CC BY
22
DOI: 10.23868/201912034
сан-опосредованная антиметастатическая Активность модифицированных nk-клеток линии YT
О.А. Коваль1, 2, В.Г. Субракова2, 3, A.A. Нуштаева1, Т.Н. Беловежец3, О.А. Троицкая1,
М.С. Ермаков1, 2, М.Е. Варламов1, 2, А.Н. Чикаев3, Е.В. Кулигина1, С.В. Кулемзин3, А.А. Горчаков2, 3,
А.В. Таранин2, 3, В.А. Рихтер1
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
3 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия
CAR-DEPENDENT ANTi-METASTATiC ACTiViTY OF MODiFiED ПК CELL LINE YT
O.A. Koval1, 2, V.G. Subrakova2, 3, A.A. Nushtaeva1, T.N. Belovezhets3, O.A. Troitskaya1, M.S. Ermakov1, 2, M.E. Varlamov1, 2, A.N. Chikaev3, E.V. Kuligina1, S.V. Kulemzin3, A.A. Gorchakov2, 3, A.V. Taranin2, 3, V.A. Richter1
11nstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia
2 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3 Institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS, Novosibirsk, Russia
e-mail: o_koval@ngs.ru
Адоптивный перенос T- и NK-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR), рассматривают как перспективную стратегию борьбы с онкологическими заболеваниями. Химерные антигенные рецепторы представляют собой искусственные молекулы, которые обеспечивают активацию несущих их клеток при контакте с определенным антигеном для реализации функции киллинга. В отличие от Т-клеток, NK-клетки не экспрессируют Т-клеточные рецепторы, что позволяет использовать их в аллогенном формате, не опасаясь реакции «трансплантат против хозяина». Целью данной работы было исследование антиметастатической активности дважды модифицированной человеческой NK-клеточной линии YT — клеток Cyto-CAR-YT-Lact, несущих CAR к белку PSMA и экспрессирующих проапоптотический белок лактаптин.
Методом лентивирусной трансдукции была получена линия карциномы молочной железы BrCCh4e-134 с высокой экспрессией PSMA. В качестве эффекторных клеток была использована дважды модифицированная NK-клеточная линия человека YT — Cyto-CAR-YT-Lact, экспрессирующая функциональный CAR против PSMA и несущая делецию гена Shp-2, кодирующего белок Shp-2 — негативный регулятор активации NK-клеток. Цитотоксическую активность Cyto-CAR-YT-Lact-клеток in vitro оценивали на клеточной линии BrCCh4e-134 с гиперэкспрессией PSMA и на PSMA-негативной родительской клеточной линии BrCCh4e в режиме реального времени. Анализ антиметастатической активности Cyto-CAR-YT-Lact-клеток проводили на модели спонтанно метастазирующей и внутривенно трансплантированной PSMA-позитивной опухоли BrCCh4e-134 на мышах SCID и NOD/SCID.
Клетки дважды модифицированной линии Cyto-CAR-YT-Lact эффективно уничтожали PSMA-позитивные опухолевые клетки-мишени и с меньшей эффективностью PSMA-негативные клетки-мишени в экспериментах in vitro. В качестве опухолевой модели в работе использовали клетки рака молочной железы человека, гиперэкспрессирующие молекулы-мишени PSMA и характеризующиеся метастазированием в лимфоузлы средостения при трансплантации мышам. Было показано, что однократное внутривенное введение препарата клеток Cyto-CAR-YT-Lact супрессировало развитие метастазов на модели спонтанного метастазирования и при введении опухолевых клеток в кровоток. Ответ первичного опухолевого узла на терапию Cyto-CAR-YT-Lact-клетками не был обнаружен. Таким образом, применение модифицированных NK-клеток можно рассматривать в качестве многообещающего терапевтического подхода для подавления метастазирования, но не для супрессии роста первичного опухолевого узла.
Ключевые слова: CAR-NK клетки, химерный антигенный рецептор, лактаптин, PSMA.
