CC BY
373
и 4-я степени тяжести — показатели высокой вероятности летального исхода [6].
Выводы. Аномалия Эбштейна — редкий, чаще спорадический врожденный порок сердца, характеризуется апикальным смещением правого атриовентрикулярного кольца. Клиническая симптоматика зависит от сте-
Литература
1. Cherry C., Debord S., Mustapha-Nadler N. Ebstein's anomaly: a complex congenital heart defect // AORN J. 2009. Vol. 89. № 6. P. 1098-1110.
2. Attenhofer J., Connolly H., Edwards W., et al. Ebstein's anomaly — review of a multifac-eted congenital cardiac condition // Swiss Med. Wkly. 2005. Vol. 135. № 19-20. P. 269-281.
3. Stamm E., Drose J. The fetal heart // Diagnostic Ultrasound / ed. by C. Rumack, D. Levine. 5th ed. 2018. P. 1270-1303.
4. Lemieux J., Edelman E., Stricharzt G., et al. Normal cardiac structure and function // Patho-physiology of Heart Disease / ed. by L. Lilly. 6th ed. 2016. P. 1-25.
5. Nanda N., Gramiac R. Clinical Echocardiography. Saint Louis: Mosby, 1978. 451 p.
6. O'Leary P., Dearani J., Anderson R., et al. Diseases of the Tricuspid Valve // Anderson's Pediatric Cardiology / ed. by G. Wernovsky, R. Anderson, K. Kumar, et al. 4th ed. 2020. P. 585-605.
пени смещения трехстворчатого клапана. Решающим для диагноза является ультразвуковое исследование. В описании исследования должны быть указаны анатомо-функ-циональные характеристики камер сердца, перегородок и клапанного аппарата.
References
1. Cherry C, Debord S, Mustapha-Nadler N. Ebstein's anomaly: a complex congenital heart defect. AORN. 2009;89(6):1098-1110.
2. Attenhofer J, Connolly H, Edwards W, et al. Ebstein's anomaly — review of a multifaceted congenital cardiac condition. Swiss Med. Wkly. 2005;135(19-20):269-281.
3. Stamm E, Drose J. The fetal Heart. In: Rumack C, Levine D, editors. Diagnostic Ultrasound. 5th ed. 2018:1270-1303.
4. Lemieux J, Edelman E, Stricharzt G, et al. Normal cardiac Structure and Function. In: Lilly L., editor. Pathophysiology of Heart Disease. 6th ed. 2016:1-25.
5. Nanda N, Gramiac R. Clinical Echocardiography. Saint Louis: Mosby; 1978. 451 p.
6. O'Leary P, Dearani J, Anderson R, et al. Diseases of the Tricuspid Valve. In: Wernovsky G, Anderson R, Kumar K, et al., editors. Anderson's Pediatric Cardiology. 4th ed. 2020:585-605.
Источник финансирования: автор заявляет об отсутствии финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов: автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
УДК 577.21+616 ББК 28.04.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ: МЕТОДЫ И ПРИНЦИПЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Иванов Е. А.1, Рыжкова А. И.1, Пешикова М. В.2, Шлепотина Н. М.2
1 ГБУЗ ЧОДКБ, г. Челябинск, Россия
2 ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск, Россия
Аннотация. Молекулярная диагностика на сегодняшний день является одним из самых быстро развивающихся и перспективных направлений биотехнологии. Важное место среди методов молекулярно-генетического анализа занимает секвенирование, которое все больше находит применение в самых различных областях медицины: генетике, онкологии, микробиологии, судебной медицине и др. Секвенированием нуклеиновых кислот называют определение их
первичной нуклеотидной последовательности. Стремительное развитие технологий со временем значительно расширило спектр методик секвенирования. Методы секвенирования условно подразделяются на классические, новые («второго» поколения) и новейшие («третьего» поколения). Наиболее доступным сейчас является экзомное и таргетное секвенирование. В данной статье мы предлагаем вашему вниманию обзор различных методов и принципов секвенирования. Понимание подходов к осуществлению разных методов секвенирования представляет интерес в рамках фундаментальной медицинской науки и клинической практики.
