиоксидантной системы защиты, являющейся ключевой в формировании устойчивости растений [1]. Существует несколько способов экзогенного воздействия, способных оказывать стимулирующий эффект на компоненты антиоксидантной системы защиты [4].
Одним из таких путей влияния является использование протекторных веществ, проявляющих интенсифицирующее действие на компоненты защитной системы. Особый интерес представляет обогащение растений микроэлементами, которые входят в состав реакционных центров антиоксидантных ферментов: медь, цинк, селен, железо и т.д. Так, железо входит в состав каталазы и пероксидазы, медь находится в аскорбинатоксидазе, дифенолоксидазе и т.д. [3]. Селен является ключевым элементом глутатионпероксидазы и глутатион^-трансферазы, принимающих участие в поддержании перекисного гомеостаза [5]. Физиолого-биохимические функции большинства микроэлементов, за исключением селена, в жизни растений изучены достаточно подробно. Значение селена исследовано в основном на животных и человеке, что уже позволило разработать и использовать его
препараты в медицине [6-8]. Крайне мало работ по влиянию селена на антиоксидантную систему защиты растительных организмов [4, 9-11].
Другим способом повышения устойчивости является применение регуляторов роста гормональной природы. Показано, что использование фитогормонов способствует более полной реализации адаптационного потенциала растений в условиях действия стресса [12]. Вместе с тем исследования, касающиеся защитного действия цитокининов, и в частности кинетина, на растения смородины красной в условиях действия гипертермии, отсутствуют. Кроме того, отсутствуют сведения и о функциональной сопряженности антиоксиданта селена и регулятора роста кинетина на антиоксидантную систему защиты растений на фоне действия высокой температуры.
В связи с этим целью работы явилось изучение влияния антиоксиданта селена и регулятора роста кинетина на активность компонентов антиоксидантной системы и перекисного окисления мембранных липидов при действии гипертермии.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории физиологии устойчивости плодовых растений ФГБНУ ВНИИСПК.
Для изучения влияния селена и кинетина проводили обработку растений смородины красной (сорт Дана, селекции ВНИИСПК) раствором селенита натрия (5,78-10-5М) и раствором кинетина (1,2-10-4М) как при совместном, так и раздельном применении через две недели после цветения. Всего проведено три обработки, каждая из которых повторялась через 10 дней. Контроль - обработка растений водой. Гипертермию создавали путем помещения изолированных листьев растений смородины красной в емкости с водой и дальнейшим воздействием высокой температурой 50°С в термостате Binder BD23 (Германия). Контроль - изолированные листья растений в емкости с водой при нормальных условиях (н.у.). Время экспозиции 1 ч.
О работе антиоксидантной системы, после окончания действия гипертермии, судили по накоплению в листьях свободного пролина, анализ которого проводился с помощью нингидринового реактива [13] и активности антиоксидантного фермента каталазы - с помощью учета количества кислорода, образующегося в результате разложения перекиси водорода [14]. Определение интенсивности перекисного окисления мембранных липидов проводили путем количественного анализа малонового диальдегида (МДА) на основе реакции его взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой [15]. Содержание активных форм кислорода устанавливали на примере определения уровня пероксида водорода на основе качественной реакции с тетрахлористым титаном [16]. Все анализы проводили на спектрофотометре BioRad SmartSpec Plus (США). Повторность опыта 5-кратная. Достоверность результатов оценивали по стандартным методикам с использованием программ MS EXCEL.
Результаты и обсуждение. Показано, что при действии гипертермии 50°С в течение 1 ч в листьях контрольных растений происходило значительное развитие перекисного окисления мембранных липидов. Так, у контрольных растений уровень содержания МДА увеличился на 70% по сравнению с листьями, находящимися при нормальных условиях, что свидетельствует о значительном структурно-функциональном повреждении клеток (рис. 1).
