CC BY
21© Коллектив авторов, 2014 УДК 618.3-06-092:[612.6.05:577.21
СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНА ACVR2A У БЕРЕМЕННЫХ С ГЕСТОЗОМ
А.С. Глотов1, 2, кандидат биологических наук, Е.С. Вашукова1, М.М. Данилова1, 2, В.С. Пакин1, Машарский А.Э.2, кандидат биологических наук, Федотов П.В.3, Зайнулина М.С.1, доктор медицинских наук, профессор, О.Н. Аржанова1, доктор медицинских наук профессор, Е.В. Мозговая1, доктор медицинских наук, В.С Баранов1, 2, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН
1НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3; 2Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7—9; 3Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, Кронверкский проспект, д. 49
E-mail: anglotov@mail.ru
Введение. Гестоз (преэклампсия) — одно из частых осложнений беременности. В основе заболевания лежит патология сосудистой системы у беременной женщины. Одним из генов-кандидатов гестоза является ген, кодирующий белок рецептора типа 2А к активину А. Функции продукта гена ACVR2A хорошо соответствуют известным патофизиологическим механизмам гестоза. Ранее было показано, что 5SNP (rs10497025, rs13430086 и LF004, LF013, LF020) гена ACVR2A — рецептора типа 2А к активину А, ассоциированы с гестозом.
Целью настоящей работы явилось изучение возможностей метода NGS для секвенирования первичной нуклеотидной последовательности гена ACVR2A, ассоциированного с риском развития гестоза у беременных.
Методом полногеномного секвенирования (секвенирование нового поколения — NGS) проведено исследование первичной структуры гена ACVR2A у беременных с гестозом различного патогенеза.
Результаты. Выявлено 484 нуклеотидных вариации (SNP), 129 из которых описаны ранее. Используя аннотирование «медицинской» значимости данных замен с помощью ресурса Gene-Talk, авторы показали, что 31 полиморфный вариант может быть значимо ассоциирован с гестозом. Выявлена корреляция между вариантами rs1364657, rs7601098, rs3820716 гена ACVR2A и содержанием белка в моче, а также между rs7601098 и диастолическим артериальным давлением (р<0,03). Выявлена ассоциация между вариантом rs3764955и тяжестью гестоза с образованием отеков (р<0,05).
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о перспективности новых методов секвенирования (NGS) для изучения молекулярно-генетических основ патогенеза гестоза; они важны и для понимания фундаментальных механизмов развития мультифакторных заболеваний.
Ключевые слова: секвенирование нового поколения (NGS), ген ACVR2A, беременные, гестоз
APPLICATION OF NGS METHOD FOR ACVR2A GENE SEQUENCING IN WOMEN WITH PREECLAMPSIA A.S. Glotov1'2, E.S. Vashukova1, M.M. Danilova1-2, V.S. Pakin1, A.E. Masharsky2, P. V. Fedotov3, M.S. Zainulina1, O.N. Arzhanova1, E.V. Mozgovaya1, V.S. Baranov1,2
1D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Mendeleevskaya line, 3, Saint-Petersburg, Russian Federation, 199034;
2Saint Petersburg State University, Universitetskaya nab, 7—9, Saint-Petersburg, Russian Federation, 199034;
3Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics, Kronverkskiy pr., 49, Saint-Petersburg, Russian Federation, 197101
Introduction. Preeclampsia is one of the most frequent complications of pregnancy. Disease is based on the pathology of the vascular system of a pregnant woman. One of the candidate genes of preeclampsia is a gene encoding a protein receptor type 2A to activin A. Functions ACVR2A gene product correspond to well known pathophysiological mechanisms of preeclampsia. Previously five SNP (rs10497025, rs13430086 and LF004, LF013, LF020) in the ACVR2A gene — 2A receptor type to activin A, were shown to be associated with preeclampsia.
The aim of the study was to explore opportunities for next-generation sequencing (NGS) method in primary nucleotide sequence of the gene ACVR2A, associated with the risk of preeclampsia in pregnant women.
Methods. Analysis of ACVR2A gene in women with preeclampsia was performed by NGS method.
Results. 484 single nucleotide variations were found, 129 of which were identified earlier. Variants annotation by «Gene-Talk» showed that 31 polymorphic locuses might be significantly associated with preeclampsia. Correlations between variants rs1364657, rs7601098, rs3820716ACVR2A and proteinuria level, between rs7601098 and diastolic blood pressure (p<0,03) were found. The association between rs3764955 variant and the severity of preeclampsia and edema was registered (p<0,05).
Conclusion. NGS methods may be used to study of fundamental molecular and genetic mechanism of preeclampsia.