Введение
Адоптивный перенос T- и NK-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR),
Adoptive T- and NK-cells transfer with chimeric antigenic receptors (CAR) is considered as a promising anticancer strategy. Chimeric antigenic receptors are artificial molecules that provide activation of the cells carrying them when they contact with a specific antigen to induce cell death. Unlike T cells, NK cells have no T-cell receptors, which prevent "graft-versus-host" disease under allograft transplantation. The aim of this work was to study antimetastatic activity of a double-modified human NK cell line YT — Cyto-CAR-YT-Lact cells carrying CAR to the PSMA protein and expressing antiapoptotic protein lactaptin.
The BrCCh4e-134 breast carcinoma line with high PSMA expression was constructed by lentiviral transduction. The YT double modified NK cell line, Cyto-CAR-YT-Lact, expressing functional anti-PSMA CAR and carrying a deletion of the Shp-2 gene encoding the Shp-2 protein, a negative regulator of NK cell activation, was used as effector cells. The cytotoxic activity of Cyto-CAR-YT-Lact cells was tested on PSMA-positive BrCCh4e-134 cells and on parental BrCCh4e cell in vitro in real-time mode. The antimetastasis activity of Cyto-CAR-YT-Lact cells was analyzed in SCID and NOD/SCID mice with spontaneously metastases and intravenously transplanted PSMA-positive BrCCh4e-134 cells.
Cyto-CAR-YT-Lact cells efficiently reduced the viability of PSMA-positive tumor cells and moderately PSMA-negative target cells in vitro. As a tumor model, we used human breast cancer cells that overexpress PSMA as a transgene and are characterized by metastasis to the mediastinal lymph nodes being transplanted on mice. It was shown that a single intravenous administration of the Cyto-CAR-YT-Lact cells suppressed the development of metastases in the spontaneous metastasis model and when tumor cells were introduced into the bloodstream. The reaction of the primary tumor node to Cyto-CAR-YT-Lact therapy was not detected. Thus, the use of modified NK cells can be considered as a promising therapeutic approach for suppressing metastasis, but not for suppressing the growth of the primary tumor node.
Keywords: CAR-NK cells, chimeric antigene receptor, lac-taptin, PSMA.
рассматривают как перспективную стратегию борьбы с онкологическими заболеваниями. CAR — это искусственные молекулы, которые обеспечивают активацию
несущих их клеток при контакте с определенным антигеном [1]. CAR-NK-клетки имеют два существенных преимущества по сравнению с CAR-T-клетками: большую безопасность при применении в клинике и способность к CAR-независимому лизису мишеней за счет сигналов от собственных активирующих рецепторов. В отличие от Т-клеток, NK-клетки не экспрессируют Т-клеточные рецепторы, что позволяет использовать их в аллогенном формате, не опасаясь реакции «трансплантат против хозяина» [2]. В то же время, NK-клетки обладают слабой способностью инфильтрировать солидные опухоли, что ведет к их низкой эффективности при терапии таких опухолей, но играют ведущую роль в контроле метастазирования [3], поэтому создание модифицированных NK-клеток имеет большое значение, в первую очередь, для агрессивных метастатических форм раковых заболеваний.
Наиболее привлекательными мишенями солидных опухолей являются CD133, EGFR, HER2, CEA, мезотелин и простат-специфические мембранные антигены (PSMA антигены) [4]. PSMA — молекула, характерная для большинства видов рака простаты, а уровень экспрессии PSMA коррелирует со степенью тяжести заболевания, в том числе с метастатическими формами [5]. Несколько стратегий модификаций CAR-T-клеток для борьбы с метастатическими формами рака простаты уже было опробовано, однако, без существенных успехов [6], поэтому более предпочтительным представляется использование именно NK-клеточной линии с CAR для терапии метастатического PSMA-позитивного рака простаты.
Клетки Cyto-CAR-YT-Lact представляют собой генно-инженерно модифицированные «усиленные» NK-клетки линии YT, экспрессирующие, помимо CAR, проапоптотический белок лактаптин (Lact), для усиления неспецифической цитотоксической активности и несущие нокаут гена Shp-2 для ослабления ингибирующего сигналинга [7, 8]. Ранее было показано, что клетки Cyto-CAR-YT обладают повышенной CAR-опосредованной цитотоксичностью в отношении клеток аденокарциномы простаты линии Du-145-PSMA по сравнению с CAR-YT-клетками (без нокаута гена Shp-2), что подтверждает важность супрессии ингибирующего сигналинга для терапии NK-резистентных опухолей человека [9].
