Секреция ангиопоэтинов тканью плаценты при физиологическом развитии беременности и при гестозе

Степанова Ольга Игоревна; Лесничия Марианна Валерьевна; Львова Татьяна Юрьева; Соколов Дмитрий Игоревич; Сельков Сергей Алексеевич

Т. Ю. Львова, Д. И. Соколов, ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ

С. А. Сельков РАЗВИТИИ БЕРЕМЕННОСТИ И ПРИ ГЕСТОЗЕ

ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,

Санкт-Петербург УДК: 618.2+618.3-008.6]:618.36-07

■ Ангиопоэтины определяют развитие сосудистой сети плаценты. Целью исследования явилась оценка секреции Ang-1 и Ang-2 тканью плаценты при физиологической беременности и при гестозе. Физиологическая беременность сопровождается усилением секреции Ang-1 и снижением секреции Ang-2. Нарушение формирования сосудистой сети плаценты при гестозе по сравнению с физиологической беременностью сопровождается сниженной секрецией Ang-1 и Ang-2 клетками плаценты.

■ Ключевые слова: ангиопоэтин; ангиогенез; плацента; гестоз.

Физиологическое течение беременности требует адекватного формирования сосудистой сети плаценты для поддержания возрастающих с развитием плода метаболических процессов. Развитие сосудистой сети плаценты включает ва-скулогенез, разветвляющий и неразветвляющий ангиогенез. В процессе васкулогенеза происходит образование сосудов de novo, тогда как при ангиогенезе — формирование капилляров, отходящих от уже сформированных сосудов. Главным митогеном эндотелиальных клеток является VEGF, стимулирующий как васкулогенез, так и ангиогенез. Совместно с VEGF в регуляции ангиогенеза участвуют ангиопоэтины Ang-1 и Ang-2. Ang-1 снижает проницаемость сосудов путем усиления межклеточного взаимодействия эндотелиальных клеток сосудов [7, 16], по различным данным обладает ми-тогенным эффектом в отношении клеток эндотелия [5] или же, напротив, ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток [7], ингибирует апоптоз, стимулирует миграцию эн-дотелиальных клеток и образование микротрубочек сосудов [9], стимулирует синтез NO эндотелиальными клетками [5, 9], стимулирует дифференцировку предшественников эндотелиальных клеток [7], поддерживает целостность сосуда путем привлечения перицитов и усиления адгезии между перицитами, эндотелиальными клетками и гладкомышечными клетками [5, 16]. Ang-2 стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток в меньшей степени, чем Ang-1. Под действием Ang-2 сосуды остаются более пластичными и чувствительными к действию VEGF. Ang-2 снижает межклеточную адгезию, стимулирует ремоделирование межклеточного матрикса (на клетках глиомы показано, что Ang-2 стимулирует активацию металлопротеиназы матрикса-2 [8]), и как следствие — способствует увеличению просвета сосудов [16]. Эффект, оказываемый Ang-2 на эндотелиальные клетки и сосудистое русло, зависит от присутствия VEGF: при действии совместно с VEGF ангиопоэтин-2 является про-ангиогенным фактором, в отсутствие VEGF — стимулирует разрушение внеклеточного матрикса и регрессию сосудов вследствие нарушения межклеточных связей [2].

В ткани плаценты Ang-1 и Ang-2 экспрессируется клетками стромы ворсин, окружающими сосуды. Ang-1 экспрессирован в первом триместре беременности на границе цитотрофобла-ста и синцитиотрофобласта, тогда как на терминальных сроках беременности он экспрессируется в строме, окружающей сосуды. Экспрессируясь в децидуальной ткани, Ang-1 играет роль хемоаттрактанта для клеток трофобласта [14].

На ранних сроках беременности мРНК Ang-2 обнаружена в клетках цитотрофоблата. С помощью гистохимического анализа показано, что белок Ang-2 экспрессируется также клетками

синцитиотрофобласта. На поздних сроках наблюдается слабая экспрессия белка Ang-2 на границе цитотрофобласта и синцитиотрофобласта. Кроме того, Ang-2 экспрессируется некоторыми макрофагами стромы ворсин плаценты [14].

