CC BY
67
СD4+ Т-клетки и их субпопуляции
как прогностический маркер
острого отторжения
при трансплантации почки
Резюме. Трансплантация почки является наиболее оптимальным методом почечно-заместительной терапии при терминальных заболеваниях почек. Однако ввиду генотипических различий между донором и реципиентом возможно развитие реакции отторжения и дисфункции трансплантата. Иммуномониторинг CD4+ Т-лимфоцитов и численности их субпопуляций является потенциальным маркером в прогнозировании и диагностике острого отторжения трансплантата.
Ключевые слова: CD4+ Тклетки, острое отторжение при трансплантации, почечно-заместительная терапия, иммунологические осложнения.
Трансплантация - наиболее оптимальный метод почечно-заместительной терапии у пациентов с хроническим терминальным поражением почек, позволяющим значительно улучшить продолжительность и качество жизни больных [1]. В 50% случаев послеоперационный период осложняется развитием ранней дисфункции трансплантата, что увеличивает длительность лечения. Одна из наиболее частых причин - острое отторжение (ОО) в виде воспалительной реакции и некроза, которое обусловлено реакцией иммунной системы реципиента на аллоантигены трансплантата [3]. Частота ОО в раннем посттрансплантационном периоде, несмотря на применяемую современную многокомпонентную иммуносупрессивную терапию (ИТ), достигает 15% [4].
По современным данным, основной клеткой развивающегося иммунного ответа на аллоан-тигены является зрелый наивный СБ4+ Т-лим-фоцит (Тп), который, взаимодействуя с другими иммунокомпетентными клетками, запускает каскад клеточных и гуморальных реакций, приводящих к отторжению трансплантата.
После распознавания аллоантигенов и представления их в составе молекулы гистосовме-стимости клеточной мембраны антиген-презен-тирующими клетками происходит активация Т-лимфоцитов, сопровождающаяся клеточной пролиферацией, поликлональной экспансией СБ4+ Т-клеток и появлением эффекторов ОО. В дальнейшем СБ4+ Т-клетки дифференцируются под влиянием цитокинов микроокружения по двум взаимоисключающим путям в субпопуляции Т-хелперов первого (^1) и второго типов (^2), обеспечивающих развитие иммунного ответа по пути клеточного или гуморального ОО соответственно [5].
Отличительная черта адаптивного иммунитета - формирование иммунологической памяти, в том числе и СБ4+ Т-клеток памяти, после первичной элиминации антигена [6], что является серьезным препятствием к установлению толерантности и достоверно снижает сроки функционирования трансплантата [7]. Формируется иммунологическая память несколькими путями. Первый из них - это сенсибилизация реципиента после предшествующих гемотрансфузий, беременностей и трансплантаций, второй -гомео-статическая пролиферация, обеспечивающая восстановление популяции иммунокомпетент-ных клеток после различных воздействий, приводящих к лейкопении. После прекращения
лимфодеплецирующего воздействия кроветворное микроокружение активирует восстановление популяции иммунокомпетентных клеток, причем преимущественно за счет аллореактив-ных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти [8].
Особенность последних заключается в том, что для их активации не требуется второго ко-стимулирующего сигнала. Внутри пула Т-клеток памяти выделяют две существенно отличающиеся субпопуляции. Центральные Т-клетки памяти (Тст) локализуются в периферических лимфатических узлах и слизистых оболочках, практически не синтезируют цитокинов и обладают высоким пролиферативным потенциалом, способностью к самовозобновлению, обеспечивая поддержание состояния иммунологической памяти. Эффекторные Т-клетки памяти (Тет) активно секретируют цитокины, обладают малой возможностью пролиферации, а также экспрес-сируют на своей поверхности хемокиновые рецепторы, посредством которых Тет мигрируют в ткани для выполнения своих эффекторных функций [9]. Основное фенотипическое отличие субпопуляций Т-клеток - экспрессия белковых продуктов гена СБ45. Внутри пула Т-клеток памяти дифференцировочными маркерами Тст и Тет являются рецепторы хоуминга: СБ62Ь (Ь-селектин) и ССБ.7. Соответственно, Тст в отличие от Тет экспрессируют оба рецептора [10]. Часть Тет, характеризующихся экспрессией СБ45ЯЛ при отсутствии экспрессии рецепторов хоуминга (СБ62Ь), определяют как терминально-дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти (Тетга). Эти клетки не пролиферируют и обладают наиболее выраженными эффектор-ными свойствами.