Целью данной работы было исследование антиметастатической активности дважды модифицированной человеческой NK-клеточной линии YT — клеток Cyto-CAR-YT-Lact, несущих CAR к белку PSMA и экс-прессирующих проапоптотический белок лактаптин. Цитотоксический, противоопухолевый и антиметастатический потенциал клеток Cyto-CAR-YT-Lact в отношении PSMA-положительных опухолей был оценен впервые.
Материал и методы
Клеточные линии и их культивирование
Клеточная линия HEK293T (эмбриональные эпителиальные клетки почки человека) была получена из Американской коллекции клеточных культур (ATCC). Клеточная линия YT (NK-клеточная лимфобласт-ная лейкемия) была любезно предоставлена проф. А.В. Филатовым. Клеточная линия BrCCh4e (карцинома молочной железы человека) была получена в ИХБФМ СО РАН и депонирована в РККК ИНЦ РАН (№ 799D).
Клетки YT, BrCCh4e и HEK293T культивировали в среде IMDM (Gibco, США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят (FBS) (Sigma Aldrich, США), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), в Ш2-инкубаторе при стандартных условиях (5% CO2, 37°С].
Животные
В работе использовали самок мышей в возрасте 8-10 недель линий SCID (SHO-PRKDC SCID HR/HR1EW 43375, n=8) и NOD/SCID (NOD.SCID CB17Prkdcscid/ NcrCrl, n=16) разведения SPF-вивария ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, Россия). Животные содержались в индивидуально вентилируемых клетках (Animal Care Systems, США), в условиях искусственного освещения (14/10 ч. световая/темновая фаза), имели свободный доступ к пище (Ssniff, Германия) и воде. Эксперименты на мышах проводили согласно рекомендациям по использованию лабораторных животных (ECC Directive 86/609/EEC).
Лентивирусная трансдукция для
создания рекомбинантных линий
Для интеграции кДНК кассет, кодирующих лактаптин или PSMA, клетки CYTO-CAR-YT и BrCCh4e были обработаны соответствующими лентивирусными частицами. Сборку вирусных частиц, псевдотипи-рованных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), проводили в клетках линии HEK293T, используя стандартный протокол кальций-фосфатной трансфекции [10]. В качестве векторных плазмид применяли плазмиду pEL2 (кодирующую лактаптин) [8] и плазмиду pCDH-PSMA (кодирующую полноразмерный белок PSMA) с помощью вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2 (Addgene, США). Трансдукцию осуществляли методом спинокуля-ции [11] с различными значениями MOI в присутствии 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Через 48 ч. после трансдукции клетки сортировали на клеточном сортере SONY SH800 (SONY, Япония), либо селектировали на антибиотике зеоцин (Thermo Fiesher, США) с концентрацией 400 мкг/мл.
Проточная цитометрия
Для верификации трансдукции и оценки гомогенности клеточных линий проводили проточную цитоме-трию на приборе BD FACSCantoII (BD, США). Клетки BrCCh4e-134 с гиперэкспрессией PSMA окрашивали антителами к PSMA (Thermo Fisher, США), конъюги-рованными с фикоэритрином (PE), клетки CYTO-CAR-YT-Lact анализировали, используя репортерный ген copGFP, интегрированный в бицистронную кассету, кодирующую лактаптин. Трансдуцированные клетки клонировали на сортере Sony SH800 (Sony, Япония) в ЦКП «Молекулярная и клеточная биология» ИМКБ СО РАН.