Key words: next-generation sequencing (NGS), ACVR2A, pregnancy, preeclampsia
ВВЕДЕНИЕ
Гестоз (преэклампсия) — одно из грозных и довольно частых осложнений беременности. В основе заболевания лежит патология сосудистой системы у беременной женщины [1]. Для гестоза характерно генерализованное повреждение эндотелия сосудов, приводящее к нарушениям процессов имплантации и плацентации [2, 3].
Гестоз является типичным мультифакторным заболеванием. Вклад генетических факторов в его патогенез оценивают приблизительно в 55% [4—6]. Предполагается, что основу наследственной компоненты гестоза составляют нарушения функций генов, матери и плода, регулирующих процессы имплантации и пла-центации, особенно формирование спиральных артерий плаценты, играющих важную роль в обеспечении обмена веществ между матерью и плодом. При этом в патогенезе гестоза одни исследователи отмечают решающую роль неблагоприятных вариантов материнских генов плаценты, другие — генов плода или изменения в балансе работы геномов плода и матери [5, 6].
Методом анализа сцепления выявлено, что гены гестоза картированы на разных хромосомах. Неравновесие по сцеплению установлено для локусов на 2-й (2p.11, 2р.13, 2р.22, 2р.25, 2я22), 9-й (9р.13) и 10-й (10д21) хромосомах, а также некоторых регионов хромосом 4, 5, 12, 22 и др. [6, 7]. Одним из наиболее вероятных локусов гестоза является участок короткого плеча 2-й хромосомы (2д22). Этому участку уделяют особенно большое внимание после того, как Е. Fitzpatrick и соавт. установили неравновесие по сцеплению между гестозом и геном ЛСУБ.2Л этого локуса. Было показано, что 5БКР (ге10497025, ге13430086 и LF004, LF013, LF020) гена ЛС¥Я2Л — рецептора 2А типа к активину А, ассоциированы с гестозом [8]. В последующем ассоциация БКР сайтов гена ЛСУЯ2Л (181424941, ге1014064, п2161983, гз3768687у) с гестозом была подтверждена в масштабных исследованиях, проведенных с применением метода полногеномного скрининга ассоциаций — GWAS [9].
Однако в ряде других работ, в частности финских и российских авторов, выявлены ассоциации гестоза (преэклампсии) с геном ЛСУВ.2Л [10, 11]. Вероятно, это связано с тем, что в данных работах анализировали не все известные SNP этого гена, как в других исследованиях [8—11].
Таким образом, даже такой высокотехнологичный метод, как GWAS может оказаться недостаточным для выявления всех ассоциаций гена-кандидата при разных многофакторных заболеваниях [12]. Очевидно, что для этого требуется исследование не только дополнительных, в том числе функциональных характеристик генома (эпигенома, экспрессии генов, межгенных взаимодействий и др.), но и тотальный скрининг первичной нуклеотидной последовательности гена-кандидата и даже соседних с ним последовательностей ДНК [12].
Если подходы к исследованию динамического генома только разрабатываются, то наиболее удобным и высокоточным методом тотального скрининга является технология секвенирования следующего поколения (newgeneration sequencing — NGS) с использованием различных платформ [13].
Функции продукта гена ACVR2A хорошо соответствует известным патофизиологическим механизмам гестоза. Ген кодирует белок, рецептор типа 2А к акти-вину А, участвующий в клеточной дифференцировке, пролиферации и апоптозе, регулирует ремоделирова-ние спиральных артерий в дифференцировке трофо-бласта и его инвазии в децидуальную ткань [8].
Цель настоящей работы — изучение возможностей метода NGS для секвенирования первичной нуклеотидной последовательности гена ACVR2A, ассоциированного с риском развития гестоза у беременных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Формирование групп обследования
Основную группу, из которой были исключены пациентки с тромбозом в анамнезе и приобретенными формами тромбофилии (антифосфолипидный синдром), составили 43 беременные с гестозом средней и тяжелой степени (согласно классификации Г.М. Савельевой и соавт. [3]). Диагноз ставили при наличии >2 клинических проявлений в следующих сочетаниях: повышение артериального давления (АД) и отеки, отеки и протеинурия, сопровождающая повышением АД, а также классической триады симптомов: отеки, гипертензия, протеинурия (краткое описание группы приведено в табл. 1). Образцы крови получали в дородовом и родильном отделениях НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург). От каждой участни-
Таблица 1
КЛИНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПАЦИЕНТОК С ГЕСТОЗОМ
Показатель Наличие гипертонии Наличие СД до беременности Тяжесть гестоза Наличие отеков САД, ДАД, Протеинурия,
- + - + легкая средняя и тяжелая + - мм. рт. ст. мм. рт. ст. г/л
Число пациенток (среднее значение показателя) 19 18 20 17 6 31 9 28 145,3+14,6 91,6+13,3 0,15+00,29
Примечание. СД — сахарный диабет; САД — систолическое; ДАД — диастолическое АД.