_о
о
35 30 25 20 15 10 5 0
□ Н.У. □ Гипертермия
Контроль
Селен
Кинетин
Селен+кинетин
Рисунок 1 - Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содержание МДА в листьях смородины красной в условиях
гипертермии
Обработка растений растворами селенита натрия и кинетина, на фоне действия стрессора, оказывала протекторный эффект и снижала уровень липопероксидации в тканях. Так, при обогащении растений только антиоксидантом селеном степень ПОЛ возрастала на 39%, в варианте при обработке фитогормоном кинетином на 29%. Интересно отметить, что в большей степени положительное действие на снижение ПОЛ оказала обработка растений при использовании совместного раствора кинетина и селенита натрия. Уровень МДА в листьях растений в варианте Селен+кинетин увеличивался на 14%. Как видно, использование совместного раствора антиоксиданта селена и фитогормона кинетина усилили положительный эффект друг друга по снижению процессов липопероксидации, т.е. в их физиологическом взаимодействии прослеживался синергизм. В литературе встречаются работы, в которых показана функциональная сопряженность между гормональной и антиоксидантной системами при формировании ответа растений на действие негативных факторов среды [17].
Интенсификация перекисного окисления липидов под воздействием гипертермии, видимо, связана с увеличением образования активных форм кислорода. Так, в контрольных растениях при действии высокой температуры количество перекиси водорода в тканях листа увеличилось в 1,78 раза по сравнению с контрольными растениями при н.у. (рис. 2).
□ Н.У. □ Гипертермия
3,5
3,0
ЕЦ 2,5
О
2,0
л 1,5
о
СЧ X 1,0
0,5
0,0
Контроль Селен Кинетин Селен+кинетин
Рисунок 2 - Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содержание перекиси водорода в листьях смородины
красной в условиях гипертермии
В растениях, обогащенных селеном, уровень Н2О2 увеличился в 1,20 раза, в варианте с кинетином - в 1,50 раза, а при совместном использовании селена и кинетина в 1,33 раза против соответствующих вариантов при н.у. Значительное снижение уровня перекиси водорода селеном, возможно, связано с активацией ферментов, утилизирующих Н2О2. Так, определение активности каталазы показало, что селен существенно в 2,36 раза интенсифицировал работу фермента (рис. 3). В вариантах с кинетином активность каталазы возросла в 1,75 раза, а при совместном использовании селена и кинетина - в 1,46 раза. При этом в контроле активность фермента возросла в 1,36 раза.
со
го ц
ГО х I- ^
го ^
О Ц со
(М
14 12 10 8 6 4 2 0
□ Н.У.
□ Гипертермия
Кинетин
Селен+кинетин
Контроль Селен
Рисунок 3 - Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на активность антиоксидантного фермента каталазы в листьях смородины красной в условиях гипертермии
Наряду с этим известно, что в состав пероксидаз - ферментов, также утилизирующих перекись водорода, входит изофермент глутатионпероксидаза, содержащая в своем составе четыре атома селена [18]. Кроме того, селен может замещать атомы серы в низкомолекулярном антиоксиданте цистеине с образованием селеноцистеина, более физиологически активного вещества.
Тем не менее, на фоне низкого увеличения количества перекиси водорода при стрессе, в растениях, обогащенных селеном, без совместного использования кинетина, отмечается наибольший среди вариантов с обработками уровень ПОЛ, что может быть связано с активацией данным микроэлементом фермента липоксигеназы, также окисляющей мембранные липиды. Известно, что фосфолипидгидопероксид-глутатионпероксидаза (РНОРх), в отличие от остальных форм глутаионпероксидаз (сОРх, дЮРх, рОРх), содержит один атом селена и может модулировать активность липоксигеназ [19]. Таким образом, в варианте при совместном использовании кинетина и селенита натрия, селен значительно усилил действие фитогормона в снижении уровня перекиси водорода, а кинетин, возможно, снизил активизирующее действие микроэлемента на активность липоксигеназ. Именно поэтому в варианте селен+кинетин под влиянием стрессора отмечается незначительная интенсификация перекисного окисления мембранных липидов.
Высокий уровень окислительного стресса, вызванный гипертермией, способствовал увеличению в тканях листа содержания свободного пролина -низкомолекулярного антиоксиданта. Как правило, пролин накапливается под воздействием стресса, для нейтрализации активных форм кислорода. Одна из причин его накопления - недостаточная активность ферментных систем [20]. В связи с этим, чем интенсивней он накапливается, тем сильнее влияние стресса на растение.
Увеличение количества пролина зависело от степени интенсивности ПОЛ по вариантам. При наиболее интенсивном накоплении количества МДА в листьях контрольных растениях, отмечалось и наибольшее среди вариантов увеличение содержания пролина (накопление аминокислоты увеличивалось на 41,0% против контроля при н.у.) (рис. 4).