Анализ цитотоксической активности клеток
Cyto-CAR-YT-Lact в режиме реального времени
Цитотоксическую активность клеток Cyto-CAR-YT-Lact анализировали на приборе iCELLigence RtCA (ACEA Bioscience), сравнивая с NK-клеточной линией YT дикого типа. Клетки BrCCH4e и BrCCh4e-134 в количестве 3х104 высевали в 500 мкл полной питательной среды IMDM в лунки 8-луночных планшетов (ACEA Bioscience, Корея) с интегрированными микроэлектронными сенсорами, позволяющими регистрировать изменение сопротивления электрического тока. Величина сопротивления зависит от размера и количества прикрепленных клеток и позволяет рассчитать относительное число жизнеспособных клеток (клеточный индекс, CI). Через 24 ч. среду заменяли на свежую, содержащую 1 х105 клеток-эффекторов — модифицированные клетки Cyto-CAR-YT-Lact или NK-клетки линии YT дикого типа, и инкубировали не менее 48 ч. К контрольным образцам добавляли свежую среду IMDM без клеток-эффекторов Пробы для всех вариантов культивирования ставили в триплетах.
68
оригинальные исследования
Рис. 1. Монопараметрические гистограммы: А — экспрессия репортера copGFP в клетках CYTO-CAR-YT-Lact, подтверждающая продукцию лактаптина, так как эти два белка кодируются одной бицистронной кассетой; Б — модифицированная клеточная линия BRCCh4e-134 с гиперэкспрессией PSMA и PSMA-негативная родительская клеточная линия BRCCh4e, реакция с моноклональными антителами к PSMA, конъюгированными с PE. Проточная цитофлуориметрия
Анализ антиметастатической активности
Cyto-CAR-YT-Lact клеток
Самкам мышей SCID (n=8) в хвостовую латеральную вену вводили 300 мкл суспензии клеток BrCCH4e-134 в физиологическом растворе в концентрации 2х104 кл/ мл. Мышей с трансплантированными внутривенно опухолевыми клетками сразу делили на 2 группы: контрольную (n=4) и экспериментальную (n=4). Через 24 сут. животным экспериментальной группы внутривенно вводили 500 мкл суспензии эффекторных клеток (6х106 кл/мл) в физиологическом растворе, животным контрольной группы — 500 мкл физиологического раствора.
Самкам мышей NOD/SCID (n=16) подкожно вводили 100 мкл суспензии клеток BrCCH4e-134 (4х107 кл/мл) в смеси PBS: Matrigel™ (BD Bioscience; 2:1). размеры опухолей дважды в неделю измеряли штангенциркулем и по достижении, в среднем, размера 0,03 см3 животных рандомизированно разделяли на 2 группы: животным экспериментальной группы (n=8) вводили внутривенно 500 мкл суспензии эффекторных клеток (6х106 кл/мл) в физиологическом растворе, животным контрольной группы (n=8) — 500 мкл физиологического раствора.
По окончании экспериментов (через 14 сут. после введения клеток-эффекторов) животных подвергали эвтаназии, проводили полный патоморфологический осмотр внутренних органов, выявленные метастатические узлы измеряли, извлекали и фиксировали для последующего гистологического анализа.
Статистический анализ
В экспериментах in vitro сравнение между двумя группами проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). В экспериментах на животных сравнение между группами осуществляли с помощью U-теста Манна-Уитни. При значении р<0,05 различия считали статистически значимыми.
Результаты
Создание NK-клеточной линии Cyto-CAR-YT-Lact
Нами было показано, что интеграция генетической кассеты, кодирующей лактаптин, приводит к увеличению
цитотоксической активности NK-клеток, поэтому было решено дополнительно модифицировать полученные нами ранее Cyto-CAR-YT-клетки, цитотоксическая активность которых повышена за счет нокаута белка-негативного регулятора активации NK-клеток Shp-2 [9], трансдуцировав их лентивирусными частицами, кодирующими лактаптин. После трансдукции и сортировки была получена линия CYTO-CAR-YT-Lact, гомогенная по экспрессии лактаптина (рис. 1A).