цы исследования было получено информированное согласие.
Экстракция ДНК
ДНК из лимфоцитов венозной крови выделяли в соответствии с методикой J. Sambrook [14] с некоторыми модификациями.
Амплификацию гена ACVR2A нуклеотидной последовательности проводили, используя 11 пар прай-меров (табл. 2), которые подбирали с помощью программы Oligo 6 (США) с учетом соответствующих рекомендаций производителя «удлиняющей» поли-меразы (Roche, Швейцария).
Реакционная смесь для амплификации объемом 50 мкл включала: 3—5 мкл ДНК-матрицы (70—100 нг/мкл), к которой добавляли деионизованную воду, 5 мкл буфера и 0,5 мкл фермента, рекомендованных производителем (Roche, Швейцария), 300 нМ каждого праймера, 300 мМ каждого dNTP (Roche, Швейцария). Для амплификации использовали программируемый термоциклер 2720 фирмы Applied Biosystem (США). После предварительной денатурации ДНК (3 мин при 94°С) проводили амплификацию в режиме:
• 10 циклов: 94°С (25 с), 55°С (15 с), 68°С (11 мин) и 25 циклов: 94°С (25 с), 55°С (15 с), 68°С (11 мин с удлинением за 1 цикл на 20 с), 72°С (11 мин) — для фрагментов №1, 1а, 4, 6, 11;
• 10 циклов: 94°С (25 с), 63°С (15 с), 68°С (11 мин) и 25 циклов: 94°С (25 с), 63°С (15 с), 68°С (11 мин с удлинением за 1 цикл на 20 с), 72°С (11 мин) — для фрагментов №2, 3, 5, 7—10. Наличие продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), необходимых для секвенирова-ния, анализировали в 0,8% агарозном геле. Определение концентрации ДНК Концентрацию ПЦР-продуктов гена ACVR2A измеряли с помощью прибора Qubit (Invitrogen, США), используя набор реагентов dsDNA BR Assay Kits (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. ПЦР-продукты, соответствующие каждому образцу, смешивали пропорционально концентрациям. В исследование брали от 50 до 100 нг смеси ПЦР-продуктов.
Анализ образцов на секвенаторе Ion Torrent Для подготовки 31-й библиотеки использовали набор реагентов Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit (Life Technologies, США) и необходимое дополнительное оборудование, расходные материалы и реактивы согласно прилагающийся инструкции. Молярную концентрацию баркодированных библиотек определяли с помощью прибора 2200 TapeStation Instrument (Agilent Technologies, США), используя чипы High Sensitivity D1K ScreenTape и реактивы фирмы High
Таблица 2
НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА ACVR2A
Номер Название Длина фрагмента, п.о. Последовательность 5'-3'
1а F-short R1-new 2538 ATATCCTGAGCGGGTGGACAGCCCTTCCTCCGTGAG CCCGTTTCCAAGAGTCCCCCGTAATTCTATGCCACA
1 F1-new R1-3 4870 CCTCACGTTTTCTTCAACTTCAGCGTCCAGCAGTGT GGAAGTCTAATGTGGTCCTATCAGCAGCAATAAATA
2 F2 R2 8939 CTGGACTACCTCGCACACCCTCTTGGGAATAGTGT TTCCTAGGATGCAAACCCCAGCAGGTAGAAGAGAG
3 F3 R3 8825 GTAGGTTAAGTTCCTAGACTAATCCACAATCCTGT GAGTGTAGAGGCACAAGGCACAAGGGTAGTAAAGA
4 F4 R4 8799 ACAATACACGCAGTACCCCCAAGATTATTCTTTTC TGAGAATTATGTCCCTAGGTGCCACACAGTCCAAG
5 F5 R5 8990 CTTCCTAATTTAAACAGTCTACTCACTGTTATTCT GGACATATGCAGATGAAGTATCATCAGTGCCTAGC
6 F6 R6 8821 GAGGGCAGTCTTGTCAAACACTCTGGTTATTCACA CTCAGAAAATATAACGGCCTCTTACAAGTCAATCA
7 F7 R7 8870 TGGGCCATTTTGCTCTACCACCATCAATATGTGAA GTGTCAAAGAGTCCTTGGGTCAGATTTTTCTATCT
8 F8 R8 8870 ACACTCCTGAAAGTATGGAATGGGGCATGGGATGT GAATTTCCTATTTCCTGAACTGCCTCACTTCCCTT
9 F9 R9 8923 ATGTGTGATTACTTGTTCCCAGGGCCACCTCTGCT ACATACACTGCTCTAGCTAGATCCTGGTGTTCTGA
10 F10 R10 8817 AACTAGGGTATAGTAATCTCTAGGATGAGCCAGTT TGGGGAATTCTGGGTAACGACACTTCCTGAGGTGA
11 F11 R11 4695 CATGTTTTAAAGCCCCATCTTATATCCAGTTCCCA TTCAAACCACCATAACCTAAGTGCTGCCCCATCCT
Sensitivity D1K Reagents. Проведение эмульсионной ПЦР и «обогащение» микросфер осуществляли в соответствии с инструкцией к набору реагентов Ion OneTouch™ 200 Template Kit v2 DL (Life Technologies, США). Секвенирование проводили, используя набор реагентов Ion PGM™ Sequencing 300 Kit (Life Technologies, США) и микрочип Ion 314™ Chip (Life Technologies, США). Запуск прибора, его последующую «чистку» и эксплуатацию осуществляли согласно руководству к эксплуатации Ion Personal Genome Machine® System и соответствующим инструкциям: Ion PGM™ Sequencing 300 Kit, Torrent Suite 3.4.1 (Life Technologies, США).