Таким образом, основной эффекторной популяцией клеток, обеспечивающей развитие ал-лоспецифического иммунного ответа при трансплантации органов, являются СБ4+ Т-лимфоциты. Их иммунологический мониторинг у реципиентов трансплантата органов в пред- и раннем посттрансплантационном периоде позволит определить наиболее значимые показатели, которые можно будет использовать в качестве прогностических и диагностических маркеров ОО.
Нами проведено проспективное когортное обсервационное сравнительное исследование, предметом которого стали реципиенты трансплантатов почки. Это 25 пациентов в возрасте от 18 до 60 лет, которым была впервые выполнена трансплантация почки от донора со смертью мозга в РНПЦ трансплантации органов и тканей в период с ноября 2015 по май 2016 г.
Оценка относительного и абсолютного количества субпопуляций CD4+ Т-клеток среди периферических мононуклеарных клеток проводилась у всех реципиентов до трансплантации, на 3-и, 6-е, 9-е сутки после трансплантации. На 7-е сутки после трансплантации пациентам выполнялась пункционная тонкоигольная биопсия трансплантата под ультразвуковым контролем с оценкой патологических изменений паренхимы трансплантата по системе Banff с поправками 2013 г. В зависимости от результатов патоморфологического исследования реципиенты были разделены на 2 группы. В первую входили больные с гистологически подтвержденным острым отторжением, вторую составили те, у кого гистологическая картина биоптата была без явлений иммунологической реакции. Пациенты исключались из исследования спустя 10 суток после операции или при начале лечения препаратом антитимоцитарного иммуноглобулина.
Все реципиенты в послеоперационном периоде получали поддерживающую трехкомпо-нентную иммуносупрессивную терапию, которая включала ингибиторы кальциневри-на (ИКН), препараты микофеноловой кислоты, глюкокортикостероиды.
Иммунофенотип клеток периферической крови определяли методом 8-цветной проточной цитофлуориметрии на проточном цито-флуориметре FACSCanto II, оснащенном тремя лазерами (488 нм, 633 нм, 405 нм). Данные анализировали с использованием программы «FACSDiva».
Периферическую кровь (100 мкл) инкубировали с соответствующими моноклональными антителами в объеме согласно прописи фирмы-производителя 15 мин при 4 °С. Затем эритроциты лизировали раствором хлорида аммония 10 мин при 4 °С. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин, 1500 об/мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS.
Значения показателей в данной статье представлены преимущественно в виде Ме (25-75), где Ме - Медиана, а 25-75 - интерквартильный размах между 25-й и 75-й процентилями. Для сравнения двух выборок применяли непараметрический U-критерий Манна - Уитни. Результаты считали статистически значимыми при уровне значимости а>0,05 и соответственно р<0,05 (вероятность ошибки I рода 5%). Результаты сравнения представлены в виде Ме (25-75) vs Ме (25-75), где на первом месте результаты, полученные в группе с гистологически подтвержденным отторжением, на втором - без него.
Из 25 реципиентов трансплантата почки было 14 мужчин (56%), 11 женщин (44%). Средний возраст составил 47,7±10,7 года. Патологией, приведшей к хронической почечной недостаточности, в основном являлся хронический гломе-рулонефрит - 15 (60%) пациентов. В составе поддерживающей трехкомпонентной иммуносу-прессивной терапии 20 (80%) реципиентов получали циклоспорин, такролимус применялся у 5 больных (20%).
По результатам патоморфологического исследования биоптатов почки гистологическая картина ОО установлена в 11 (44%) случаях. У 5 (20%) пациентов клеточно-опосредован-ная реакция отторжения сопровождалась гуморальным компонентом. У 9 (36%) регистрировались признаки токсичности ИКН, ишемиче-ски-реперфузионное повреждение почки - у 10 (40%) больных. В 12 (48%) случаях отмечалась патология донора (признаки нефросклероза трансплантата).