Получение клеточной линии
с гиперэкспрессией белка PSMA
Чтобы оценить эффективность антиметастатического потенциала модифицированных CAR-NK-клеток необходимо иметь релевантную модель опухоли, несущей необходимый антиген и обладающей метастатическим потенциалом. Для конструирования клеточной линии, гиперэкспрессирующей белок PSMA, была выбрана линия BrCCh4e, т. к. ранее в ИХБФМ СО рАН была получена опухолевая линия клеток молочной железы человека BrCCh4e, характеризующаяся стабильным метастазированием в лимфоузлы средостения [12]. Клетки BrCCh4e были трансдуцированы вектором pCDH-PSMA [13], после чего поверхностная экспрессия трансгена была подтверждена методом проточной цито-метрии с применением моноклональных антител к PSMA (рис. 1 б). После селекции на антибиотике зеоцин была отобрана популяция клеток BrCCh4e-134, гиперэкспрес-сирующих PSMA, которые сохраняли экспрессию PSMA в течение не менее 10 пассажей.
Анализ цитотоксической активности клеток Cyto-
CAR-YT-Lact в режиме реального времени (RTCA)
Цитотоксическую активность Cyto-CAR-YT-Lact-клеток in vitro оценивали на клеточной линии BrCCh4e-134 с гиперэкспрессией PSMA и на PSMA-негативной родительской клеточной линии BrCCh4e.
Анализ цитотоксической активности в режиме реального времени показал, что Cyto-CAR-YT-Lact-клетки высокоэффективно (практически на 100%) индуцируют гибель клеток-мишеней линии
Рис. 2. Влияние СуШ-САП-УТ-_ас^клеток на жизнеспособность и пролиферацию опухолевых клеток-мишеней. Типичные кривые роста клеток рака молочной железы человека в режиме реального времени: А — клеточная линия ВпССИ4е; Б — клеточная линия ВпССИ4е-134; через 24 ч. культивирования добавлены СуШ-САП-УТ-_ас^клетки (СуШ-САП, стрелка); контроль — ЫК-клетки линии УТ дикого типа; С1 — индекс пролиферации клеток (относительные единицы), данные представлены как среднее значение трех независимых повторов ±80
Таблица. Эффективность терапии СуШ-САП-УТ-_ас^клетками в отношении спонтанных и смоделированных метастазов
Группы
Тип трансплантации опухолевых клеток
Число животных в группе
Число животных с метастазами
Контроль CAR-NK терапия Контроль CAR-NK терапия
в/в в/в п/к п/к
4 4 8 8
4 0 4 0
BrCCh4e-134 и менее эффективно — гибель клеток линии BrCCh4e без PSMA-антигена (рис. 2). Клетки линии BrCCh4e-134 были резистентны к NK-клеткам линии YT дикого типа (рис. 2Б). Таким образом, опухолевые клетки BrCCh4e-134 являются чувствительной моделью для исследования антиметастатической активности клеток Cyto-CAR-YT-Lact in vivo.
Анализ антиметастатической активности
клеток Cyto-CAR-YT-Lact
Стандартное моделирование метастазирования воспроизводят двумя методами — трансплантацией опухолевых клеток в венозный кровоток или в режиме спонтанного метастазирования солидных опухолей, сформированных трансплантированными опухолевыми клетками. Модель спонтанного метастазирования позволяет также оценивать и противоопухолевое действие исследуемого препарата. В данной работе для оценки антиметастатической активности клеток Cyto-CAR-YT-Lact использовали обе модели метастазирования на примере опухоли BrCCh4e-134.
Клетки линии BrCCh4e-134 трансплантировали мышам SCID внутривенно, формировали рандомизированные группы и через 24 сут. вводили внутривенно 3х106 клеток Cyto-CAR-YT-Lact животным экспериментальной группы и физиологический раствор животным контрольной группы. При вскрытии через 14 сут. после введения Cyto-CAR-YT-Lact-клеток было выявлено, что у 100% животных контрольной группы присутствовали метастазы, преимущественно в лимфоузлах средостения, а также в печени и почках. В группе животных,
получавших препарат клеток Cyto-CAR-YT-Lact, метастазов обнаружено не было (табл.).