о d
35 30 25 20 15 10 5 0
□ Н.У. □ Гипертермия
Контроль Селен Кинетин Селен+кинетин
Рисунок 4 - Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содержание свободного пролина в листьях смородины
красной в условиях гипертермии
В варианте с селеном, где уровень ПОЛ увеличился на 39,0%, содержание пролина возросло на 20,7%, в варианте с Кинетином - на 10,0%, Кинетин+селен - на 7,6%. Коэффициент корреляции между уровнем интенсификации ПОЛ и накоплением пролина составил 0,89.
Выводы. Таким образом, показано, что на фоне модификации антиоксидантной активности под воздействием обработок смородины красной раствором кинетина и антиоксиданта селена, при их раздельном и совместном использовании, в условиях действия гипертермии, отмечается значительное снижение в клетках и тканях листа уровня активных форм кислорода и их негативного действия на липопероксидацию мембран.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Лукаткин А.С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс. Саранск: Мордов. ун-т, 2002. 208 с.
2. Прудников П.С., Гуляева А.А. Влияние гипертермии на гормональную систему и антиоксидантный статус Prunus Cerarus L. // Современное садоводство. 2015. № 3 (15). С. 37-44.
3. Кузнецов В.В. Дмитриева Г.А. Физиология растений. М.: Высшая школа, 2005. 735 с.
4. Прудников П.С., Кривушина Д.А., Голяева О.Д. Влияние селена на активность антиоксидантной системы в условиях гипертермии и некоторые звенья продукционного процесса смородины красной // Плодоводство и ягодоводство России. 2018. Т. 53. С. 176-182.
5. Schoene N.W., Morris V.C., Levander O.A. Effects of selenium deficiency on aggregation and thromboxane formation in rat platelets // Fed. Proc. 1984. V. 43. P. 477-487.
6. Chy F.F., Doroshow J.H., Esworthy P.S. Expression, characterization and tissue distribution of a new cellular selenium - dependent glutathione peroxidase GSHPx - GI // Boil. Chem. 1993. V. 268. P. 2571-2576.
7. Gamble S.C., Wiseman A., Goldfarb R.C. Selenium - dependent glutathione peroxidase and other selenoproteins - their synthesis and biochemical role // Chem. Techn. Biotechn. 1997. V. 68. P. 113-134.
8. Gantbe H.E. Selenium metabolism, selenoproteins and mechanism of cancer prevention: complexities with thioredoxin reductase // Carcinogenesis. 1999. V.20. № 9. P. 1657-1660.
9. Вихрева B.A. Влияние селена на рост, развитие и адаптивный потенциал козлятника восточного (Galega orientalis): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2001. 28 с.
10. Кузнецов Вас. В. Защитное действие селена при адаптации растений пшеницы к условиям засухи: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.: МСХА, 2004. 21с.
11. Солдатов С.А. Влияние селената натрия на рост, развитие и проявление пола у двудомных растений конопли (Cannabis sativa L.J: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2005. 28 с.
12. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160 с.
13. Bates L. S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water-stress studies // Plant and Soil. 1973. Vol. 39. P. 205-207.
14. Третьяков H.H. Практикум по физиологии растений. M.: Агропромиздат, 1990. 271 с.
15. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / В кн.: В.Н. Ореховича (ред.) Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 66-68.
16. Kumar G.N.M., Knowles N.R. Changes in lipid peroxidation and lipolitic and freeradical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanumtuberosum) seed-tubers // Plant. Physiol. 1993. Vol. 102. P. 115-124.
17. Веселов А.П. Гормональная и антиоксидантная системы при ответе растений на тепловой шок: автореф. дис. ... доктора биол. наук. М., 2001. 39 с.
18. Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: a selenoglyprotein distinet from the know cellular enzyme / K. Takahashi, N Avissar, J. Whitan, H. Cohen // Arch. Biochem. Biophys. 1987. Vol. 256. P. 677-686.
19. Ursini F., Maiorino M., Gregolin C. The selenoenzyme phospholipids hydroperoxide glutathione peroxidase // Biochem. Biophys. Acta. 1985. V. 839. P. 62-70.
20. Alia S., Saradhi P., Mohanty P. Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage // J. Photochem photobiol. 1997. T. 38. P. 253-257.