Ключевые слова: секвенирование, экзомное секвенирование, таргетное секвенирование, классические методы секвенирования, новые методы секвенирования, новейшие методы секвенирования
Контакты: Иванов Евгений Александрович: [email protected]; Рыжкова Анна Ивановна: [email protected]; Пешикова Маргарита Валентиновна: [email protected]; Шлепотина Нина Михайловна: [email protected]
SEQUENCING OF NUCLEIC ACIDS:
METHODS AND PRINCIPLES (LITERATURE REVIEW)
Ivanov E. A.1, Ryzhkova A. 1.1, Peshikova M. V. 2, Shlepotina N. M.2
1 CRCCH, Chelyabinsk, Russia
2 FSBEI HE SUSMU MOH Russia, Chelyabinsk, Russia
Abstract. Molecular diagnostics today is one of the fastest growing and promising areas of biotechnology. An important place among the methods of molecular genetic analysis is sequencing, which is increasingly being used in various fields of medicine: genetics, oncology, microbiology, forensic medicine, etc. Nucleic acid sequencing refers to the determination of their primary nucleotide sequence. The rapid development of technology over time significantly expanded the range of sequencing techniques. Sequencing methods are conventionally divided into classic, new ("second" generation) and newest ("third" generation). The most accessible now is exomic and targeted sequencing. In this article, we bring to your attention various methods and principles of sequencing. Understanding the approaches to implementing different sequencing methods is of interest in the framework offundamental medical science and clinical practice.
Keywords: sequencing, exomic sequencing, targeted sequencing, classic sequencing methods, new sequencing methods, the latest sequencing methods
Contacts: Ivanov Evgeny: [email protected]; Ryzhkova Anna: [email protected]; Peshikova Margarita: [email protected]; Shlepotina Nina: [email protected]
Сведения об авторах:
Иванов Евгений Александрович, государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Челябинская областная детская клиническая больница», клиническая лаборатория, 454076, Российская Федерация, г. Челябинск, ул. Блюхера, 42а
Рыжкова Анна Ивановна, государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Челябинская областная детская клиническая больница», микробиологическая лаборатория, 454076, Российская Федерация, г. Челябинск, ул. Блюхера, 42а
SPIN-код: 6951-1890
Пешикова Маргарита Валентиновна, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, 454092, Российская Федерация, г. Челябинск, ул. Воровского, 64
SPIN-код: 2358-9769, ORCID-iD: orcid.org/0000-0002-2113-5495
Шлепотина Нина Михайловна, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биологии, 454092, Российская Федерация, г. Челябинск, ул. Воровского, 64
SPIN-код: 1280-5171, ORCID-iD: https://orcid.org/0000-0003-1297-999 Information about authors:
Evgeny A. Ivanov, State Budgetary Institution of Healthcare Chelyabinsk Regional Children's Clinical Hospital, Clinical Laboratory, 42A, Blyukhera str., Chelyabinsk, 454076, Russia
Anna I. Ryzhkova, State Budgetary Institution of Healthcare Chelyabinsk Regional Children's Clinical Hospital, Microbiology Laboratory, 42A, Blyukhera str., Chelyabinsk, 454076, Russia
Margarita V. Peshikova, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "South-Urals State Medical University " of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Department of Microbiology, Virology, Immunology and Clinical Laboratory Diagnostics, 64, Vorovskogo str., Chelyabinsk, 454092, Russia
Nina M. Shlepotina, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "South-Urals State Medical University" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Department ofMicrobiology, Virology, Immunology and Clinical Laboratory Diagnostics, Department of Biology, 64, Vorovskogo str., Chelyabinsk, 454092, Russia
Для цитирования: Иванов Е. А., Рыжкова А. И., Пешикова М. В., Шлепотина Н. М. Секвениро-вание нуклеиновых кислот: методы и принципы (обзор литературы) // Педиатрический вестник Южного Урала. 2020. № 1. С. 97-103.
DOI: 10.34710/Chel.2020.66.13.012
Актуальность. Молекулярная диагностика на сегодняшний день является одним из самых быстро развивающихся и перспективных направлений биотехнологии. Важное место среди методов молекулярно-генети-ческого анализа занимает секвенирование, которое все больше находит применение в самых различных областях медицины: генетике, онкологии, микробиологии, судебной медицине и др. [6]. Секвенированием нуклеиновых кислот называют определение их первичной нуклеотидной последовательности [7]. Секвенирование стало мощным инструментом для одновременного поиска генетических маркеров заболевания в сотнях и тысячах генов. Стремительное развитие технологий со временем значительно расширило спектр методик секвенирования. Наиболее доступным сейчас является экзом-ное и таргетное секвенирование [4]. Методы секвенирования условно подразделяются на классические, новые («второго» поколения) и новейшие («третьего» поколения) [2]. В данной статье мы предлагаем вашему вниманию краткий обзор различных методов и принципов секвенирования. Понимание подходов к осуществлению разных методов
секвенирования представляет интерес в рамках не только фундаментальной медицинской науки, но и клинической практики.