Для моделирования спонтанного метастазирования 4х106 клеток BrCCh4e-134 подкожно трансплантировали мышам Nod/SCID. Через 24 сут. после трансплантации опухолевых клеток средний размер опухолей составлял 0,03 см3 и позволял сформировать экспериментальную и контрольную группы. Животным экспериментальной группы внутривенно вводили 3х106 клеток Cyto-CAR-YT-Lact, животным контрольной группы — физиологический раствор. При вскрытии животных через 14 сут. после введения модифицированных CAR-NK-клеток было выявлено, что терапия Cyto-CAR-YT-Lact-клетками не останавливала рост первичного опухолевого узла (рис. 3), но блокировала образование метастазов (табл.).
У животных экспериментальной группы, получавших терапию Cyto-CAR-YT-Lact-клетками, метастазы обнаружены не были; у 4 из 8 животных контрольной группы были обнаружены крупные метастазы в лимфоузлах средостения и небольшие очаги в печени (табл.).
Таким образом, введение клеток Cyto-CAR-YT-Lact оказывало стойкий антиметастатический эффект как на модели внутривенной трансплантации опухолевых клеток, так и на модели спонтанного метастазирования.
Обсуждение
Противоопухолевая иммунотерапия, основанная на адоптивном переносе Т-клеток, экспрессирующих специфические CAR, вошла в клиническую практику после одобрения североамериканским агентством FDA
Рис. 3. Динамика роста первичной опухоли ВгССН4е-134. Стрелкой обозначен день введения клеток-эффекторов. Различие между экспериментальной и контрольной группами р>0,05
в 2017 г. двух CAR T-клеточных продуктов — Kymriah и Yescarta [14].
Используемые в работе модифицированные NK-клетки Cyto-CAR-YT-Lact имели функциональный CAR к белку PSMA человека, поэтому для реализации их таргетного цитотоксического потенциала необходимо присутствие PSMA на поверхности клетки-мишени. Среди доступных клеточных линий аденокарциномы простаты человека с экспрессией PSMA, в настоящее время есть только клеточные модели с высоким метастатическим потенциалом и локализацией метастазов в костях. При разработке опухолевой модели учитывались следующие условия: 1) опухолевые клетки не должны отторгаться при трансплантации; 2) опухолевые клетки должны эффективно формировать метастазы при внутривенном введении; 3) опухолевые клетки должны экспресси-ровать антиген к используемому CAR. Особенности иммунной системы трансгенных мышей с различными иммунодефицитами (линии SCID и NOD/SCID) позволяют осуществлять трансплантацию опухолевых клеток человека на этих животных. В то же время, следует отметить, что наиболее подходящими для исследования активности экзогенных NK-клеток считаются мыши с еще более тяжелой формой иммунодефицита — мыши NSG, у которых по сравнению с мышами линии NOD/ SCID дополнительно подавлена функция NK-клеток вследствие генетически-обусловленного блокирования сигналов цитокиновых рецепторов [15]. Тем не менее, описаны успешные эксперименты на мышах линий SCID и NOD/SCID для оценки эффективности CAR-клеточной терапии, что и позволило в данной работе использовать мышей этих линий в качестве животных-опухоленосите-лей [16, 17]. Наиболее характерным сайтом метастази-рования аденокарциномы простаты (более 90% случаев) являются кости, и такая особенность сохраняется для перевиваемых клеточных линий рака простаты, в том числе линий PC-3, VCaP, DU145 и LNCaP, что создает трудности при анализе антиметастатического потенциала препаратов у животных-опухоленосителей [18, 19]. В качестве опухолевой модели была выбрана клеточная линия рака молочной железы BrCCh4e, метастазиру-ющая преимущественно в лимфоузлы средостения, в том числе при внутривенном введении клеток [1 2]. Трансдукция клеток BrCCh4e лентивирусным вектором, кодирующим PSMA человека, позволила получить клеточную линию BrCCh4e-134, метастазирующую в лимфоузлы средостения при трансплантации мышам линий SCID и NOD/SCID и экспрессирующую белок PSMA, что соответствовало всем условиям, сформулированным выше к опухолевой модели.