Анализ образцов на секвенаторе GS Junior
Амплифицированные фрагменты 12 образцов фрагментировали с помощью набора GS Rapid Library Prep Kit (Roche, Швейцария), определяли концентрацию полноразмерных фрагментов с помощью ДНК-флюориметра и оценивали размеры фрагментов ДНК с помощью электрофоретической микрочиповой системы MCE-202 MultiNA (Shimadzu, Япония). Полученные библиотеки амплифицировали методом эмульсионной ПЦР с помощью набора GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L) (Roche, Швейцария). Секвенирование проводили с помощью набора GS Junior Titanium Sequencing Kit (Roche, Швейцария) и прибора GS Junior (Roche, Швейцария) по стандартной процедуре.
Обработка полученных данных
Анализ полученных данных начинали с выравнивания нуклеотидных последовательностей против референсного генома hg19 (Genome Reference Consortium GRCh37) [15], используя программное средство bwa [16], в результате чего были получены файлы в формате BAM. Дублирующие чтения были удалены с помощью samtools [17]. Предварительную обработку результатов секвенирования проводили, используя программу для анализа нуклеотидных последовательностей UGENE [18] и базу данных Ensembl [27]. Дальнейший поиск вариантов осуществлялся по всем образцам с помощью программного средства FreeBayes [19]. Был составлен единый файл (*.vcf), включающий информацию обо всех выявленных вариантах.
Аннотирование и фильтрацию вариантов осуществляли с помощью ресурса wANNOVAR и интернет-ресурса Gene-Talk [20—22].
Методы статистической обработки
Для сравнения частот генотипов использован точный тест Фишера. Для анализа корреляции между генотипами и параметрами вычисляли линейный коэффициент корреляции (Пирсона). Расчеты проводили в среде для статистических вычислений R [23] c помощью программы R Cloud Workbench [24].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения генетических маркеров гестоза применен подход с использованием полногеномного секвенирования на приборах GS Junior фирмы Roche
и Ion Torrent фирмы Life Technologies. Такое достоинство этих приборов, как возможность быстрого секвенирования протяженных фрагментов ДНК, позволяет проводить биоинформационный анализ в автоматическом режиме без использования сложной и дорогостоящей компьютерной инфраструктуры.
Фрагменты гена ACVR2A длиной 89 060 п.о. секвенировали более чем c 30-кратным покрытием. Суммарно во всех 43 образцах были выявлены 484 нуклеотидные вариации, большинство из которых отсутствуют в базах данных «1000 геномов» и dbSNP135, и только 129 из них соответствовал номер rs. Около 50% замен представляли собой делеции/ инсерции и столько же — однонуклеотидные вариации (SNP). Длина выявленных вариантов была от 1 до 9 нуклеотидов. Большинство из них находились в интронах, 8 — в экзонах (7 новых вариантов), а 16 (11 новых) — в сайтах связывания некодирующих РНК. Как показал выборочный анализ новых вариантов в так называемом ручном режиме (программа UGENE [18]), большинство из них (делеции 1 нукле-отида) с высокой вероятностью являются ошибками метода. Этот факт указывает на важную особенность NGS-секвенирования — его гиперчувствительность (наличие ложноположительных результатов). Традиционными методами и ресурсами биоинформатики [20, 21] эта задача сегодня не решается. Необходимо также отметить, что повторяющихся последовательностей ДНК ни в одном образце при применении использованных приборов (методов) не выявлено.
Мы не сравнивали специально качество полученной информации в зависимости от использованной технологии. Однако если руководствоваться задачами медицинской генетики, результаты секвенирова-ния данного гена с помощью разных платформ GS Junior фирмы Roche и Ion Torrent фирмы Life Cycle, хорошо совпадают.