Классические методы секвенирования. Секвенирование по Сэнгеру — дидезокси-нуклеотидный метод, или метод терминации цепи с помощью электрофореза в геле [2, 7]. К настоящему времени метод Сэнгера автоматизирован на основе применения капиллярных генетических анализаторов, использующих регистрацию свечения различных флуоресцентных меток для обнаружения встроившихся в цепь ДНК меченых нуклео-тидов. В реакционную смесь для синтеза ДНК по матрице исследуемой молекулы ДНК наряду с обычными дезоксирибонуклеотида-ми вводятся химически модифицированные нуклеотиды, помеченные флуоресцентными красителями и способные лишь завершать синтез цепи в том месте, куда они встраиваются, но не продолжать его. Причем каждый из четырех видов нуклеотидов содержит собственную метку. В результате реакции образуется множество фрагментов разной длины, каждый из которых заканчивается каким-либо меченым нуклеотидом. Таким образом, если упорядочить эти фрагменты по длине
и идентифицировать по меткам нуклеотиды, которыми они заканчиваются, можно прочитать всю последовательность ДНК. Это и достигается в генетических анализаторах при помощи капиллярного электрофореза в геле и регистрации свечения облученных лазером флуоресцентных меток. К преимуществам этого метода относят сравнительно невысокую стоимость, точность и простоту автоматизации, что позволяет активно применять его в лабораторной практике. Именно методом терминации цепи осуществлялось первое секвенирование генома человека, но в данном масштабном проекте этот метод оказался очень медленным и дорогим [2].
Пиросеквенирование основано на образовании пирофосфата в результате присоединения очередного комплементарного нуклеотида к секвенируемой цепи ДНК. Пирофосфат запускает каскад химических реакций, завершающийся выделением кванта света, который регистрируется в виде светового сигнала [2].
Недостатки классических методов секве-нирования (низкая производительность и высокая стоимость) обусловили необходимость разработки более совершенных методов.
Next generation sequencing (NGS) — методы секвенирования следующего, или нового, поколения.
Общие принципы NGS [1, 2, 5]:
1. Расщепление длинных молекул ДНК при помощи ультразвука или ферментов на множество коротких фрагментов.
2. Присоединение к концам фрагментов олигонуклеотидных адаптеров, амплификация этих фрагментов и получение библиотек генов.
3. Многократное прочтение последовательностей нуклеотидов в этих фрагментах.
4. Обработка данных методами биоинформатики: выравнивание данных относительно референсной последовательности или объединение (сборка) этих перекрывающихся коротких последовательностей в полную геномную или экзомную последовательность de novo при помощи специальных компьютерных программ и анализ результатов [5, 7].
Высокопроизводительное пиросеквенирование (454 Roche GS FLX Titanium, фирма Roche) — следующий этап развития
классического пиросеквенирования. Длина прочтения достигает 1000 пар нуклеотидов, максимальный выход (объем данных с одного запуска секвенатора) — до 700 млн пар нуклеотидов, уровень ошибок — 0,4-1,5 % [11].
Полупроводниковое секвенирование. Технология разработана компанией Ion Torrent (секвенаторы PGM, Ion Proton) и основана на детекции изменения pH в результате выделения иона водорода в момент присоединения к секвенируемой цепи ДНК очередного комплементарного нуклеотида. В качестве детекторов используются полупроводниковые чипы, содержащие миллионы лунок, предназначенных для проведения реакции и измерения pH. Предварительно подготовленные ДНК-библиотеки денатурируют и помещают на микросферах в лунки чипа, после чего проводят циклическое последовательное добавление ПЦР-смесей, отличающихся лишь наличием одного из четырех видов ну-клеотидов. В лунках микрочипа, где данный нуклеотид присоединился к секвенируемой цепи ДНК, происходит выделение иона водорода и изменение pH, регистрируемое прибором [2]. Так постепенно может быть прочитана вся анализируемая последовательность ДНК. Отсутствие оптических систем детекции сигнала существенно снижает стоимость прибора и всего процесса секвенирования. Длина прочтения составляет до 400 пар ну-клеотидов, объем данных с одного запуска секвенатора — до 10 млрд пар нуклеотидов, уровень ошибок — 1-3 % [11].