Ang-1 и Ang-2 являются специфическими хемоаттрактантами эндотелиальных клеток. Оба фактора действуют через специфические рецепторы Tie-1 и Tie-2. Внутриклеточные домены Tie-1 и Tie-2 являются тирозинкиназами с короткой тирозиновой вставкой и карбокси-концевым хвостом. Внутриклеточные домены Tie-1 и Tie-2 имеют гомологию около 76 %, внеклеточные — 31 %. Хорошо изучены функции Tie-2, тогда как Tie-1 обнаружен недавно и его функции остаются неясными. Ang-1 влияет через Tie-2 на пролиферацию, миграцию, апоптоз эндотелиальных клеток, проницаемость сосудов, экспрессию эндотелиальными клетками адгезионных молекул, тем самым оказывая влияние на развитие воспалительного процесса, а также на процесс реорганизации сосудистого русла [7, 9, 16]. Существуют данные, свидетельствующие о том, что в высоких концентрациях и при длительном воздействии и Ang-2 может активировать Tie-2 [12]. Показано, что Tie-1 ингибирует апоптоз эндотелиальных клеток. На мышиной модели показано участие Tie-1 в выживании эндотелиальных клеток на стадии позднего эмбриогенеза [11, 17]. Экспрессия рецепторов Tie обнаружена как в плацентарных ворсинах, так и в децидуальной ткани [21]. Экспрессия РНК рецептора Tie-2 обнаружена в клетках, расположенных рядом с фетальными кровеносными сосудами в первом триместре беременности, к концу первого триместра беременности — в эндотелиальных клетках. В третьем триместре беременности экспрессия РНК Tie-2 также обнаружена в эндотелиальных клетках децидуальной ткани [19].

В настоящее время в литературе описана экспрессия ангиогенных факторов Ang-1, Ang-2 и их рецепторов в ткани плаценты. Вместе с тем нет данных о секреции этих факторов тканью плаценты и их роли в развитии патологии беременности, в частности гестоза. Поэтому целью исследования явилось сравнительное изучение секреции Ang-1 и Ang-2 тканью плаценты при физиологически протекающей беременности и при беременности, осложненной гестозом.

материалы и методы

Первую группу составили 15 беременных женщин на сроке 9-11 недель без признаков воспалительных изменений и инфекционных заболеваний. Вторую группу составили 27

беременных женщин на сроке 38-39 недель с физиологическим течением беременности. В третью группу вошли 28 беременных с гесто-зом различной степени тяжести на сроке 38-39 недель беременности без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования. Диагноз гестоза у женщин третьей группы установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности — наличие протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм рт. ст. и выше).

Полученные после оперативного аборта на сроке 9-11 недель или после кесарева сечения на сроке 38-39 недель кусочки плацентарной ткани культивировали в питательной среде DMEM\F12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США) в течение 24 часов. Затем кондиционированные среды собирали и замораживали при температуре -20 °С до исследования. Кусочки плацент взвешивали для пересчета концентрации ангиопоэтинов на 1мг ткани.

Концентрацию Ang-1 и Ang-2 в полученных после культивирования эксплантов плацент определяли при помощи стандартного набора для им-муноферментного анализа (R&D systems, США). Статистический анализ полученных данных проводили при помощи компьютерной программы STATISTICA 6.0. Для анализа данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и медианный тест, который часто используется исследователями для определения тенденции изменения признака.

Результаты исследования и обсуждение

Нами установлена достоверно более высокая секреция Ang-1 тканью плаценты на сроке 38-39 недель беременности по сравнению с ранним сроком беременности (рис. 1, табл. 1). Эти данные подтверждают сведения о возрастании роли Ang-1 в процессе ангиогенеза в плаценте во второй половине беременности. Поскольку на терминальных сроках беременности Ang-1 экспресси-руется клетками стромы ворсин, окружающими фетальные сосуды, полученные нами данные о повышенной секреции Ang-1 тканью плаценты подтверждают его значение для завершения формирования и стабилизации сосудистой сети ткани плаценты к концу физиологической беременности. Кроме того Ang-1 оказывает антиапоп-тогенный эффект на клетки эндотелия [4, 6, 10], и, вероятно, играет важную роль в поддержании жизнеспособности клеток сосудистой сети плаценты. Другими авторами на модели обезьян по-

Таблица 1

Продукция А^-1 и А^-2 тканью плаценты

Секреторные молекулы Группы Концентрация в 1 мл кондиционированной среды, пг/мл Концентрация в пересчете на 1 мг ткани, пг/мл