На следующем этапе работы проводили аннотацию и фильтрацию полученных данных с использованием 2 биоинформационных подходов. Первый из них заключался в анализе данных с применением свободных интернет-ресурсов, аккумулирующих информацию о научных и клинических ассоциациях. С этой целью был использован портал Gene-Talk [22]. Ресурс позволил отфильтровывать полученные данные по разным критериям, в том числе по их научной и клинической значимости (см. рисунок). Максимальной научной и медицинской значимостью в отношении гестоза, согласно полученным данным, обладал 31 из 484 SNP-вариантов (табл. 3). Наличие этих вариантов подтверждено в ручном режиме с помощью программы UGENE [18].
Необходимо отметить, что часть выявленных «значимых» вариантов соответствовала ранее известным маркерам гестоза. В частности была показана [8] ассоциация с преэклампсией вариантов rs10497025 и rs13430086. Другие 5 вариантов, выявленные в данном исследовании (rs1014064, rs17742134, rs2161983, rs3768687, rs3764955), ранее были описаны как мар-
керы преэклампсии норвежскими авторами [9]. В работах отечественных исследователей установлена ассоциация между полиморфизмом rs17742134 и тяжестью гестоза [11]. Таким образом, 7 ранее выявленных маркеров были обнаружены в нашей группе пациенток с гестозом. Необходимо также отметить, что по крайней мере 1 из этих 7 вариантов был выявлен у 41 из 43 больных. У 2 оставшихся обследованных данные варианты не были выявлены из-за низкого качества ридов (покрытия). Этот факт позволяет предполагать, что каждая из наших пациенток с гестозом имеет как минимум 1 мутантную аллель (аллель риска) гена ACVR2A, предрасполагающую к развитию заболевания.
Другой использованный нами биоинформационный подход заключался в анализе функциональной значимости выявленных SNP для оценки их влияния на возможные изменения функции белка. Используемые для решения данных задач алгоритмы PolyPhen и SIFT [20, 21] не позволили выявить ни одного маркера, значимо влияющего на фермент ACVR2A. Вместе с тем подобное исследование с использованием ресурса wANNOVAR позволило выделить 4 интронные замены (rs147685348, rs76633300, rs3754541, rs2288190), локализованные в сайтах связывания некодирующих РНК. Из них 2 (rs3754541 и rs2288190) входили в группу медицински значимых вариантов (см. табл. 3). Возможно, эти замены вовлечены в регуляцию экспрессии гена ACVR2A посредством модификации сайта связывания специфической ми-кроРНК. Для гена ACVR2A известно более 20 микроРНК, причем для некоторых из них (microRNA-
181а) на модельном объекте (мышь) показана значимая обратная корреляция между уровнем экспрессии данной микроРНК и ортологичным гену человека геном аеуг2а [25].
Последний этап работы был направлен на поиск лабораторных данных, подтверждающих функциональную значимость выявленных вариантов в гене ЛСГК2Л.
Для оценки влияния генотипов выявленных вариантов гена ЛСУВ.2Л на такие диагностически значимые параметры гестоза, как систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) АД и наличие белка в моче (использован метод корреляции по Пирсону). Статистически значимая корреляция была показана между ^1364657, ^7601098, ^3820716 гена ЛСУВ.2Л и белком в моче, а также между гб7601098 и ДАД (р<0,03) (табл. 4).
Анализ ассоциации генотипов по медицински значимым вариантам гена ЛСУВ.2Л и наличием таких
Результат биоинформационного фильтеринга с помощью ресурса Gene-Talk
Таблица 3
ЧАСТОТА АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА ACVR2A
Номер rs Геномная Число Частота аллелей, % Частота генотипов, %
координата образцов референсная альтернативная
rs6747792 148611528 29 T 86,2 G 13,8 T/T 75,9 T/G 20,7 G/G 3,4
rs1014064 148612154 32 A 70,3 G 29,7 A/A 56,3 A/G 28,1 G/G 15,6
rs13034494 148615530 28 C 73,2 T 26,8 C/C 64,3 C/T 17,9 T/T 17,9
rs12998729 148617292 28 G 64,3 A 35,7 G/G 46,4 G/A 35,7 A/A 17,9
