CC BY
21
см
>-
CS
СЕКЦИЯ V
БИОЛОГИЯ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ
со ш и
Доклады
X ш
и
Молекулярная характеристика инвазивных свойств дискретных опухолевых клеток при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы
Н.В. Крахмаль1- 2, М.В. Завьялова1-3, Е.В. Денисов2- 3, Л. А. Таширева1, О.Е. Савельева1, Е.В. Кайгородова1, В.М. Перельмутер1
'НИИ онкологии ФГБНУ«Томский НИМЦРАН», Томск; 2ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский
университет» Минздрава России, Томск; 3ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», Томск
Введение. На основании совокупности морфологических и молекулярно-генетических параметров выделяют 2 варианта опухолевой инвазии: одиночными клетками (индивидуальную) и коллективную. При индивидуальной инвазии миграция злокачественных клеток может осуществляться посредством 2 механизмов: мезенхимального и амебоидного. Тип инвазии опухолевых клеток во многом определяется особенностями тканевого микроокружения и зависит от молекулярных изменений в самих опухолевых клетках. Определение механизма инвазии, который используют одиночно мигрирующие клетки, представляет сложную задачу.
Задачи исследования. Изучить молекулярные характеристики дискретных опухолевых клеток, связанные с инвазивными свойствами при неспецифической карциноме молочной железы, в целях определения типа индивидуальной опухолевой инвазии.
Материалы и методы. Выполняли морфологическое исследование операционного материала от 107 пациенток с раком молочной железы стадии T1—3N0—3M0 без неоадъювантной терапии. В исследование вклю-
чали только случаи с инвазивной карциномой неспецифического типа (Всемирная организация здравоохранения, 2012). В инфильтративном компоненте опухоли оценивали наличие дискретных опухолевых клеток. Для оценки инвазивных свойств одиночных опухолевых клеток использовали антитела к EGFR, FGFR1, интегринам ß3 и ßl, MMP2, MMP9, Racl (Abcam, Великобритания).
Результаты. В инфильтративном компоненте опухоли дискретные опухолевые клетки определялись в 91,6 % случаев. Оценка молекулярных характеристик одиночных клеток показала, что экспрессия маркера Rac1 в этих клетках отмечалась в 22 % случаев, положительная экспрессия интегринов ß1 и ß3 определялась в 14 и 65 % случаев соответственно. Экспрессия ММР2 была обнаружена в 76 % случаев, ММР9 — в 15 %. FGFR1 как маркер мезенхимального типа индивидуальной инвазии в дискретных опухолевых клетках экспресси-ровался в 50 %, при этом экспрессия EGFR — маркера, свойственного для клеток, перемещающихся посредством амебоидного типа движения, регистрировалась у 15 % больных.
Выводы. Исследование показало, что одиночные дискретные опухолевые клетки обладают выраженной функциональной гетерогенностью. Значительная часть из них характеризуется положительной экспрессией маркеров, связанных с мезенхимальным механизмом инвазии, а значит, имеет к нему потенции. Меньшая часть одиночных клеток опухоли не экспрессирует маркеры мезенхимального типа инвазии и, по-видимому, либо имеет потенции к индивидуальному амебоидному варианту движения, либо такие злокачественные клетки временно или постоянно лишены инвазивных свойств.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ
(грант № '6-'5-'022').
Изучение участия лизин-метилтрансферазы белков Set 7/9 в процессах репарации ДНК в результате генотоксического стресса
Д. В. Кригер, Д. Г. Тентлер
ФГБУН«Институт цитологии РАН», Санкт-Петербург
Введение. В настоящее время все более очевидной становится роль посттрансляционных модификаций в регуляции активности белков. Такой путь позволяет клеткам скоординировать сигнальные пути во времени и пространстве. Нарушение функций метилтранс-фераз приводит к серьезным изменениям в клетке, часто являющимися причиной опухолеобразования. В последнее время изучению лизин-метилтрансфераз уделяется большое внимание, особенно в контексте регуляции негистоновых белков. Первым примером регуляции функций белков с помощью метилирования стало обнаружение того, что в ответ на генотоксиче-ский стресс происходит метилирование транскрипционного фактора p53 с помощью Set 7/9. Важно отметить, что среди мишеней Set 7/9 обнаружены p53, E2F1 и NF-kB, которые играют первостепенную роль в процессах канцерогенеза, поскольку они вовлечены в регуляцию контроля клеточного цикла и репарации ДНК. Изменения, затрагивающие системы репарации ДНК, могут быть причиной, обеспечивающей резистентность многих опухолей к противораковой терапии.
Задачи исследования. С помощью флуоресцентной микроскопии определить чувствительность клеточных линий H1299 и U2OS к повреждению ДНК в результате генотоксического стресса. Оценить влияние подавления экспрессии Set 7/9 на чувствительность клеток к повреждению ДНК.
Материалы и методы. Выполняли культивирование клеток, SDS-электрофорез, вестерн-блотт-гибриди-зацию, иммуноокрашивание клеточных препаратов. Проводили анализ фокусов репарации и статистический анализ.