Иммунофенотипический анализ субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови реципиентов почки проводился до трансплантации и в раннем посттрансплантационном периоде. До пересадки при сопоставимом уровне лейкоцитов в группах с отторжением и без отторжения отмечалось повышение относительного количества мононуклеаров периферической крови в группе с ОО (19,2 (18,6-24,8) ув 11,5 (5,5-24,5)%, р=0,05), которое сопровождалось повышением абсолютного числа СБ3+СБ4+ Т-кле-ток в группе с ОО (0,795 (0,671-0,838) ув 0,325 (0,193-0,61) х103/мкл, р=0,025). Также в группе с ОО в те же сроки наблюдения определялись достоверно более высокие показатели абсолютного числа наивных СБ4+ Т-лимфоцитов и центральных Т-клеток памяти: 0,3 (0,171-0,315) ув 0,083 (0,066-0,17) х103/мкл и 0,388 (0,328-0,466) ув 0,17 (0,068-0,265) х103/мкл (р=0,05) соответственно. Соотношение абсолютного и относительного числа других субпопуляций СБ3+СБ4+ Т-лим-фоцитов у реципиентов в группах до трансплантации статистически не различалось (рисунок).
В послеоперационном периоде в группе пациентов с гистологически подтвержденным отторжением на 3-и сутки после трансплантации оставалось повышенным абсолютное число центральных Т-клеток памяти (0,24 (0,233-0,267) ув 0,165 (0,116-0,191) х 103/мкл, р=0,05). Кроме того, у этих пациентов к 6-м суткам регистрировался статистически значимый более высокий уровень соотношения СБ4+ Т-клеток и СБ8+ Т-клеток (2,5 (1,92-2,9) ув 0,87 (0,77-1,35), р=0,02).
Полученные результаты свидетельствуют, что у пациентов с ОО исходно (до трансплантации) наблюдалось повышение абсолютного числа СБ4+ Т-клеток за счет субпопуляции наивных СБ3+СБ4+ Т-клеток и центральных хелпер-ных Т-клеток памяти. Первые составляют основу пула потенциальных эффекторов и ^2, обеспечивающих развитие иммунной реакции с последующим острым отторжением.
Вторым важным звеном пула Т-хелперов являются центральные СБ3+ СБ4+ Т-клетки памяти. В проведенном исследовании исходно достоверно более высокий уровень клеток этой субпопуляции Т-хелперов у пациентов с развившимся в послеоперационном периоде гистологически подтвержденным острым отторжением свидетельствует о том, что эти пациенты были ранее сенсибилизированы и вследствие этого обладали высокой иммунореактивностью к алло-антигенам трансплантата, что в итоге, несмотря на проводимую стандартную иммуносупрессив-ную терапию, привело к развитию иммунологической реакции.
Уровень наивных Т-хелперов до трансплантации
0,50 0,45 0,40 0,35 I 0,30
го о
- 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05
р =0,05
B
Без отторжения С отторжением
Уровень CD4+ центральных Т-клеток памяти на 3-и сутки после трансплантации
0,40
0,35
0,30
* 0,25 5
О 0,20 0,15 0,10 0,05
р=0,033
р
Без отторжения
С отторжением
Рисунок. Анализ СО3+СО4+ Т-клеток и их субпопуляций до и после трансплантации: А - высокий уровень СО3+СО4+ Т-хелперов в группе с отторжением до трансплантации; В - значительно большее количество наивных Т-лимфоцитов в группе с отторжением; С - высокий предтрансплантационный уровень центральных Т-клеток памяти; О - высокий уровень центральных Т-клеток памяти у реципиентов с развившимся отторжением
Таким образом, исходно высокий уровень показателя абсолютного числа СБ4+ Т-клеток за счет субпопуляций наивных СБ3+ СБ4+ Т-клеток и центральных хелперных Т-клеток памяти в периферической крови реципиента является прогностическим маркером риска развития иммунологических осложнений при трансплантации почки. Тем не менее подтверждение информативности иммунологического мониторинга с определением указанных субпопуляций иммунокомпетентных клеток для прогнозирования, диагностики и контроля лечения острого отторжения при трансплантации почки требует дальнейшего изучения. ЕЗ
Статья поступила в редакцию 01.06.2016 г.