Секвенирование на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченных нуклеотидов (компания Illumina, секвенаторы MiSeq, HiSeq, NextSeq 500). Суть метода заключается в амплификации фрагментов исследуемой ДНК на твердой подложке (создании кластеров), их денатурации и последующем проведении секвени-рования при участии меченных флуорохро-мом терминирующих нуклеотидов. Тип присоединившегося нуклеотида определяют по свечению флуорохрома, которое возбуждается лазерным импульсом. После этого зарегистрированный нуклеотид химически модифицируют, чтобы к нему мог присоединиться следующий терминирующий нуклеотид, и так далее. Прибор детектирует
флуоресценцию из многих сотен миллионов точек-кластеров одновременно [2]. Этот вид секвенирования характеризуется высокими показателями точности, производительности, соотношения «производительность/цена» [1]. Длина прочтения — до 2 х 250 пар нуклеотидов (Illumina MiSeq), максимальный выход — до 600 млрд пар нуклеотидов (Illumina HiSeq), уровень ошибок — 0,5-2 % [11].
Циклическое лигазное секвенирование — разработка компании Applied Biosystems, затем Life Technologies и Thermo Fisher Scientific (SOLiD, 5500xl).
Особенностью данной технологии является распознавание олигонуклеотидным зондом сразу двух оснований, располагающихся в цепи ДНК рядом друг с другом. На первом этапе праймер связывается с соответствующим участком закрепленной на подложке одноцепочечной ДНК, полученной путем денатурации и модификации фиксированного на микросферах продукта эмульсионной ПЦР, который, в свою очередь, образован в результате клональной амплификации исходного ДНК-фрагмента [2]. Меченный флуорохромом олигонуклеотидный зонд, комплементарный двум основаниям рядом с праймером, присоединяется к этим основаниям, а затем при помощи фермента лигазы пришивается к праймеру. Затем происходит идентификация флуоресцентной метки и ее последующее удаление [3]. Сайт, идентифицируемый в следующем цикле, располагается в цепи ДНК через три нуклеотида (это обусловлено конструкцией распознающих зондов, имеющих в составе три универсальных нуклеотида). Циклы повторяются до тех пор, пока не закончится матрица. Затем построенная комплементарная цепь удаляется, и процесс повторяется со вторым праймером, связывающимся с участком изучаемой ДНК в месте, смещенном на один нуклеотид относительно точки посадки предыдущего прай-мера. Таким образом, для прочтения полной последовательности секвенируемого фрагмента необходимо пятикратно повторить данный процесс, причем праймер каждый раз должен быть сдвинут на один нуклеотид относительно предыдущего [2].
Длина прочтения при циклическом ли-газном секвенировании достигает 2 х 60 пар
нуклеотидов, объем данных с одного запуска секвенатора — до 300 млрд пар нуклеотидов, уровень ошибок — 0,2 % [11]. По другим данным, длина единичного фрагмента ДНК, секвенируемого данным методом, составляет 75 пар нуклеотидов с точностью до 99,99 % [2]. Стоит отметить, что процесс циклического лигазного секвенирования является одним из самых продолжительных и достигает 7 суток [2, 11].
Секвенирование новейшего поколения, которое иногда называют наносеквениро-ванием, отличается более простой пробо-подготовкой, не требует предварительной амплификации исследуемой ДНК и позволяет прочитывать более длинные непрерывные фрагменты нуклеиновых кислот — до 200 000 пар нуклеотидов [1, 2].
Можно выделить метод одномолекуляр-ного секвенирования в реальном времени — Single Molecule RealTime (SMRT), представленный компанией Pacific Biosciences, а также секвенирование при помощи нано-поровых систем, разработанных компанией Oxford Nanopore Technologies (MinlON, GridION и т. д.).
Принцип секвенирования в нанопоровых системах основан на регистрации изменений электропроводности нанопоры при пропускании через нее молекулы нуклеиновой кислоты, поскольку эти изменения электропроводности зависят от конкретного нуклео-тида, проходящего в данный момент времени через нанопору [2].