Результаты. Проанализированы линии немелкокле-точного рака легкого H1299 (р53-негативные) и осте-осаркомы U2OS (р53-позитивные). Для подавления Set 7/9 эти линии экспрессировали siRNA-SET 7/9. В качестве группы контроля выступали клетки, экс-прессирующие неспецифичную siRNA. Обе клеточные линии были обработаны доксорубицином в концентрации 0,5 мкМ в течение 12 и 24 ч. После этого проводили оценку степени повреждения ДНК с помощью окрашивания фокусов gamma-H2AX. Выявлено, что в клетках с подавлением Set 7/9 в первые 12 ч интенсивность фокусов была выше по сравнению с клетками контрольной группы. Кроме этого, количество выживших клеток со сниженной экспрессией Set 7/9
было в 3 раза меньше по сравнению с группой контроля. Как и в случае с клетками линии H1299, в клетках линии U2OS co сниженной экспрессией Set 7/9 фокусов оказалась выше.
Выводы. Лизин-метилтрансфераза Set 7/9 участвует в процессе инициации распознавания двуцепочеч-ных разрывов ДНК, что подтверждает значение Set 7/9 в регуляции репарации ДНК. Регуляция ответа клетки на повреждение ДНК с помощью Set 7/9 не зависит от статуса p53 в клетке.
Регуляторные паттерны поляризации моноцитов периферической крови у здоровых лиц и у больных раком молочной железы
М.Н. Стахеева1, А. А. Андреева1, Н.В. Чердынцева1, 2, Е.М. Слонимская1- 3
1НИИ онкологии ФГБНУ «Томский НИМЦ РАН», Томск;
2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», Томск;
3ФГБОУВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск
Введение. Появление, развитие и диссеминация злокачественной опухоли во многом зависят от микроокружения органа первичной локализации и органа метастазирования. Важным элементом тканевого микроокружения являются воспалительные макрофаги, происходящие из моноцитов периферической крови (ПК). Свойства моноцитов ПК, прежде всего М1/М2-поляризованность, вероятно, могут влиять на формирование популяции макрофагов в опухоли. В свою очередь, популяционная структура моноцитов ПК определяется уровнем циркулирующих индукторов поляризации М1- и М2-интерферона у (ИФН-у) и ин-терлейкина 4 (ИЛ-4) соответственно, а также чувствительностью к их воздействию, связанной с наличием соответствующих рецепторов.
Задачи исследования. Сравнение М1- и М2-струк-тур моноцитов ПК и паттернов их регуляции ИФН-у и ИЛ-4 у больных раком молочной железы (РМЖ) и у здоровых лиц.
Материалы и методы. В исследование включены 10 пациенток с впервые диагностированным инвазивным РМЖ и 6 здоровых женщин. В периферической крови методом проточной цитофлуориметрии были определены М1-(CD68+), M2-(CD163+) моноциты, а также моноциты, экспрессирующие рецепторы к ИФН-у (CD119+) и ИЛ-4 (CD124+). Методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови был оценен уровень ИФН-у и ИЛ-4.
Результаты. В проведенном исследовании содержание провоспалительных М1-(CD68+) моноцитов и моноцитов, эксперссирующих рецептор к ИФН-у —
см
CS
со ш и
X ш
и
см
>-
CS
со ш и
X ш
и
индуктору М1-поляризации — не имело статистически значимых различий у здоровых лиц и у больных РМЖ. Однако количество противовоспалительных М2-(СБ163+) моноцитов и моноцитов, экспрессирующих рецептор к индуктору М2-поляризации ИЛ-4, в ПК у больных РМЖ было ниже в 22 и 8 раз по сравнению с соответствующими показателями у здоровых лиц (р < 0,05). При этом концентрация ИФН-у у больных РМЖ была в 7 раз выше, чем у здоровых лиц (р < 0,05), в то время как содержание ИЛ-4 не имело различий. У больных РМЖ отсутствовали характерные для здоровых лиц обратные корреляционные связи между уровнем ИЛ-4 и М1-(СБ68+) моноцитами, а также между ИФН-у и М2-(СБ163+) моноцитами, что предполагает наличие других регуляторных паттернов.
Выводы. В отличие от здоровых лиц у больных РМЖ в ПК снижен уровень М2-моноцитов и моноцитов, чувствительных к действию М2-индуктора ИЛ-4. Для больных РМЖ характерна утрата обратных регуляторных взаимосвязей между цитокинами-индукто-рами М1-/М2-поляризации и М1-/М2-популяциями.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 16-54- 76015/16).
Ассоциация экспрессии ЮРВР-б с метаболическим синдромом, №№ и рецепторами адипонектина у больных колоректальным раком
Н.В. Юнусова, Л. В. Спирина, И. В. Кондакова, С. Г. Афанасьев, А. Е. Фролова
НИИ онкологии ФГБНУ« Томский НИМЦ РАН», Томск
Введение. Роль белков системы инсулиноподобных факторов роста (ЮБз) значима в таких сложных процессах, как опухолевая инвазия и метастазирование. Белок, связывающий инсулиноподобные факторы роста 6 (ЮРВР-6), позиционируется как уникальный белок среди других IGFBPs, имеющий в 20—100 раз более высокую аффинность к IGF-2, чем к IGF-1. Кроме этого, у этого белка выявлены IGFs-независимые эффекты.
Задачи исследования. Изучение экспрессии IGFBP-6 в ткани колоректального рака и анализ во взаимосвязи с основными клинико-морфологическими параметрами, уровнем рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) и рецепторами адипонектина (AdipoR1, AdipoR2) для понимания его вовлеченности в канцерогенез данных опухолей, а также для выявления возможных взаимосвязей с адипонектин-опосре-дованным сигналингом.
Материалы и методы. Уровень экспрессии матричной РНК (мРНК) IGFBP-6 и уровень белковой экспрессии были проанализированы методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и вестерн -блоттингом у 56 больных колоректальным раком. ELISA и проточную цитофлуориметрию использовали для оценки AdipoR1, AdipoR2 и IGF-IR в ткани опухоли.