А^-1 9-11 недель (п = 15) 0,27 ± 0,27 0,003 ± 0,003

38-39 недель (п=27) 71,8 ± 12 *** 0,82 ± 0,15 ***

гестоз, 38-39 недель (п=28) 53,7 ± 12,6 0,59 ± 0,15

А^-2 9-11 недель (п = 15) 37789 ± 3268 476,5 ± 48,1

38-39 недель (п=27) 3188 ± 698 *** 39,8 ± 10,2 ***

гестоз, 38-39 недель (п=28) 1518±322 16,4 ± 3,7

Достоверность различий между группами обозначена следующим образом: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель», *** — р < 0,001

казано, что экспрессия мРНК А^-1 усиливается во второй половине беременности тканью синци-тиотрофобласта [13], но не получено данных об изменении экспрессии белка в ткани плаценты. Полученные нами данные указывают на то, что на поздних сроках физиологической беременности усиление секреции А^-1 происходит за счет его продукции клетками плаценты. Усиление секреции А^-1 на поздних сроках беременности может поддерживать жизнеспособность клеток трофобласта за счет антиапоптозного эффекта [4, 6].

Нами установлена достоверно сниженная секреция Ang-2 тканью плаценты на поздних сроках физиологической беременности по сравнению с ранним сроком беременности (табл. 1). Эти данные совпадают с данными литературы об экспрессии данного белка в ткани плаценты. Ang-2 на ранних сроках беременности участвует в ремоделировании спиральных артерий и установлении фето-плацентарного кровообращения. При ремоделировании спиральных артерий матки на ранних сроках беременности наблюдается повышение экспрессии Ang-2 и снижение уровня А^-1 [19]. При этом рецептор ^е-2 экспрессирован на клетках трофобласта, и определяет инвазивный фенотип трофобласта [19]. Обнаруженная нами повышенная секреция Ang-2 на ранних сроках беременности подтверждает его участие в контроле инвазии тро-фобласта в материнский эндометрий. По данным литературы, в ткани плаценты отмечена сильная экспрессия А^-2 и ^е-2 в первом триместре беременности, во втором и третьем экспрессия А^-2 не обнаружена, экспрессия ^е-2 снижается с течением беременности [13, 19]. Нами установлено, что секреция А^-2 клетками плаценты происходит на протяжении всей беременности, хотя она и снижалается к концу физиологической беременности. Следовательно роль Ang-2 не ограничивается участием в формировании

ткани плаценты на ранней стадии ее развития. На поздних сроках физиологической беременности А^-2, вероятно, не оказывает большого влияния на развитие сосудистой сети плаценты, однако может участвовать в поддержании жизнеспособности клеток плаценты.

Гестоз характеризуется сниженным уровнем перфузии ткани плаценты, нарушением инвазии трофобласта и ремоделирования спиральных артерий, гипоксией развивающегося плода и нарушением процессов ангио-генеза [15]. Сравнительных исследований секреции ангиопоэтинов тканью плаценты при физиологической беременности и при гестозе не проводилось. Роль Ang-1 в развитии гестоза в настоящее время недостаточно изучена. Нами установлено, что гестоз сопровождается сниженной секрецией Ang-1 тканью плаценты по сравнению с физиологической беременностью (рис. 1). Поскольку Ang-1 способствует стабилизации капилляров и завершению формирования сосудистого русла, то сниженная секреция этого фактора клетками плаценты при гестозе может быть одной из причин, способствующих нарушению формирования ткани плаценты и недоразвитости сосудистой сети плаценты. Функция Ang-1 может заключаться, главным образом, в поддержании жизнеспособности эн-дотелиальных клеток сосудов ткани плаценты, как это показано для некоторых онкогенных процессов [20]. В таком случае при гестозе снижение секреции Ang-1 может способствовать усилению апоптоза эндотелиальных клеток. Сниженный уровень секреции Ang-1 тканью плаценты может быть механизмом нарушения инвазии трофобласта за счет снижения миграционной активности клеток, а также может способствовать усиленному апоптозу клеток трофобласта, наблюдаемому при гестозе.

При физиологической беременности и при гестозе мы не наблюдали достоверно значимых

Рис. 1. Концентрация ангиопоэтина-1 в кондиционированных средах, полученных при культивировании экс-плантов плацент беременных с физиологическим течением беременности (38-39 недель) и беременных с гестозом на сроке 38-39 недель. График построен по результатам медианного теста

Рис. 2. Концентрация ангиопоэтина-2 в кондиционированных средах, полученных при культивировании экс-плантов плацент беременных с физиологическим течением беременности (38-39 недель) и беременных с гестозом на сроке 38-39 недель. График построен по результатам медианного теста