rs17741978 148617380 31 C 85,5 G 14,5 C/C 74,2 C/G 22,6 G/G 3,2
rs1364657 148618267 29 T 8,6 C 91,4 T/T 3,4 T/C 10,3 C/C 86,2
Продолжение табл. 3
Номер Г8 Геномная Число Частота аллелей, % Частота генотипов, %
координата образцов референсная альтернативная
к7582403 148618754 31 А 53,2 G 46,8 А/А 38,7 29 G/G 32,3
к1895694 148619746 31 Т 56,5 С 43,5 Т/Т 35,5 Т/С 41,9 С/С 22,6
Г82113794 148622977 27 Т 55,6 G 44,4 Т/Т 40,7 Т^ 29,6 G/G 29,6
к17742134 148627396 27 С 88,9 Т 11,1 С/С 85,2 С/Т 7,4 Т/Т 7,4
к929939 148627528 25 С 70 А 30 С/С 56 С/А 28 А/А 16
к1424943 148628162 32 G 0 А 100 G/G 0 G/A 0 А/А 100
к6713811 148631535 29 G 51,7 А 48,3 G/G 31 G/A 41,4 А/А 27,6
Г81424941 148643118 31 С 82,3 Т 17,7 С/С 67,7 С/Т 29 Т/Т 3,2
к10497024 148648059 30 А 70 G 30 А/А 53,3 А^ 33,3 G/G 13,3
Г82161983 148649386 34 G 70,6 А 29,4 G/G 58,8 G/A 23,5 А/А 17,6
к1128919 148657117 34 G 70,6 А 29,4 G/G 55,9 G/A 29,4 А/А 14,7
к2288190 148657589 34 А 41,2 G 58,8 А/А 23,5 А^ 35,5 G/G 41,2
к3754541 148658595 33 G 62,1 А 37,9 G/G 24,2 G/A 75,8 А/А 0
к7581537 148661043 27 Т 96,3 А 3,7 Т/Т 96,3 Т/А 0 А/А 3,7
к10497025 148662202 26 С 84,6 G 15,4 С/С 73,1 С^ 23,1 G/G 3,8
Г813008497 148666761 25 С 70 Т 30 С/С 52 С/Т 36 Т/Т 12
к1469211 148666835 25 С 88 Т 12 С/С 80 С/Т 16 Т/Т 4
к3768687 148672020 25 С 74 Т 26 С/С 56 С/Т 36 Т/Т 8
к13026650 148674201 27 G 70,4 А 29,6 G/G 55,6 G/A 29,6 А/А 14,8
к3764955 148674797 29 G 69 С 31 G/G 51,7 G/C 34,5 С/С 13,8
Г87601098 148676614 29 С 8,6 G 91,4 С/С 0 С^ 17,2 G/G 82,8
к3820716 148680260 29 G 50 А 50 G/G 34,5 G/A 31 А/А 34,5
к2303392 148680427 29 G 67,2 С 32,8 G/G 51,7 G/C 31 С/С 17,2
к13430086 148687061 33 А 65,2 Т 34,8 А/А 42,4 А/Т 45,5 Т/Т 12,1
к17692648 148687731 33 А 87,9 С 12,1 А/А 78,8 А/С 18,2 С/С 3
сопутствующих патологий, как гипертония и развившийся при беременности гестационный диабет, отеков, а также степенью тяжести гестоза (см. табл. 1), был проведен с помощью точного теста Фишера. Ассоциация выявлена только между вариантом ге3764955 и тяжестью гестоза и образованием отеков (р<0,05). Эти результаты противоречат данным аналогичного сравнения, проведенного отечественными авторами [11], но соответствует таковым у норвежских исследователей [9].
Как уже отмечалось, белковый продукт гена ЛСУВ.2Л вовлечен в инвазию трофобласта и его уровень существенно повышен у женщин с гестозом [26]. Каким образом и через какие метаболические пути первичная нуклеотидная последовательность данного гена влияет на функцию фермента, до конца не ясно. Последовательность гена ЛСУВ.2Л составляет около 90 тыс. п.о. В нем выявлено >8000 различных вариаций [27], большинство из которых находятся в интронах и только 9 — в экзонах [26], что подтверждает и настоящее исследование.
Необходимо отметить, что все значимые БОТ (^7601098, гб3820716, гб3764955), выявленные в данном исследовании, расположены в пределах 1 кластера размером 5 тыс. п.о. гена ЛСУВ.2Л. Возможно комплексное исследование данного кластера с использованием принципов системной генетики (микроРНК, метилирование, конформационные особенности ДНК, ген-генные взаимодействия, факторы внешней среды) позволит понять его значение в генезе гестоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на то, что исследование проведено (вследствие сложности эксперимента и его высокой стоимости) на сравнительно небольшом числе образцов (п=43), полученные результаты подтверждают участие гена ЛСУВ.2Л в развитии гестоза. Выявленные нами «аллели риска» этого гена практически во всех образцах ДНК у больных с гестозом, а также наличие маркеров в сайтах связывания некодирующих РНК свидетельствуют в пользу этого
предположения, что требует дальнейшего и более углубленного изучения.
* * *
Работа выполнена с использованием оборудования ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ при частичной поддержке гранта СПбГУ ИАС №1.38.79.2012 и гранта РНФ №14-15-00737.