Результаты. Выявлено, что уровень мРНК IGFBP-6 и белковая экспрессия были выше у больных колорек-тальным раком на фоне метаболического синдрома по сравнению с больными без метаболических нарушений. Обнаружена зависимость экспрессии IGFBP-6 от степени поражения лимфатических узлов. Были выявлены положительные корреляции между экспрессией IGFBP-6 и AdipoR1, а также между экспрессией IGFBP-6 и AdipoR2 и экспрессией IGF-IR и AdipoR1. Данные корреляционного анализа подтверждены данными нелинейного регрессионного анализа.
Выводы. Уровень мРНК IGFBP-6 и уровень белковой экспрессии IGFBP-6 в колоректальных карциномах ассоциировались с наличием метаболического синдрома, а уровень белка, кроме того, — с лимфогенным мета-стазированием. Выявленные связи свидетельствуют о перекресте IGF-IR-опосредованного и адипонектин-опосредованного сигнальных путей в колоректальных карциномах. IGFBP-6 у больных колоректальным раком можно рассматривать в качестве маркера, ассоциированного с метаболическим синдромом. Необходимы дополнительные исследования для выяснения механизмов вовлеченности IGFBP-6 в патогенез колорек-тального рака, включая выяснение ассоциаций форм IGF-IR (фосфорилированной, нефосфорилирован-ной и ассоциированной с рецептором адипонектина) с лимфогенным метастазированием при колоректальных карциномах для поиска перспективных молекулярных мишеней для антиметастатической терапии карцином данного типа.
Постеры
см
Кластерный анализ экспрессионных профилей микроРНК при раке молочной железы
К. А. Гришина1, Н.И. Поспехова2, Т. А. Музаффарова1, В. А. Хайленко3, А. В. Карпухин1
ФГБНУ«Медико-генетический научный центр», Москва;
2ФГБУ«Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, Москва; 3ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Введение. МикроРНК относятся к классу коротких (18—25 нуклеотидов) не кодирующих белок РНК и принимают участие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов путем деградации мишеней матричной РНК или нарушения трансляции. Исследование микроРНК имеет значение для понимания регуляции действия генов при злокачественных опухолях и может служить источником новых прогностических и пре-диктивных маркеров.
Задачи исследования. Исследование характеристик экспрессии микроРНК в опухолях при раке молочной железы (РМЖ) и анализ возможностей их использования в качестве маркеров.
Материалы и методы. Исследованы 56 образцов опухолевых и гистологически нормальных тканей при РМЖ. Суммарную РНК выделяли из образцов с помощью набора RNeasy Mini Kit, Qiagen. Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). Уровень экспрессии 16 микроРНК измеряли с помощью прибора Step-OnePlus (Applied Biosystems, США). Учитывали более чем двукратное изменение уровня экспрессии.
Результаты. В экспериментальной работе проанализирована экспрессия набора микроРНК у больных РМЖ. Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени определена экспрессия следующих микроРНК: miR-29a, -31, -34a, -155, -192, -335, -141, -195, -125b, -145, -182, -146a, -10b, -21, -221, -222. При кластерном анализе результатов найдены образования 3 кластеров коэкспрессии микроРНК. В 1-м кластере отмечается обогащение больными с инфиль-тративной протоковой формой РМЖ с метастазами. Анализ показал, что накопление больных с метастазами в этом кластере по отношению к другим кластерам близко к статистически значимому (p = 0,07; отношение шансов 5; 95 % доверительный интервал 0,9—32,0). Изучены различия в экспрессии микроРНК в разных кластерах. В отличие от 2-го и 3-го, 1-й кластер, обогащенный больными с метастатическим РМЖ, показывает дифференциальную гиперэкспрессию микроРНК
ш1Я-29а, -192, -335,-141. Проанализирована ассоциация этих микроРНК со случаями метастазов. Во 2-м кластере выявлен высокий уровень экспрессии ш1Я-125Ь, -145, -182, а в 3-ем — низкая экспрессия ш1Я-221 и -222.
Выводы. Показана ассоциация некоторых микроРНК в 1-м кластере с метастазированием РМЖ.
Экспрессия эктонуклеотидазы 0039 004+-Т-клетками больных колоректальным раком
Г. А. Жулай1, А. В. Чуров1, Е.К. Олейник1, А. А. Романов2, П.Н. Кравченко1, В.М. Олейник1
ФГБУН«Институт биологии Карельского научного центра РАН», Петрозаводск;
2ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер», Петрозаводск
Введение. Современные исследования признают важность качественного и количественного популя-ционного состава лимфоцитов у онкологических больных, особенно у больных колоректальным раком (КРР). В последнее время подчеркивается значимость при канцерогенезе эктонуклеозидтрифосфат дифосфоги-дролазы-1 (СБ39). СБ39 участвует в генерации внеклеточного аденозина, оказывающего иммуносупрессорное действие через А2А-рецепторы и способствующего развитию опухоли.
Задачи исследования. Оценка уровня экспрессии СБ39 СБ4+ Т-клетками больных КРР.
Материалы и методы. Обследованы 42 больных КРР и 30 здоровых доноров. Проведен анализ фенотипов клеток периферической крови, а также опухолеин-фильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ), выделенных из клинических образцов опухолевой ткани. Анализ проводили до начала терапии. Экспрессию СБ3, СБ4, СБ25, СБ127, БОХР3, СБ39 оценивали методом проточной цитометрии. Достоверность различий между группами рассчитывали с помощью критерия Манна — Уитни при уровне значимостир < 0,05.