изменений в секреции Ang-2 тканью плаценты. Однако по результатам медианного теста была отмечена сниженная секреция Ang-2 тканью плаценты при гестозе по сравнению с физиологической беременностью (рис. 2, табл. 1). Это подтверждается данными, описанными в литературе, о снижении экспрессии мРНК Ang-2 в ткани плаценты при гестозе по сравнению с физиологической беременностью [18]. Эти данные доказывают снижение активности ангиогенных процессов в ткани плаценты при развитии ге-стоза и преждевременное переключение с разветвляющего на неразветвляющий ангиогенез, а также ослабление протективного действия ангиогенных факторов в отношении клеток эндотелия и трофобласта, которыми обладает А^-2 [3, 5]. Действие А^-2 неразрывно связано с эффектами VEGF. Эти факторы действуют совместно, участвуя в процессах ангиогенеза в ткани плаценты. Ранее нами было показано снижение экспрессии VEGF тканью плаценты [1], что также снижает проангиогенный потенциал А^-2. Ангиопоэтины оказывают действие через взаимодействие со специфическим рецептором ^е-2. Эффективность ангиогенных эффектов Ang-1 и Ang-2 определяется, в том числе, функциональной состоятельностью рецептора ^е-2. Поскольку Ang-2 поддерживает базовый

уровень фосфорилирования ^е-2 [3], то наблюдаемое при гестозе снижение уровня секреции Ang-2 может вести к снижению чувствительности сосудистого русла плаценты к действию Ang-1, играющего ведущую роль в формировании ткани плаценты в третьем триместре, вследствие снижения уровня фосфорилирова-ния ^е-2.

Физиологическое развитие сосудистой сети плаценты происходит под действием большого числа ангиогенных факторов. Немаловажную роль в процессах инвазии трофобласта и ан-гиогенеза играют ангиопоэтины. При этом их активность носит последовательный характер. Преобладание А^-2 в первом триместре беременности обеспечивает инвазию трофобласта, способствуя ремоделированию спиральных артерий матери, стимулирует ангиогенез в ткани плаценты. По мере развития беременности ангио-генез переключается с разветвляющего на нераз-ветвляющий. Поэтому роль А^-2 в формировании ткани плаценты снижается. Преобладающей становится секреция Д^-1, который стимулирует завершение формирования сосудистого русла ткани плаценты и при совместном действии с VEGF способствует поддержанию жизнеспособности клеток. Вероятно, роль А^-2 на поздних стадиях беременности сводится к поддержанию на базо-

ЖУРНАЛТ. АКУШРРГТНА и ЖПНПГИУТ, КПТГЪЧНРЙ

ТОМ LIX ВЫПУСК 6/2010

ISSN 1684—0461

вом уровне экспрессии рецептора ^-2 [3], посредством которого Ang-1 оказывает воздействие на эндотелиальные клетки. Установленная нами сниженная при гестозе секреция Ang-1 и Ang-2 может вызывать как нарушение ангиогенеза ткани плаценты, так и способствовать усилению апоптоза клеток плаценты.

Таким образом, отмеченная нами усиленная на терминальных сроках физиологической беременности секреция Ang-1 и сниженная секреция Ang-2 подтверждает их роль в развитии плаценты. Отмеченная нами сниженная продукция Ang-1 и Ang-2 при гестозе коррелирует со снижением экспрессии РНК этих факторов в ткани плаценты [18] и с нарушением формирования ткани плаценты при данной патологии, что указывает на участие данных факторов в развитии гестоза.

Литература

1. Экспрессия VEGF и его рецептора VEGF-R3 эндотели-альными клетками плаценты в норме и при гестозе / Соколов Д. И. [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2008. — Т. 145, № 3. — С. 321325.

2. Angiogenesis during primate placentation in health and desease / Wulff C. [et al.]. // Reproduction. — 2003. — Vol. 126. — P. 569-577.

3. Angiopoetin 2 is a partial agonist/antagonist of Tie2 signaling in the endothelium. / Hai Tao Yuan [et al.] // Molecular and cellular biology. — 2009. — Vol. 29, № 8. — P. 2011-2022.

4. Angiopoietin-1 activates both anti- and proapoptotic mitogen-activated protein kinases / Harfouche R. [et al.] // The FASEB Journal. — 2003. — Vol. 17, N 11. — P. 1523-1525.

5. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 activate trophoblast Tie-2 to promote growth and migration during placental development / Dunk C. [et al.] // Am. J. of Pathology. — 2000. — Vol. 156, N 6. — P. 2185-2199.