NK-клетки формируют иммунологический синапс с клетками-мишенями, предназначенными для уничтожения, и секретируют цитотоксические гранулы, содержащие гранзимы и перфорин. Перфорин опосредует проникновение гранзимов в клетки-мишени, что и приводит в конечном итоге к клеточной гибели [20]. В данной работе мы показали, что модифицированные NK-клетки Cyto-CAR-YT-Lact вызывали быструю гибель клеток-мишеней BrCCh4e-134, несущих целевой антиген к CAR. Таким образом, клетки BrCCh4e-134 были высокочувствительны к клеткам-эффекторам Cyto-CAR-YT-Lact in vitro, что дополнительно характеризует их как релевантную опухолевую модель для экспериментов c Cyto-CAR-YT-Lact-клетками in vivo.
В экспериментах по оценке антиметастатического потенциала доза вводимых NK-клеток составляла 3х106 клеток или 1,2х108 кл/кг и была приближена к эффективным дозам CAR-T-клеток, вводимых человеку (0,1-2,5х108 кл/кг] [21]. В предварительных экспериментах по поиску максимально переносимой дозы (данные не приводятся] было показано, что суммарная доза Cyto-CAR-YT-Lact-клеток — 1х107, введенная внутривенно здоровым мышам линии ICR, в течение 4 ч. не оказывала токсического действия в тестах на острую токсичность. Доза 1 х 107 клеток была приближена к максимально возможной дозе по параметрам вводимого объема препарата и плотности клеточной суспензии. Таким образом, используемая доза клеток Cyto-CAR-YT-Lact, была ориентирована на терапевтическую эффективность и отсутствие токсических эффектов. Полученные в работе результаты указывают на высокую антиметастатическую активность клеток Cyto-CAR-YT-Lact, поскольку даже однократное введение эффекторных клеток ингибировало образование метастазов на 100% на модели внутривенно введенных опухолевых клеток.
При оценке действия NK-клеток Cyto-CAR-YT-Lact на солидные опухоли в модели спонтанного метаста-зирования не удалось достигнуть противоопухолевого эффекта. Такой результат вполне объясним с учетом иммуносупрессирующего окружения в опухоли. Широко известен целый ряд факторов, угнетающе действующих на иммунокомпетентные клетки (в том числе на CAR-T/ NK-лимфоциты) при попадании их в солидные опухоли: гипоксия, нехватка глюкозы, присутствие TGF-beta, IDO и пр. Кроме того, само попадание лимфоцитов в солидные опухоли может быть осложнено наличием некротической капсулы и плотных слоев стромальных клеток [22]. Таким образом, при взаимодействии CYTO-CAR-YT-Lact-клеток с небольшими очагами метастазов, в которых указанные
факторы еще не выражены, происходит эффективная цитотоксическая реакция, приводящая к уничтожению метастаза, однако выраженного эффекта на крупный первичный очаг CYTO-CAR-YT-Lact-клетки не оказывают. Возможно, комбинация из модифицированных CAR-NK-клеток и других таргетных препаратов позволит достичь успехов в борьбе с метастазирующими формами рака, где таргетные препараты будут нацелены на подавление
ЛИТЕРАТУРА:
1. Кулемзин С.В., Кузнецова В.В., Мамонкин М. и др. Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae 2017; 9: 6-15. (Kulemzin S.V., Kuznetsova V.V., Mamonkin M. et al. Engineering Chimeric Antigen Receptors. Acta Naturae 2017; 9: 6-15).
2. Chiossone L., Dumas P.Y., Vienne M. et al. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nat. Rev. Immunol. 2018; 18: 671-88.
3. Lorenzo-Herrero S., Lopez-Soto A., Sordo-Bahamonde C. et al. NK сell-based immunotherapy in cancer metastasis. Cancers 2018; 11: 29.
4. Arabi F., Torabi-Rahvar M., Shariati A. et al. Antigenic targets of CAR T Cell Therapy. A retrospective view on clinical trials. Experimental Cell Research 2018; 369: 1-10.
5. Mannweiler S., Amersdorfer P., Trajanoski S. et al. Heterogeneity of Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) Expression in Prostate Carcinoma with Distant Metastasis. Pathol. Oncol. Res. 2009; 15: 167-72.
6. Hillerdal V., Essand M. Chimeric Antigen Receptor-Engineered T Cells for the Treatment of Metastatic Prostate Cancer. BioDrugs 2015; 29: 75-89.