Результаты. Накопление периферических СВ4+СБ39+-Т-клеток наблюдалось на поздних (III—IV) стадиях КРР. Среди ОИЛ количество этих клеток было в 4 раза выше (р < 0,05), чем в крови тех же больных. Увеличение числа СБ39+-клеток среди ОИЛ отмечалось и в популяции СБ3+СБ4 - Т-клеток. При этом доля СБ4 - СБ39+-клеток была выше в опухолевой ткани.
Важную роль при канцерогенезе играет субпопуляция регуляторных СБ4+-Т-клеток (Тге§). В крови больных КРР при анализе СВ4+СБ25+СБ1271о/ - -Тте^ наблюдали усиление уровня экспрессии молекулы СБ39.
CS
со ш и
X ш
и
см
>-
CS
со ш и
X ш
и
Экспрессия СБ39 у Тге§-клеток увеличивается уже на начальных (I—II) этапах развития опухоли (55,24 ± 4,20 %) по сравнению с группой контроля (41,16 ± 3,10 %; р < 0,05) и достигает максимальных значений у больных с более поздними стадиями КРР (67,95 ± 3,10 %; с контролемр < 0,001, с I—II стадиямир < 0,05), тогда как клетки с фенотипом, не характерным для Тге§, СБ4+СБ25 - и СБ4+СБ25+-Т-клетки, не отличались такой закономерностью. Кроме того, у больных КРР обнаружена положительная корреляция экспрессии СБ39 с транскрипционным фактором FOXP3 на СБ4+-Т-клетках (г = 0,47;р < 0,006). Среди ОИЛ СБ4+СБ25Ы Тге§-клетки также отличались от периферических более высокой экспрессией эктонуклеотидазы СБ39. Повышенная экспрессия этой молекулы наблюдалась и у нерегуляторных клеток с фенотипами СВ4+СВ25-и СБ4+СБ25+.
Выводы. Таким образом, развитие опухоли у больных КРР сопровождается усилением экспрессии СБ39 СБ4+-Т-клетками, что может быть связано с увеличением числа Тге§-клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 16-34-00970, бюджетная тема
№ 0221-2014-0011.
Взаимосвязь плотности сосудов опухолевой ткани рака молочной железы с уровнем различных популяций циркулирующих
опухолевых клеток в крови больных до биопсии
Е.В. Кайгородова1-3, В.М. Перельмутер1,
Н.А. Тарабановская1, Е.В. Денисов1, О.Е. Савельева1, 2, Л. А. Таширева1, 2
НИИ онкологии ФГБНУ«Томский НИМЦ РАН», Томск;
2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», Томск;
3ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск
Введение. Оценка и характеристика циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) стали одним из основных направлений трансляционных исследований рака.
Задачи исследования. Оценка взаимосвязи плотности сосудов опухолевой ткани рака молочной железы (РМЖ) с уровнем различных популяций ЦОК в крови больных до биопсии.
Материалы и методы. Материалом для исследования служила венозная гепаринизированная кровь, взятая до биопсии, и парафиновые блоки опухолевой ткани РМЖ. В проспективное исследование включены 22 больные с впервые диагностированным инвазивным РМЖ в возрасте 18—50 лет, с объемом опухоли от 2,0 см,
стадией T2—4N0—3M0, поступившие на лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. На основе молекулярной панели маркеров к EpCam, СБ45, CD44, CD24 и N-cadherin определяли ЦОК с признаком стволо-вости и ЕМТ (epithelial-mesenhimal transition). Уровень ЦОК (клеток/мл) оценивали методом проточной лазерной цитометрии на аппарате BD FACSCanto (США) с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и меченных моноклональных антител к CD45 клон F10-89-4 (PE/Cy7) (Abcam, Великобритания), CD44 клон [IM7] (FITC) (Abcam, Великобритания), CD24 клон [SN3] (Phycoerythrin) (Abcam, Великобритания), EpCAM клон [VU-1D9] (PerCP/Cy5.5) (Abcam, Великобритания) и CD325 (N-Cadherin) (клон 8C11, APC) (Biolegend, США). Плотность сосудов оценивали микроскопически на 1 мм2 опухолевой ткани с помощью светового микроскопа Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Германия).
Результаты. В результате проспективного исследования больных РМЖ была выявлена прямая положи -тельная корреляционная связь количества ЦОК с признаками ЕМТ без признаков стволовости (EpCam+CD45— CD44 — CD24N-cadherin+) в крови до биопсии и плотностью сосудов опухолевой ткани (коэффициент Спирмена 0,962;р (2-сторон.) = 0,038; n = 7). Уровень ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ с фенотипом EpCam - CD45 — CD44+CD24 — N-cadherin- также имел положительную корреляционную связь с количеством сосудов в опухолевой ткани (коэффициент Спирмена 0,786; р (2-сторон.) = 0,036; n = 7).
Выводы. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень разных субпопуляций ЦОК в крови больных до биопсии связан с количеством сосудов в опухолевой ткани. Полученные результаты интересны с точки зрения изучения механизмов рекрутирования опухолевых клеток из первичной опухоли, их интравазации и появления ЦОК при РМЖ.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 15-34-20864).