MinION — самая компактная система для секвенирования, первый и единственный на сегодняшний день секвенатор, успешно опробованный в космосе (на Международной космической станции) [12].
Можно выделить несколько основных вариантов использования секвенирования в клинической практике: полногеномное, полноэкзомное и таргетное секвенирование, а также секвенирование транскриптома.
Полногеномное секвенирование. Включает определение нуклеотидной последовательности всей ДНК. Его использование с диагностическими целями пока ограничивается высокой стоимостью анализа и сложностью биоинформатической обработки полученных данных [9].
Полноэкзомное секвенирование. Пол-ноэкзомное секвенирование представляет собой анализ белок-кодирующих последовательностей ДНК. Последние составляют около 1 % генома, но именно в них локализовано подавляющее число патогенных мутаций. Данный вид исследования оправдан в том случае, когда недостаточно клинических и лабораторных данных для формулирования диагностической гипотезы. Примером могут служить орфанные заболевания, а также болезни, отличающиеся высокой генетической гетерогенностью. Особо следует подчеркнуть, что полноэкзомное секвениро-вание позволяет выявить мутации не только в известных генах (как таргетное секвениро-вание), но также и способствует открытию новых генетических элементов, имеющих отношение к развитию заболеваний [10].
Таргетное (целевое) секвенирование — анализ участков ДНК, содержащих конкретные интересующие исследователя гены. Используется, в частности, в диагностике заболеваний, обусловленных одной мутацией из нескольких десятков или сотен возможных при данной патологии — например, в диагностике первичных иммунодефици-тов, кардиомиопатий, несиндромальной тугоухости, пигментного ретинита, спино-церебеллярных атаксий и др. [8-10]. Сюда относятся и так называемые «клинические экзомы», содержащие большое количество генов, и малые (на один или несколько генов) таргетные панели [1].
Секвенирование транскриптома (РНК-секвенирование, RNA-seq) — определение нуклеотидной последовательности матричной РНК. Позволяет оценивать транскрипцию интересующих исследователя генов
Литература
1. Бархатов И. М., Предеус А. В., Чухло-вин А. Б. Секвенирование нового поколения и области его применения в онкогематологии // Онкогематология. 2016. Т. 11. № 4. С. 56-63.
2. КрасновЯ. М., ГусеваН. П., ШараповаН. А., и др. Современные методы секвенирования ДНК (обзор) // Проблемы особо опасных инфекций. 2014. Вып. 2. C. 73-79.
3.КураченкоА. В., ЗаигринИ. В., Шарко Ф. С., и др. Использование облачной инфраструктуры
на разных стадиях онтогенеза, в разных клетках и тканях, в норме и при патологии. Данный вид секвенирования часто применяется в онкологии для классификации новообразований, выявления неоантигенов и новых химерных генов [1].
Применение секвенирования нового поколения в онкогематологии включает следующие направления [1]:
1. Определение молекулярных вариантов лейкозов.
2. Выявление генов риска неблагоприятного исхода.
3. Установление нарушений эпигенетической регуляции генома.
4. Поиск маркеров минимальной остаточной болезни.
5. Анализ клональной эволюции злокачественных клеток.
6. Поиск мутаций, связанных с резистентностью к терапии.
Особые надежды возлагают на NGS в подборе пар «донор — реципиент» при трансплантации. Предполагается, что NGS позволит более точно прогнозировать риск развития иммунных конфликтов между клетками реципиента и трансплантата на основе глубинного типирования генных вариантов HLA, а также совершенствовать методы иммунотерапии для персонализированного лечения онкоболь-ных, в частности, путем предсказания взаимодействия антигенраспознающих эпитопов В- и Т-лимфоцитов в организме пациента [1].
Заключение. Таким образом, секвени-рование как перспективный метод молеку-лярно-генетической диагностики постоянно развивается и помогает решать все более широкий круг задач в рамках персонализированной медицины.
References
1. Barhatov IM, Predeus AV, Chuhlovin AB. Sequencing of a new génération and its application in oncohematology. Onkogematologiya. 2016;11(4):56-63 (in Russ.).
2. Krasnov YAM, Guseva NP, Sharapova NA, i dr. Modern DNA sequencing methods (review). Problemy osobo opasnyh infekcij. 2014;(2):73-79 (in Russ.).
3. Kurachenko AV, Zaigrin IV, Sharko FS, i dr. Using Cloud Infrastructure to Analyze MicroRNA
для анализа данных секвенирования микроРНК // Информационное общество. 2013. N° 1/2. С. 26-38.