Таблица 4
КОРРЕЛЯЦИОННЫМ АНАЛИЗ ГЕНОТИПОВ ГЕНА ЛСУЯ2Л И ПОКАЗАТЕЛЕЙ САД И ДАД
Номер ге САД ДАД Белок
г р-уа1ие г р-уа1ие г р-уа1ие
к6747792 -0,13 0,50 -0,07 0,71 -0,14 0,47
|к1014064 0,02 0,91 0,09 0,63 -0,23 0,20
к13034494 0,11 0,60 0,02 0,91 -0,22 0,26
к12998729 -0,10 0,61 -0,04 0,85 -0,28 0,15
к17741978 -0,23 0,22 -0,13 0,48 -0,13 0,9
к1364657 -0,09 0,65 -0,28 0,16 -0,40 0,03*
к7582403 0,00 0,99 -0,16 0,40 0,04 0,82
к1895694 0,07 0,70 -0,17 0,37 0,12 0,52
к2113794 0,15 0,47 -0,19 0,34 -0,13 0,53
к17742134 -0,17 0,41 -0,16 0,43 -0,15 0,47
к929939 0,06 0,78 0,07 0,76 -0,27 0,20
к1424943 МА МА МА МА МА МА
к6713811 -0,05 0,81 -0,23 0,25 0,13 0,50
к1424941 -0,28 0,13 -0,19 0,31 -0,21 0,26
к10497024 0,10 0,60 0,15 0,44 -0,25 0,20
к2161983 0,05 0,80 0,09 0,63 -0,23 0,20
к1128919 0,05 0,79 0,12 0,49 -0,25 0,17
к2288190 -0,13 0,48 -0,26 0,14 -0,04 0,82
к3754541 -0,21 0,26 -0,14 0,44 -0,20 0,26
к7581537 -0,07 0,75 -0,03 0,90 0,03 0,90
к10497025 0,28 0,17 0,26 0,21 -0,08 0,70
к13008497 0,11 0,61 0,13 0,54 -0,25 0,23
гв1469211 -0,19 0,36 -0,17 0,42 -0,08 0,70
к3768687 0,07 0,73 0,11 0,62 -0,29 0,17
г«13026650 -0,07 0,75 0,01 0,97 -0,22 0,27
к3764955 0,02 0,94 0,06 0,75 -0,04 0,85
к7601098 -0,19 0,32 -0,42 0,02 -0,52 <0,01
к3820716 -0,14 0,46 -0,12 0,55 -0,41 0,03
к2303392 -0,07 0,74 0,03 0,88 -0,30 0,12
1^13430086 -0,02 0,91 -0,21 0,25 0,06 0,74
к17692648 -0,22 0,22 -0,20 0,27 -0,13 0,48
Примечание. МА — анализ невозможен, так как во всех подгруппах выявлен одинаковый генотип; г — коэффициент корреляции; * — различия статистически значимы.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Dekker G.A., de Vries J.I.P., Doelitzsch P.M. Underlying disorders associated with severe early-onset preeclampsia. Am. J. Obstet Gynecol. 1995; 173: 1042-8.
2. Bertina R.M., Koeleman B.P., Koster T. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature. 1994; 6475: 64-7.
3. Савельева Г.М., Кулаков В.И., Серов В.Н. Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению гестозов: Методические указания № 99/80. М.: 2000; 28 с.
4. Вашукова Е.С., Глотов А.С., Иващенко Т.Э., Баринов В.С., Наседкина Т.В., Зайнулина М.С. Современные подходы к диагностике наследственных
форм тромбофилии. Российский педиатрический журнал. 2008; 5: 48-53.
5. Баранов В.С. Генетический паспорт -основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПб: Изд-во Н-Л, 2009; 528 с.
6. Williams P.J., Pipkin F.B. The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive disorders of pregnancy. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2011; 25 (4): 405-17.
7. Oudejans C.B., van Dijk M., Oosterkamp M., Lachmeijer A., Blankenstein M.A. Genetics of preeclampsia: paradigm shifts. Hum. Genet. 2007; 120 (5): 607-12.
8. Fitzpatrick E., Johnson M.P., Dyer T.D., Forrest S., Elliott K., Blangero J., Brennecke S.P., Moses E.K. Genetic association of the activin A receptor gene (ACVR2A) and pre-eclampsia. Mol. Hum. Reprod. 2009; 15 (3): 195-204.
9. Roten L.T., Johnson M.P., Forsmo S., Fitzpatrick E., Dyer T.D., Brennecke S.P., Blangero J., Moses E.K., Austgulen R. Association between the candidate susceptibility gene ACVR2A on chromosome 2q22 and pre-eclampsia in a large Norwegian population-based study (the HUNT study). Eur. J. Hum. Genet. 2009; 17 (2): 250-7.