Участие белка YB-1 и системы
факторов VEGF-VEGFR в формировании множественной лекарственной устойчивости
Т. С. Ковшова1, Н.И. Моисеева2
1ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова», Москва; 2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Введение. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является одним из основных препятствий на пути успешного лечения больных со злокачественными новообразованиями. Один из возможных регуляторов МЛУ — многофункциональный белок YB-1. Недавно было показано, что после воздействия VEGF-A
может активироваться МЛУ через транслокацию белка УБ-1, действующего как фактор транскрипции для МБШ. Однако исследования взаимосвязи системы АВС-транспортеров, отвечающей за МЛУ белка УБ-1 и УБОБ-зависимых сигнальных систем ведутся недавно и только 2—3 коллективами авторов.
Задачи исследования. Исследовать изменение уровня экспрессии матричной РНК (мРНК) гена УВ-1, локализацию белка УБ-1, генов семейства АВС-транспор-теров и системы УБОБ — УБОБЯ в парах чувствительных и устойчивых опухолевых клеток. Оценить влияние подавления экспрессии гена УВ-1 на экспрессию генов АВС-транспортеров и генов системы УБОБ — УБОБЯ.
Материалы и методы. Были исследованы культуры клеток МСБ-7 и НБЬ-100 (рак молочной железы), КВ3-1 (рак полости рта), а также их устойчивые варианты МСБ-7/Б0Х5, НБЬ-100/Б0Х85, НБЬ-100/Б0Х400 и КВ8-5. Выполняли МТТ-тест, полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, иммуноцито-химическое и цитофлуометрическое исследования.
Результаты. Все полученные сублинии клеток демонстрировали МЛУ, т. е. были резистентны не только к доксорубиницу, но и к паклитакселу, винбластину и цисплатину (к последнему только МСБ-7/В0Х5). Уровень экспрессии мРНК МБШ значительно увеличивался во всех резистентных сублиниях (р < 0,01), тогда как экспрессия других АВС-транспортеров не внесла существенный вклад в возникновение МЛУ. Уровень экспрессии мРНК гена УВ-1 практически не отличается от родительских вариантов. Ядерная локализация УБ-1 обнаруживается в 100 % клеток КВ8-5, в 15 % клеток МСБ-7/Б0Х, тогда как в НБЬ-100/Б0Х белок УБ-1 локализован в цитоплазме клеток. Для всех устойчивых вариантов клеток характерно достоверное увеличение экспрессии УБОБ-С (р < 0,05), при этом экспрессия УБОРЯ3 снижается в линиях РМЖ и увеличивается в линии КВ3-1. Подавление экспрессии мРНК УВ-1 в линии НБЬ-100/Б0Х85 привело к снижению экспрессии МБШ в 1,3 раза, УБОБ-С — в 1,7 раза, а УБаРЯ3 - в 2 раза.
Выводы. Изначальная гипотеза об активации экспрессии мРНК УВ-1 в устойчивых опухолевых клетках не подтвердилась, хотя его локализация изменилась в 2 из 3 исследованных парах. Экспрессия мРНК УБОБ-С значимо изменилась во всех устойчивых культурах по сравнению с родительскими линиями. Подавление экспрессии мРНК УВ-1 приводит к небольшому снижению экспрессии УБОБ-С и УБОРЯ3, и связь этих систем также требует дальнейшего изучения.
Особенности патогенеза и развития локорегионарных рецидивов базально-клеточной карциномы в шейно-лицевом отделе
Е.В. Моисеенко-Голубович, А. Б. Иванова, В.В. Грома, Р.Э. Карл
Рижский университет им. П. Страдиня, Рига
Введение. Базально-клеточная карцинома (БКК) кожи является одной из самых актуальных проблем современной онкологии. Ее диагностицируют в 80 % случаев из всех немеланоцитарных опухолей кожного покрова с преимущественной локализацией в шейно-лицевом отделе 1. В последние годы частота данного заболевания во многих странах постоянно увеличивается, и, несмотря на разнообразность методов лечения, БКК рецидивирует в 20-40 % случаев.
Задачи исследования. Изучение особенностей патогенеза и рецидивирования БКК в шейно-лицевом отделе, анализируя дерматоскопически и морфологически опухолевые и пограничные ткани.
Результаты. Было установлено, что инфильтратив-ный тип БКК характеризуется наибольшей плотностью арборизированных сосудов по сравнению с поверхностным мультицентрическим и нодулярным типами. Кроме этого, при изучении степени инвазии БКК гистологически в случаях агрессивной опухоли наблюдалось значительно снижение экспрессии ламинина и коллагена 1У типа в базальной мембране. Снижение уровня коллагена 1У типа в комбинации с повышенной экспрессией металлопротеиназ (ММР2, ММР9), возможно, характеризует метастатический потенциал БКК.
Выводы. Выявление взаимосвязи между склонными к рецидивированию типами опухоли и их гистологическими особенностями позволит наиболее эффективно применять возможности терапии и снизить риск развития рецидивов в будущем.
Возможность использования двойной иммунофлуоресценции для оценки экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, опухолевых стволовых клеток и подтипов рецепторов эстрогенов
М.В. Пучинская
УО «Белорусский государственный медицинский университет», Минск
см
св
со ш и
X ш
и
Введение. Флуоресцентная микроскопия является перспективным современным методом морфологиче-
см
>-
CS
со ш и
X ш
и
ских исследовании, одним из преимуществ которого считается возможность одновременного выявления в тканях нескольких маркеров при использовании антител, меченых различными флуорохромами (двойная иммунофлуоресценция, 2ИФ). Это оказывается необходимым для оценки эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) (выявление коэкспрессии клеткой эпителиальных и мезенхимальных маркеров), опухолевых стволовых клеток (ОСК) (коэкспрессия нескольких маркеров позволяет с большей вероятностью говорить о наличии у клетки свойств ОСК), а также коэкспрессии различных подтипов рецепторов, например, рецепторов эстрогенов (РЭ) а и в (обладают различными эффектами на клетки).