4. Мерсиянова И. В., Захарова В. В., Павлова А. В., и др. Что не может NGS: ограничения метода массового параллельного секвенирования в практике диагностики иммунологических и гематологических заболеваний // Российский журнал детской гематологии и онкологии. 2019. Т. 6. № S1. С. 61-62.
5. НовиковаЕ. И., СнигиреваГ. П. Секвенирование «нового поколения» (NGS): применение для молекулярно-генетических исследований в онкологии // Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии. 2016. Т. 16. № 1. Режим доступа: http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v16/ docs/Novikova.pdf. Дата обращения: 25.04.2020.
6. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР): метод. пособие / сост. В. В. Зорина. М.: ДНК-технология, 2012. 76 с.
7. Сазанов А. А. Генетика: учеб. пособие. СПб.: ЛГУ им. А. С. Пушкина, 2011. 264 с.
8. Суспицын Е. Н., Гусева М. Н., Соколен-ко А. П., и др. Таргетное секвенирование нового поколения (NGS) в диагностике первичных иммунодефицитов // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19. Спец. вып. С. 174.
9. Суспицын Е. Н., Соколенко А. П. Применение молекулярных технологий нового поколения в медицинской генетике: науч.-обра-зоват. курс для студентов мед. вузов и врачей. СПб., 2013. 22 с.
10. Суспицын Е. Н., Тюрин В. И., Имяни-тов Е. Н., и др. Полноэкзомное секвенирование: принципы и диагностические возможности // Педиатр. 2016. Т. 7. Вып. 4. C. 142-146.
11. Тощаков С. В., Доминова И. Н., Патрушев М. В. Технологии высокопараллельного секве-нирования в медико-генетических исследованиях // Медицинская генетика. 2013. Т. 12. № 1. С. 15-25.
12. Castro-Wallace S. L., Chiu C. Y., John K. K., et al. Nanopore DNA sequencing and genome assembly on the international space station // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. № 1. P. 18022.
Sequencing Data. Informacionnoe obshchestvo. 2013;(l/2):26-38 (in Russ.).
4. Mersiyanova IV, Zaharova VV, Pavlova AV, i dr. What NGS Cannot: Limitations of the Mass Parallel Sequencing Method in the Practice of Diagnosing Immunological and Hematologic Diseases. Rossijskij zhurnal detskoj gematologii i onkologii. 2019;6(S1):61-62 (in Russ.).
5. Novikova EI, Snigireva GP. New Generation Sequencing (NGS): Application for Molecular Genetic Research in Oncology. Vestnik Rossi-jskogo Nauchnogo Centra rentgenoradiologii. 2016;16(1). Available from: http://vestnik.rncrr. ru/vestnik/v16/docs/Novikova.pdf [Accessed 25 April 2020] (in Russ.).
6. Zorina VV, editor. Osnovy polimeraznoj cep-noj reakcii (PCR) [The basics of polymerase chain reaction (PCR)]. Moscow: DNK-tekhnologiya; 2012. 76 s. (in Russ.).
7. Sazanov AA. Genetika [Genetics]. St. Petersburg: LGU im. A.S. Pushkina; 2011. 264 s.
8. Suspicyn EN, Guseva MN, Sokolenko AP, i dr. Next Generation Targeted Sequencing (NGS) in Diagnosing Primary Immunodeficiencies. Medicinskaya immunologiya. 2017;19:174 (in Russ.).
9. Suspicyn EN, Sokolenko AP. Primenenie molekulyarnyh tekhnologij novogo pokoleniya v medicinskoj genetike [The use of new generation molecular technologies in medical genetics]. St. Petersburg; 2013. 22 s. (In Russ).
10. Suspicyn EN, Tyurin VI, Imyanitov EN, i dr. Full excom sequencing: principles and diagnostic options. Pediatr. 2016;7(4):142-146 (in Russ.).
11. Toshchakov SV, Dominova IN, Patru-shev MV. High-Parallel Sequencing Technologies in Medical Genetic Research. Medicinskaya genetika. 2013;12(1):15-25 (in Russ.).
12. Castro-Wallace SL, Chiu CY, John KK, et al. Nanopore DNA sequencing and genome assembly on the international space station. Sci. Rep. 2017;7(1):18022.
Источник финансирования: авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