10. Lokki A.I., Klemetti M.M., Heino S., Hiltunen L., Heinonen S., Laivuori H. Association of the rs1424954 polymorphism of the ACVR2A gene with the risk of pre-eclampsia is not replicated in a Finnish
study population. BMC Res. Notes. 2011; 19 (4): 545.
11. Ворожищева А.Ю., Трифонова Е.А., Бутко Ю.К., Сереброва В.Н., Максимова Н.Р., Павлова К.К., Габидулина Т.В., Степанов В.А. Роль генетической вариабельности локуса ACVR2A в формировании подверженности преэклампсии. Медицинская генетика. 2013; 9 (10): 39-45.
[Vorozhishheva A.Ju., Trifonova E.A., Butko Ju.K., Serebrova V.N., Maksimova N.R., Pavlova K.K., Gabidulina T.V., Stepanov V.A. The role of genetic variability in the formation of locus ACVR2A exposure preeclampsia. Medicinskaja genetika. 2013; 9 (10): 39-45 (in Russian)]
12. Zuk O., Hechter E., Sunyaev S.R., Lander E.S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. PNAS. 2012; 109 (4): 1193-8.
13. Скрябин К.Г., Прохорчук Е.Б., Мазур А.М., Е.С. Булыгина Е.С., Цыганкова С.В., Недолужко А.В, Расторгуев С.М., Матвеев В.Б., Чеканов Н.Н., Горанская Д.А., Теслюк А.Б., Груздева Н.М., Велихов В.Е., Заридзе Д.Г., Ковальчук М.В. Комбинирование
двух технологических платформ для полногеномного секвенирования человека. Acta Naturae. 2009; 3: 26-32. [Skrjabin K.G., Prohorchuk E.B., Mazur A.M., E.S. Bulygina E.S., Cygankova S.V., Ned-oluzhko A.V, Rastorguev S.M., Matveev V.B., Chekanov N.N., Goranskaja D.A., Tesljuk A.B., Gruzdeva N.M., Velihov V.E., Zaridze D.G., Koval'chuk M.V. Combining the two technology platforms for genome-sequencing of human. Acta Naturae. 2009; 3: 26-32 (in Russian)]
14. Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring Harbour. NY; 1989.
15. Lander et al. The Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001; 409 (6822): 860-921.
16. Li H., Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 2010; 26 (5): 589-95.
17. Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R. 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 2009; 25: 2078-9.
18. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28 (8): 1166-7.
19. Garrison E., Marth G. Haplotype-based variant detection from short-read sequencing. URL: http://arxiv.org/abs/1207.3907. Дата обращения: 15.12.2013.
20. Wang K., Li M., Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 2010; 38 (16): e164.
21. Chang X., Wang K. wANNOVAR: annotating genetic variants for personal genomes via the web. J. Med. Genet. 2012; 49 (7): 433-6.
22. URL: http://www.gene-talk.de. Дата обращения: 15.12.2013.
23. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. 2012.
URL: http://www.R-project.org. Development Core Team. Дата обращения: 15.12.2013.
24. Goncalves A., Tikhonov A., Brazma A., Kapushesky M. A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment. Bioinformatics. 2011; 27 (6): 867-9.
25. Zhang Q., Sun H., Jiang Y., Ding L., Wu S., Fang T., Yan G., Hu Y. MicroRNA-181a suppresses mouse granulosa cell proliferation by targeting activin receptor IIA. PLoS One. 2013; 8 (3): e59667.
26. van Dijk M., Oudejans C. (Epi)genetics of pregnancy-associated diseases. Front Genet. 2013; 4 (180): 1-6.
27. URL: http://www.ensembl.org. Дата обращения: 15.12.2013.
Поступила 15 апреля 2014 г.
Новости науки
ГЕРИАТРИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ИЛИ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕРИАТРИЯ?
В журнале Annals of Oncology опубликованы итоги обсуждения нового подхода к лечению немел-коклеточного рака легкого у пожилых людей, проведенного Международным обществом гериатрической онкологии. Примерно 50% больных с этим диагнозом старше 70 лет. Подход к лечению в этом возрасте, по мнению Mary O'Brien (Королевский госпиталь, Великобритания) должен учитывать не только клинические симптомы, но и ожидания и предпочтения больного — ожидаемые преимущества и риски лечения. На передний план, наравне с основной химио-
терапией, выходит адъювантная терапия, снижающая дискомфорт от побочных эффектов лечения. Гериатрия занимает все больше места в терапии различных заболеваний, поскольку согласно предположению аналитиков, к 2050 г. 50% населения Европейского Союза будет старше 50 лет. Средняя продолжительность жизни в большинстве стран Европы превышает 70 лет и учет возрастных особенностей этого возраста должен иметь место и при проведении доклинических исследований и при разработке протокола лечения онкологических больных.
(Clinical Investigation, June, 2014, Vol. 4, No. 6, P.491-493)