Задачи исследования. Оценка возможности использования 2ИФ для одновременного выявления 2 маркеров ЭМП, ОСК или подтипов РЭ в раке.
Материалы и методы. Исследование проведено на формалин-фиксированной ткани рака предстательной железы (РПЖ) и рака эндометрия, полученных при радикальных операциях, с использованием первичных антител к Е- и N-кадгеринам, маркерам ОСК CD44 и CD133, РЭа и РЭр и вторичных козьих антикроличьих и антимышиных антител, меченых флуорохро-мами AlexaFluor 488 и 594. Окрашивание оценивали на микроскопе Zeiss AxioImager A2 с использованием соответствующих светофильтров.
Результаты. При исследовании маркеров ЭМП отмечена коэкспрессия Е- и N-кадгеринов на мембранах отдельных клеток РПЖ, что является признаком ЭМП в них. Также в клетках РПЖ наблюдали мембранную экспрессию СD44, преимущественно на базолате-ральных мембранах. Экспрессия СD133 в изученных на данный момент образцах РПЖ не отмечена, что, вероятно, свидетельствует о редкости его экспрессии в РПЖ, так как в положительном контроле (рак эндометрия) при отработке методики выявлялось специфичное окрашивание апикальных мембран опухолевых клеток. Экспрессия РЭ оценена в раке эндометрия, где РЭа обнаруживали преимущественно в строме, а РЭр — в ядрах опухолевых клеток. Их коэкспрессия в одной клетке, поиск которой был целью 2ИФ, в изученных на данный момент образцах не выявлена, впоследствии ее поиск будет продолжен в РПЖ.
Выводы. В данной пилотной работе показана принципиальная возможность применения 2ИФ для одновременной визуализации в опухоли 2 маркеров биологических процессов, что позволит выявлять их с большей достоверностью, чем при оценке каждого маркера на отдельном стекле, и сравнивать биологические особенности опухолей с их клинико-морфоло-гическими характеристиками, прогнозом и ответом на терапию.
Первый опыт применения двойной иммунофлуоресценции для оценки эпителиально-мезенхимального перехода в раке предстательной железы
М.В. Пучинская
УО «Белорусский государственный медицинский университет», Минск
Введение. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) в настоящее время считается одним из механизмов приобретения опухолевой клеткой промета-статического потенциала. Основным его признаком является одновременная экспрессия клетками эпителиальных и мезенхимальных маркеров, например, Е- и N-кадгерина (так называемое «переключение кадгеринов»). Для выявления этого феномена возможно использование метода двойной иммунофлуоресценции (2ИФ), позволяющего визуализировать одновременно 2 маркера с использованием различных флуорохромов.
Задачи исследования. Описать первый опыт применения 2ИФ для выявления ЭМП в клетках рака предстательной железы (РПЖ) на основе коэкспрессии Е- и N-кадгеринов.
Материалы и методы. Оценена экспрессия Е-кад-герина (первичные моноклональные мышиные антитела, BioGenex) и N-кадгерина (поликлональные кроличьи антитела, ThermoScientific) в образцах РПЖ, полученных при радикальной простатэктомии, с использованием вторичных козьих антител, меченых флуорохромами AlexaFluor 488 и 594 (Molecular Probes). Оценка окрашивания произведена на микроскопе Zeiss AxioImager A2.
Результаты. Экспрессию обоих типов кадгеринов отмечали преимущественно на мембранах эпителиальных клеток в виде гомогенного мембранного окрашивания. При этом экспрессия Е-кадгерина в раке была снижена в различной степени по сравнению с неопухолевым эпителием. Экспрессию N-кадгерина отмечали преимущественно в раковых клетках, однако в некоторых клетках доброкачественных желез также отмечалось окрашивание. В ряде клеток наблюдали также цитоплазматическую экспрессию маркера. Отмечали наличие большого числа раковых клеток, ко-экспрессирующих оба типа кадгеринов, что выражалось в желтом свечении мембран в результате сочетания красной и зеленой флуоресценции отдельных меток. Степень повышения экспрессии Е-кадгерина и снижения экспрессии N-кадгерина в разных клетках была различной, однако на данном этапе работы их количественную оценку не проводили. В дальнейшем планируется разработка алгоритма компьютерного анализа микропрепаратов для объективизации оценки степени изменения экспрессии отдельных кадгеринов.
Также на большем объеме материала планируется оценить связь коэкспрессии кадгеринов и наличия феномена ЭМП со стандартными клинико-морфологиче-скими характеристиками опухоли.
Выводы. В отдельных клетках РПЖ отмечается коэкспрессия эпителиального маркера Е-кадгерина и мезенхимального маркера N-кадгерина, что можно считать признаком нахождения этих клеток в состоянии ЭМП. 2ИФ является подходящим методом выявления подобных изменений в клетках.
Повышенная лекарственная устойчивость раковых стволовых клеток в условиях гипоксии
Е.Н. Толкунова1, М.А. Иванова2, С. А. Кошкин1
ФГБУН«Институт цитологии РАН», Санкт-Петербург; биологический факультет ФУБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Введение. Рак толстой кишки занимает 4-е место в статистике онкологической заболеваемости, по данным Всемирной организации здравоохранения. Согласно концепции раковых стволовых клеток (РСК) в опухоли существует минорная популяция клеток, характеризующихся повышенной резистентностью к воздействию цитостатических агентов и способных формировать опухоли в отдаленных органах. Известно, что значимым фактором поддержания уникальных свойств РСК является гипоксия.