6. Angiopoetin-1 inhibits endothelial cells apoptosis via the AKT/ Survivin pathway / Papapetropoulos A. [et al]. // The J. of biological chemistry. — 2000. — Vol. 275, № 13. — P. 91029105.

7. Angiopoietin-1 is an antipermeability and anti-inflammatory agent in vitro and targets cell junctions / Gamble J. R. [et al]. // Circ. Res. — 2000. — Vol. 87. — P. 603-607

8. Angiopoietin-2 induces human glioma invasion through the activation of matrix metalloprotease-2 / Bo Hu [et al.] // PNAS. — 2003. — Vol. 100, N 15. — P. 8904-8909.

9. Brindle N. P. J., Saharinen P., Alitalo K. Signaling and functions of angiopoietin-1 in vascular protection // Circ. Res. — 2006. — Vol. 98. — P. 1014-1023.

10. Chemotactic properties of angiopoietin-1 and -2, ligands for the endothelial-specific receptor tyrosine kinase Tie2 / Witzen-bichler B. [et al.] // The J. of biological chemistry. — 1998. — Vol. 273, N 29. — P. 18514-18521.

11. Distinct roles of the receptors tyrosine kinases Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation / Sato T. [et al.] // Nature. — 1995. — Vol. 376. — P. 70-74.

12. Functional significance of Tie2 signaling in the adult vasculature / Peters K. J. [et al.] // Recent Prog. Horm. Res. — 2004. — Vol.59. — P. 51-71.

13. Hemochorial placentation in the primate: expression of vascular endothelial growth factor, angiopoietins, and their receptors throughout pregnancy / Wulff C. [et al.] // Biology Reproduction. — 2002. — Vol. 66. — P. 802-812.

14. Human placental vascular development: vasculogenic and angiogenic (branching and nonbranching) transformation is regulated by vascular endothelial growth factor-A, an-giopoietin-1, and angiopoietin-2 / Geva E. [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2002. — Vol. 87, N 9. — P. 42134224.

15. Intervillous blood flow in normal and complicated late pregnancy measured by means of an intravenous 133 Xe method / Kaar K. [et al.] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. — 1980. — Vol. 59. — P. 7-10.

16. In utero angiopoietin-2 gene delivery remodels placental blood vessel phenotype: a murine model for studying placen-tal angiogenesis / Geva E. [et al.] // Molecular Human Reproduction. — 2005. — Vol. 11, N 4. — P. 253-260.

17. The receptor tyrosine kinase TIE is reguired for integrity and survival of vascular endothelial cells / Puri M. [et al.] // EMBO J. — 1995. — Vol. 14. — P. 5884-5891.

18. The regulation and localization of Angiopoietin -1, -2 and their receptor Tie2 in normal and pathologic human placentae / Zhang E. G. [et al.] // Molecular medicine. — 2001. — Vol. 719. — P. 624-635.

19. Tie-2 and angiopoetin-2 expression at the fetal-maternal interface: a receptor ligand model for vascular remodeling / Goldman-Wohl D. S. [et al.] // Molecular human reproduction. — 2000. — Vol. 6, N 1. — P. 81-87.

20. Shim W. S. N, Ivy A. W. Ho, Philips E. H. Wong. Angiopoietin: A TIE balance in tumor angiogenesis // Mol. Cancer Res. — 2007. — Vol. 517. — P. 655-665.

21. VEGF, its receptors and the Tie receptors in recurrent miscarriage / Viorella P. [et al.] // Molecular Human Reproduction. — 2000. — Vol. 6, N 3. — P. 276-282.

Статья представлена О. Н. Аржановой, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта,

Санкт-Петербург

ANGIOPOIETINS PLACENTAL SECRETION IN NORMAL

PREGNANCIES AND THOSE COMPLICATED

BY PREECLAMPSIA

Stepanova O.I., Lesnichiya M. V., Lvova T. U., Sokolov D. I., Selkov S. A.

■ Summary: Angiopoietins (Ang) determine placental

vascular tree development. The goal was Ang-1 and Ang-2

placental secretion evaluation during normal pregnancy those complicated by preeclampsia. Normal pregnancy development is accompanied by Ang-1 placental secretion increase and Ang-2 placental secretion decrease. Altered placental vascular tree formation during preeclampsia is accompanied by decreased Ang-1 and Ang-2 placental cells secretion.

■ Key words: angiopoietin; angiogenesis; placenta; preeclampsia.

■ Адреса авторов для переписки-

Соколов Дмитрий Игоревич — с. н. с., д. б. н.

ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,

лаборатория иммунологии.