7. Rehman A.U., Rahman M.U., Khan M.T. et al. The Landscape of Protein Tyrosine Phosphatase (Shp2) and Cancer. CPD 2019; 24: 3767-77.
8. Коваль О.А., Волкова О.Ю., Горчаков А.А. и др. Сравнительный анализ активности лактаптина, полученного в про- и эукариотических системах экспрессии. Вавиловский журнал генетики и селекции 2017; 21: 764-9. (Koval O.A., Volkova O.Y., Gorchakov A.A. et al. Comparative analysis of lactaptin activity when produced in bacterial or eukaryotic expression systems. Vavilov Journal of Genetics and Breeding 2017; 21: 764-9).
9. Субракова В.Г., Кулемзин С.В., Беловежец Т.Н. и др. Нокаут гена Shp-2 приводит к повышению CAR-опосредованной цитотоксич-ности NK-клеток линии YT. Вавиловский журнал генетики и селекции. В печати 2019. (Subrakova V.G., Kulemzin S.V., Belovezhets T.N. et al. Shp-2 gene knockout upregulates CAR-driven cytotoxicity of YT NK-cells. Vavilov Journal of Genetics and Breeding. In press 2019).
10. Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium Phosphate Transfec-tion. Current Protocols in Molecular Biology 2003; 63: 9.1.1-11.
11. O'Doherty U., Swiggard W.J., Malim M.H. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Spinoculation Enhances Infection through Virus Binding. Journal of Virology 2000; 74: 10074-80.
опухолевых узлов, а 1\1К-клетки — осуществлять надзор за очагами метастазирования.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, Соглашение № 075-15-20191246, Уникальный идентификатор проекта RFMEFI60417X0169.
12. Nushtaeva A.A., Karpushina A.A., Ermakov M.S. et al. Establishment of primary human breast cancer cell lines using "pulsed hypoxia" method and development of metastatic tumor model in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 2019; 19: 46.
13. Кулемзин С.В., Чикаев Н.А., Волкова О.Ю. и др. Модульная система лентивирусных векторов для работы с химерными антигенными рецепторами. Биоорганическая Химия 2017; 43: 124-32. (Kulemzin S.V., Chikaev N.A., Volkova O.Y. et al. Modular lentiviral vector system for chimeric antigen receptor design optimization. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2017; 43: 124-32).
14. Rosenbaum L. Tragedy, Perseverance, and Chance — The Story of CAR-T Therapy. N. Engl. J. Med. 2017; 377: 1313-5.
15. Shultz L.D., Lyons B.L., Burzenski L.M. et al. Human Lymphoid and Myeloid Cell Development in NOD/LtSz- scid IL2R у nul Mice Engrafted with Mobilized Human Hemopoietic Stem Cells. J. Immunol. 2005; 174: 6477-89.
16. Deng Z., Wu Y., Ma W. et al. Adoptive T-cell therapy of prostate cancer targeting the cancer stem cell antigen EpCAM. BMC Immunol. 2015; 16: 1.
17. Zhang Q., Zhang H., Ding J. et al. Combination Therapy with EpCAM-CAR-NK-92 Cells and Regorafenib against Human Colorectal Cancer Models. Journal of Immunology Research 2018; 2018: 1-11.
18. Bubendorf L., Schöpfer A., Wagner U. et al. Metastatic patterns of prostate cancer: An autopsy study of 1,589 patients. Human Pathology 2000; 31: 578-83.
19. Ren D., Yang Q., Dai Y. et al. Oncogenic miR-210-3p promotes prostate cancer cell EMT and bone metastasis via NF-kB signaling pathway. Mol. Cancer 2017; 16: 117.
20. Chowdhury D., Lieberman J. Death by a Thousand Cuts: Granzyme Pathways of Programmed Cell Death. Annu. Rev. Immunol. 2008; 26: 389-420.
21. Shah N.N., Fry T.J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2019; 16: 372-85.
22. Martinez M., Moon E.K. CAR T Cells for Solid Tumors: New Strategies for Finding, Infiltrating, and Surviving in the Tumor Microenvironment. Front. Immunol. 2019; 10: 128.
Поступила: 23.102019