Задачи исследования. Изучение чувствительности РСК аденокарциномы толстой кишки человека к цито-статическому агенту 5-фторурацилу (5-ФУ) в условиях нормо- и гипоксии.
Материалы и методы. Для получения клеточных культур использовали опухолевый материал, получен-
ный в ходе хирургического лечения. Культивирование опухолевых клеток проводили в среде ВМБМ/Б12 с 10 % ББ8. Далее трансдуцировали клетки лентиви-русной репортерной конструкцией 80ЯБХ6х и отбирали устойчивые клоны на среде, содержащей пуромицин. Анализировали экспрессию стволовых маркеров (0с14, 8ох2, №по§) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Имитировали условия гипоксии добавлением в культуральную среду хлорида кобальта. После культивирования в течение 2 сут в среде, содержащей 5-ФУ в условиях нормо- и гипоксии, измеряли жизнеспособность клеток методом МТТ.
Результаты. Используя материал, полученный при резекции аденокарциномы толстой кишки человека, мы получили 2 первичные клеточные культуры. После введения репортерной конструкции мы отобрали клоны клеток, экспрессирующих эндогенные стволовые факторы. Была проанализирована лекарственная устойчивость к цитостатику 5-ФУ у отобранных клонов при нормальном культивировании и в условиях гипоксии. Оказалось, что все клоны линии БСК6 характеризовались повышенным уровнем резистентности к 5-ФУ, причем в условиях гипоксии резистентность возрастает. Лекарственная устойчивость клонов линии БСК1, обогащенных по экспрессии эндогенных стволовых факторов, однако, не отличалась от исходной.
Выводы. Использованная для обогащения стволового компонента клеточной популяции лентиви-русная конструкция позволила провести селекцию клеток, характеризующихся повышенной лекарственной устойчивостью. Они проявляли большую резистентность в условиях гипоксии. Наблюдаемая закономерность отмечалась только для одной из полученных линий, что, вероятно, связано с различиями в свойствах исходных опухолей.
см
CS
со ш и
X ш
и
Тезисы
см
>-
CS
со ш и
X ш
и
Связь лимфогенного метастазирования при раке прямой кишки с параметрами опухолевого неоангиогенеза
С. Р. Алтыбаев1, И. В. Степанов1, 2, К. В. Рачковский2, С.Г. Афанасьев2, С.В. Вторушин1, 2, М.В. Завьялова1, 2
'ФГБОУВО «Сибирский государственный медицинский
университет» Минздрава России, Томск; НИИ онкологии ФГБНУ «Томский НИМЦРАЛ», Томск
Введение. Рак прямой кишки является 3-м в мире по распространенности злокачественным новообразованием. Известно, что темпы роста первичного опухолевого узла, размером в несколько миллиметров, зависят от выраженности сосудистого компонента опухоли. Процесс формирования новых микрососудов под воздействием ростовых факторов, синтезируемых опухолевыми клетками, в литературе называется нео-ангиогенезом. Оценка опухолевого неоангиогенеза заключается в определении плотности микрососудов и «сосудистых почек», представленных кластером про-лиферирующих эндотелиоцитов. Необходимость изучения неоангиогенеза обусловлена развитием лимфогенных метастазов уже на ранних стадиях злокачественного процесса при раке прямой кишки.
Задачи исследования. Исследование плотности микрососудов и «сосудистых почек» у больных раком прямой кишки на различной глубине инвазии опухоли, оценка взаимосвязи процессов опухолевого нео-ангиогенеза с параметрами лимфогенного метастази-рования.
Материалы и методы. Исследовали операционный материал от 149 больных (95 (64 %) мужчин и 54 (36 %) женщин) аденокарциномой прямой кишки стадии T1—4N0—2M0, проходивших химиолучевую терапию в неоадъювантном и адъювантном режимах в торако-абдоминальном отделении Томского НИИ онкологии в период с 2000 по 2015 г. Средний возраст больных составил 57,6 ± 9,3 года. Плотность микрососудов и «сосудистых почек» в опухолевой ткани оценивали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии CD34 (Dako) на различной глубине инвазии.
Результаты. При изучении плотности микрососудов и «сосудистых почек» в опухолевой ткани на различной глубине инвазии оказалось, что в слизистой оболочке прямой кишки плотность микрососудов выше при наличии лимфогенных метастазов по сравнению с группой без лимфогенного метастазирования (11,9 ± 5,2 и 8,4 ± 3,5 соответственно; f = 4,6; р = 0,04). Плотность
микрососудов в подслизистом слое, мышечной, серозной или адвентициальной оболочках прямой кишки не различались в группах с наличием или отсутствием лимфогенных метастазов. Плотность «сосудистых почек» во всех слоях стенки прямой кишки не была связана с лимфогенным метастазированием.
Выводы. Проведенное исследование показывает необходимость подробного изучения опухолевого нео-ангиогенеза у пациентов с раком прямой кишки с учетом локализации микрососудов в различных слоях стенки органа. Данные, полученные в ходе исследования, позволяют рассматривать иммуногистохимиче-скую идентификацию опухолевых сосудов как метод раннего прогнозирования риска возникновения лим-фогенного метастазирования при раке прямой кишки по биоптатам.