С.В. Коротков1, А.В. Носик2, В.В. Смольникова1, В.Ю. Гриневич1, Д.Ю. Ефимов1, А.А. Сыантович3, М.В. Дмитриева3, А.М. Федорук1, 2, А.Е. Щерба1, О.В. Калачик1, 2, С.И. Кривенко1, О.О. Руммо1
1РНПЦ трансплантации органов и тканей на базе 9-й городской клинической больницы, Минск белорусская медицинская академия последипломного образования, кафедра трансплантологии
3Городское клиническое патолого-анатомическое бюро, Минск
Summary
Kidney transplantation is the most suitable method of treatment of patients with and stage kidney disease. However, considering genotypic distinctions between the donor and the recipient can lead to rejection and dysfunction of a transplant. Immunomonitoring of CD4+ T-lymphocytes and their subpopulation number is a potential signature in prediction and diagnostic of acute transplant rejection.
ff See: http://mnosfera.by/2016/08/Mymphocytes
Литература
1. Sola E. et al. Long-Term Improvement of Deceased Donor Renal Allograft Survival Since 1996: A Single Transplant Center Study // Transplantation. 2010. Vol. 89, N6. С. 714-720.
2. Zhang R. Clinical Management of Kidney Allograft Dysfunction // Open J. Organ Transpl. Surg. 2014. Vol. 4. P. 7-14.
3. Chaumont M. et al. Delayed Graft Function in Kidney Transplants: Time Evolution, Role of Acute Rejection, Risk Factors, and Impact on Patient and Graft Outcome // J. Transplant. 2015. Vol. 2015, N5. P. 1-9.
4. Ganji M. R., Broumand B. Acute cellular rejection // Iran J. Kidney Dis.2007. Vol. 1, N2. P. 54-56.
5. Wood K. J., Goto R. Mechanisms of Rejection: Current Perspectives // Transplantation. 2012. Vol. 93, N1. P. 1-10.
6. Su C. A., Fairchild R. L. Memory T-Cells in Transplantation // Curr. Transplant. Reports. 2014. Vol. 1, N3. P. 137-146.
7. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central Memory and Effector Memory T— Cell Subsets: Function, Generation, and Maintenance // Ann. Rev. Immunol. 2004. Vol. 22, N1. P. 745-763.
8. Bingaman A. W., Farber D. L. Memory T cells in transplantation: Generation, Function, and Potential Role in Rejection // Am. J. Transplant. 2004. Vol. 4, N6. P. 846-852.
9. Mueller S. N. et al. Memory T—Cell Subsets, Migration Patterns, and Tissue Residence // Ann. Rev. Immunol. 2013. Vol. 31, N1. P. 137-161.
10. Chang J. T., Wherry E. J., Goldrath A. W. Molecular regulation of effector and memory T—Cell differentiation // Nat. Immunol. 2015. Т. 15, N12. P. 1104-1115.
Риск ранней дисфункции трансплантата печени
ассоциирован с полиморфизмом гена TLR-4
Резюме. Цель исследования - оценка ассоциации генотипов клинически значимых последовательностей нуклеотидов п11536865, №13930 и г$5030717 гена ПР:-4 с риском возникновения и выраженностью ранней дисфункции трансплантатов печени. Ранняя дисфункция трансплантата имеет генетические предпосылки, обусловленные полиморфизмом гена Т1Н-4, которые реализуются через активацию ИМСВ1, клеток Купфера и И-23.
Ключевые слова: ранняя дисфункция трансплантатов печени, генетические предпосылки, ассоциации генотипов последовательностей нуклеотидов, полиморфизм гена Т1Н-4.
Использование доноров как со стандартными, так и с расширенными критериями сопряжено с развитием ранней дисфункции трансплантата (РДТ)печени, в основе которого лежит ишемически-реперфузионное повреждение (ИРП) [1]. При этом не существует надежного объективного метода оценки донорского печеночного трансплантата, по которому можно было бы судить о риске возникновения дисфункции органа, других осложнений и летальности.
Известен ряд фенотипиче-ских и технических факторов риска дисфункции трансплантата со стороны донора (возраст, уровень натрие-мии, степень жирового гепато-за, гипотензия, продолжительный период холодовой и тепловой ишемии, длительность искусственной вентиляции легких (ИВЛ) более 7 суток, небьющееся сердце и расщепленный или редуцированный трансплантат) и реципиента (MELD и ургентность трансплантации) [2, 3]. Однако из клинического наблюдения известно, что РДТ имеет широкую вариабельность степени выраженности и различный прогноз при прочих равных
3I