Изучение маркеров эпителиально-мезенхимального перехода при раке молочной железы
С.В. Вторушин1, 2, М.В. Завьялова1-3, Н.В. Крахмаль1, 2, К.Ю. Христенко1, 2
1НИИ онкологии ФГБНУ «Томский НИМЦ РАН», Томск;
ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск;
ФГАОУВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», Томск
Введение. При развитии и прогрессировании злокачественной опухоли ее клетки приобретают повышенный потенциал к миграции и инвазии, что является необходимым для реализации процесса метастазиро-вания. Обсуждается вопрос о том, что в основе инва-зивного роста и прогрессирования опухоли лежит механизм эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при котором опухолевые клетки становятся подвижными, могут отделяться от эпителиального пласта, приобретая «локомоторный фенотип». Запуск ЭМП в злокачественных опухолях происходит при активации различных транскрипционных факторов, в частности фактора транскрипции Snail и др.
Задачи исследования. Изучение особенности экспрессии транскрипционного фактора Snail в различных структурах инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.
Материалы и методы. Выполнено морфологическое исследование операционного материала от 107 пациенток, больных раком молочной железы стадии
T1—3N0—3M0 без неоадъювантной терапии. В исследование включали только случаи с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы (Женева, 2012). В инфильтративном компоненте опухоли определяли наличие альвеолярных, трабекулярных, тубулярных и солидных структур как проявлений коллективной инвазии. Оценивали наличие дискретных групп опухолевых клеток как проявлений индивидуальной инвазии. Для иммуногистохимического исследования использовали антитела к Snail (Abcam, Великобритания).
Результаты. Исследование показало, что экспрессия Snail реже обнаруживалась в дискретных группах опухолевых клеток (77 %) по сравнению с альвеолярными (90 %; р = 0,02), тубулярными (100 %; p = 0,005), трабекулярными (96 %; p = 0,002) и солидными (95 %; p = 0,0005) структурами. При этом процент клеток с положительной экспрессией был ниже в солидных структурах (69,7 ± 16,7), чем в альвеолярных (78,2 ± 13,8; p = 0,001), тубулярных (77,1 ± 15,1; p = 0,03), трабеку-лярных (84,0 ± 28,0; p = 0,0002) и группах клеток (84,6 ± 28,2; p = 0,0001).
Выводы. Экспрессия Snail регистрировалась в большинстве случаев во всех многоклеточных структурах опухоли, являющихся, по сути, морфологическим проявлением коллективной инвазии, реже экспрессия отмечалась в дискретных клетках. Это говорит о том, что экспрессия фактора Snail может быть проявлением начальной стадии ЭМП, и возможно поэтому его экспрессия была обнаружена в большинстве случаев и преимущественно в многоклеточных структурах ин-фильтративного компонента опухоли. Эти данные были выявлены впервые, в связи с чем заслуживают внимания и требуют дальнейшего изучения.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента РФ (№ 14.
Ж01.16.9084-МДот 14.03.2016 г.).
Взаимосвязь между титром антител вируса Эпштейна-Барр, присутствием вирусного генома и экспрессией LMP-1 у больных с опухолями слюнных желез, раком ротовой полости и карциномой носоглотки
наиболее распространенной формой рака во всем мире. Высокий риск развития опухолей ротовой полости связывают с инфицированием организма вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) в юности и его последующей реактивацией в зрелом возрасте. Исследования в области вирусологии и онкологии подтверждают, что при поддержке вируса ВЭБ происходят злокачественные трансформации инфицированных клеток организма.
Задачи исследования. Оценка титров антител ВЭБ в сыворотке крови, определение связи с LMP-1 (онко-белком вируса ВЭБ) и наличия ДНК ВЭБ в опухолевых тканях. Сравнение данных показателей в случаях доброкачественных и злокачественных опухолей слюнных желез, плоскоклеточного рака полости рта с раком носоглотки.
Материалы и методы. В целях идентификации LMP-1 и ДНК ВЭБ для исследования были отобраны образцы тканей (диаметр около 5 мм) опухоли слюнных желез, плоскоклеточного рака ротовой полости и рака носоглотки во время операции.
Результаты. Иммуногистохимически в базальном и парабазальном слоях плоскоклеточного рака ротовой полости был выявлен значительный уровень LMP-1. Все образцы плоскоклеточного рака также показали экспрессию LMP-1 в инфильтрированых лимфоцитах. В оральных образцах опухолевых тканей обнаружена ДНК уровня ВЭБ у 4 пациентов с плоскоклеточным раком ротовой полости. ДНК ВЭБ была определена во всех образцах плоскоклеточного рака полости рта классов 2, 3 при клинической стадии III, IV. У пациентов с карциномой полости рта повышенные титры анти-ВЭБ антитела соответствуют наличию ДНК ВЭБ в опухолевых тканях.
Выводы. Мы пришли к выводу, что вирус ВЭБ может инфицировать в скрытой форме слизистую оболочку полости рта за пределами области носоглотки. Присутствие LMP-1 — главного онкобелка вируса, во многих ВЭБ-положительных образцах плоскоклеточного рака ротовой полости различной локализации указывает на то, что эта скрытая инфекция может влиять на онкогенную трансформацию инфицированного эпителия полости рта.
сч
CS
со ш и
X ш
и
Е.В. Моисеенко-Голубовича1, А. Б. Иванова1, В. В. Грома1, М.Ф. Муровская1 2
1Рижский университет им. П. Страдиня, Рига; 2Институт микробиологии и вирусологии им. А. Кирхенштейна, Рига
Введение. Рак ротовой полости, по оценкам Всемирной организации здравоохранения, является 8-й
